雒思龍，龍 淼

（沈陽工學(xué)院 生命工程學(xué)院，遼寧撫順113122）

奶牛乳房炎在世界各國都是影響乳品加工業(yè)的最為重要的疾病之一，多見于產(chǎn)后哺乳期的母牛，特別是泌乳期的奶牛更為多見。據(jù)統(tǒng)計，乳房炎占奶?？偘l(fā)病率的21%～23%，全球每年因乳房炎造成的的損失約為350億美元，其中，由于技術(shù)水平和養(yǎng)殖條件等多種因素的制約，我國因乳房炎造成的損失每月就有100億元。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最常見的致病菌之一，因其造成奶量下降，病乳廢棄，甚至由于乳區(qū)化膿、壞疽、萎縮以至永久失去泌乳能力，導(dǎo)致奶牛淘汰，每年因乳房炎而被淘汰的奶牛占總淘汰率的9%～10%，而且因為巨大醫(yī)療投入給奶牛產(chǎn)業(yè)帶來了具大經(jīng)濟(jì)損失［1－2］?？焖俑咝У脑\斷一直是直接影響對這類疾病進(jìn)行治療的一大難題。肉眼觀察乳汁和局部乳房變化可做出初步診斷，實驗室診斷法包括化學(xué)檢驗法、物理檢驗法和血漿中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法等。

細(xì)菌培養(yǎng)是目前鑒定引起乳房炎致病菌的最佳標(biāo)準(zhǔn)，但是這種方法具有明顯的局限性，獲得結(jié)果受到實驗周期和實驗成本的限制，并且在收集和處理樣品的過程中需要特殊處理。因此，選擇優(yōu)良的能夠容易地獲得結(jié)果并可替代細(xì)菌培養(yǎng)的方法是目前的研究方向。作為代替細(xì)菌培養(yǎng)方法的新的診斷方法，基于抗原－抗體反應(yīng)的免疫學(xué)診斷方法具有快速、靈敏、特異性高和便攜等優(yōu)勢，利用這些理想優(yōu)勢的免疫學(xué)診斷方法現(xiàn)已成為用于臨床實踐中的主要診斷方法，但是結(jié)合我國畜牧業(yè)現(xiàn)狀，尤其是在偏遠(yuǎn)牧區(qū)地方農(nóng)場，針對隱性乳房炎的免疫學(xué)診斷方法仍需大力全面落實推廣。

1 葡萄球菌引起的免疫應(yīng)答

葡萄球菌引起的乳房內(nèi)感染損害蓄乳池和乳管組織，以及乳腺組織內(nèi)部。細(xì)菌代謝釋放毒素和胞外蛋白進(jìn)而損害乳腺細(xì)胞，并將這種作用蔓延到鄰近組織。細(xì)菌的毒力基因抑制免疫系統(tǒng)，致病菌的持續(xù)作用導(dǎo)致乳腺細(xì)胞發(fā)生生化反應(yīng)，并形成生物膜促進(jìn)慢性感染。機(jī)體在先天性免疫和獲得性免疫的保護(hù)下，啟動在細(xì)胞表面或乳腺細(xì)胞內(nèi)的特定病原模式的識別受體，識別并結(jié)合病原相關(guān)分子模式的細(xì)菌因子［3］，發(fā)生抗原－抗體反應(yīng)，為機(jī)體抵御細(xì)菌再次入侵做好準(zhǔn)備。但是，乳腺上皮細(xì)胞由于感染金黃色葡萄球菌或暴露于脂磷壁酸中，而不能維持炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［4］，所以，除了識別受體之外，先天性免疫還依賴于生理生化屏障。致病菌一旦通過這些屏障，先天性免疫就會啟動由免疫細(xì)胞組分和急性期反應(yīng)蛋白組成的主動防御機(jī)制［5］。如果先天性免疫防御失敗，通過獲得性反應(yīng)激活所產(chǎn)生的免疫球蛋白和記憶性細(xì)胞，就用于識別特定的抗原決定簇抵御致病菌入侵。此外還有研究表明，在乳腺細(xì)胞內(nèi)灌注金黃色葡萄球菌兩周后會延遲抗體水平效價的增長，但抗體效價水平高于產(chǎn)后期感染并低于休乳期感染。

2 免疫學(xué)診斷

近年許多研究證實，免疫學(xué)檢測方法在傳染病的快速診斷，特別是在由細(xì)菌引起的疾病中的診斷［6－9］很有潛力。利用免疫學(xué)診斷的特異性和敏感性，免疫分析是基于抗原與抗體的特異性識別：特異性分析是測定抗體成分區(qū)分非目標(biāo)底物，主要是對基質(zhì)成分的活性測定［10］；敏感性檢測是測定底物的靈敏度?；诿庖咴淼臏y試是一種能夠檢測超低濃度抗體的檢測方法，如凝集反應(yīng)具有0.4g／mL～0.8g／mL抗體的敏感度并能直接得到陽性反應(yīng)；酶聯(lián)免疫吸附試驗和放射性免疫分析方法甚至能夠檢測到介于0.8mg／mL～8mg／mL抗體的更低濃度。

3 葡萄球菌診斷標(biāo)志物

金黃色葡萄球菌的免疫學(xué)診斷方法所面臨的主要難題就是鑒定致病菌的最佳抗原。研究已經(jīng)確定潛在的由葡萄球菌所引起乳房炎的血清學(xué)標(biāo)志物［11－12］，但是由于致病菌在牛體內(nèi)的遺傳變異率較高，而且菌株的多樣性也高［13］，以及致病機(jī)理較為復(fù)雜，金黃色葡萄球菌的多種毒力因子都有可能會影響免疫檢測結(jié)果。

A 蛋白是一種使用最為廣泛的生物標(biāo)記物，在金黃色葡萄球菌免疫診斷中作為獨(dú)有檢測蛋白。這種由金黃色葡萄球菌A 蛋白基因編碼的蛋白在細(xì)菌表面識別位點和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用［14］。由于在不同的?？苿游锛?xì)胞培養(yǎng)傳代中病原菌株的變異，致病菌的流行病學(xué)情況和基因表達(dá)變化均會影響測試的靈敏度和辨識度，因此需要尋找類似于A 蛋白的生物標(biāo)記物［13］。

熱穩(wěn)定核酸酶（校正基因）是另一種金黃色葡萄球菌在核酸和微生物防御及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的毒力因子。這種熱穩(wěn)定核酸酶能夠出現(xiàn)在所有的菌株中，這也是為什么其用于病原的分子診斷的原因。研究表明，校正基因能夠鑒別從其他具有完全特異性的凝固酶陽性的葡萄球菌，從而分離鑒定出金黃色葡萄球菌。然而，使用校正基因的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的檢測結(jié)果顯示的特異性（70%）較低，這很可能是由于整體蛋白的免疫機(jī)制的影響。但是利用校正基因的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）免疫測定的研究，具有得到測試高度特異性的特定金黃色葡萄球菌基因區(qū)域的優(yōu)點。

4 葡萄球菌感染的免疫學(xué)診斷方法

4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

研究人員為檢測從懷疑患有乳房炎的奶牛乳汁樣品中采集到的金黃色葡萄球菌或其他炎性因子，而研發(fā)出了不同類型的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試紙。其中一項最早的專利檢測方法是檢測金黃色葡萄球菌蛋白的特異性抗體分子量，范圍在18ku～26 ku之間。這項測試在20世紀(jì)90年代投放市場，作為細(xì)菌培養(yǎng)的替代方法。在酶聯(lián)免疫吸附試驗中利用單克隆抗體，使用單分散的固相磁性顆粒作為金黃色葡萄球菌的提取物，獲得了完全的靈敏度（100%）。當(dāng)整個蛋白能夠產(chǎn)生抗熱穩(wěn)定性核酸酶的抗體而用于包被到磁性顆粒時，測試性能顯著降低，這在檢測方法的發(fā)展中表明抗原選擇的重要性。夾心酶聯(lián)免疫吸附方法［15］用于專門檢測在受人工污染的牛奶中的金黃色葡萄球菌，同時可以用于診斷的由金黃色葡萄球菌所引起的乳房炎。這種檢測方法在整個細(xì)菌胞體根據(jù)不同特性使用兩種抗體，以得到更敏感的檢測，但是成本昂貴。

4.2 免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

為了減少食品樣品中的細(xì)菌的檢出限度，建立了專門結(jié)合到A 蛋白的免疫熒光探針。這項技術(shù)使用一個有熒光標(biāo)記的抗體，捕獲釋放到樣品中的金黃色葡萄球菌。通過熒光強(qiáng)度對金黃色葡萄球菌探針進(jìn)行收集和分析。探針檢測作用需要至少103CFU／mL；然而，這種檢測在一些情況下是不適用的，因為需要非常專業(yè)的設(shè)備、訓(xùn)練有素的實驗人員和高成本的測試費(fèi)用。

4.3 免疫凝集試驗

免疫凝集檢測方法采用乳膠或聚苯乙烯粒子包被在纖維蛋白原和（或）抗體上，當(dāng)這些分子接觸到存在于樣本中細(xì)菌時，他們形成絡(luò)合物并沉淀在試管底部。用于金黃色葡萄球菌檢測的幾種凝集試驗已經(jīng)成功用于人類疾病診斷，而且現(xiàn)已用于檢測從患病奶牛乳樣中提取的金黃色葡萄球菌。使用6種商品化的可用于針對患乳房炎的乳汁檢測的方法，對其測試性能進(jìn)行了評價：Staphylase試驗○R（胰蛋白胨）、Masta金黃色葡萄球菌檢測○R（支架診斷）、Staphyloslide乳膠試驗○R（流式細(xì)胞儀）、Staphytect Plus○R（胰蛋白胨）、干斑Staphytect Plus○R（胰蛋白胨）和標(biāo)記乳膠凝集試驗金黃色葡萄球菌Plus○R（梅里埃公司）。使用Masta金黃色葡萄球菌檢測○R取得了最好的效果，利用這一試驗取得了86%的敏感性和90%的特異性。然而，這些數(shù)值仍然低于人類菌株檢測的報道，很可能是由于?？苿游锖腿祟惥暝诙玖σ蜃颖磉_(dá)上的遺傳變異［13］。用在牛科動物上發(fā)現(xiàn)的抗體來攻擊特異性抗原可以提高測試性能。總體來看，免疫凝集檢測方法是一種快速（10 min～20min）、廉價（每個樣品約1美元）而且操作簡便的檢測方法。因此，這是一種在現(xiàn)場診斷由葡萄球菌引起的乳房炎的不錯選擇。

4.4 橫向?qū)恿髅庖叻治?/h3>

橫向?qū)恿髅庖叻治觯↙FA）也被稱為免疫層析試紙測試，是一種容易理解的行之有效的技術(shù)，快速而且不需要冷藏，并且能夠直接完成對奶牛乳房炎的診斷。這種方法基于免疫層析法，原理是在其中一個樣本通過毛細(xì)管的作用時結(jié)合并傳播抗體或特異抗原。這種檢測方法最初用于懷孕測試，并已發(fā)展成為一個常用的診斷測試平臺。一些基于橫向?qū)恿髅庖叻治龅纳唐坊瘻y試板成本范圍在每個樣品0.8美元～2美元，而且能在20min內(nèi)獲得結(jié)果。

從不同標(biāo)本中基于橫向?qū)恿髅庖叻治龅慕瘘S色葡萄球菌試驗已獲得專利［16－17］。用于檢測樣品和食品的原料的試紙中的金黃色葡萄球菌是利用純化多克隆抗蛋白A。橫向?qū)恿髅庖叻治鲞M(jìn)行金黃色葡萄球菌和非金黃色葡萄球菌菌株培養(yǎng)基中生長的初步測試，敏感性和特異性分別確定為100%和93%～100%。當(dāng)測試應(yīng)用于人工受污染的食物時，敏感性降至91.6%。這項技術(shù)也用于金黃色葡萄球菌的檢測。

4.5 免疫聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的免疫學(xué)檢測在金黃色葡萄球菌人工污染的食物樣本中得到了發(fā)展［18］。在免疫PCR 反應(yīng)技術(shù)中，細(xì)菌在樣本中由校正基因的前一個區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)捕獲擴(kuò)增得到的多克隆抗體，每一個物種的基因被標(biāo)記的引物擴(kuò)增，并且被抗體識別的擴(kuò)增被固定在硝酸纖維素膜上，這種技術(shù)被稱為微陣列免疫分析。這種方法用于以下與乳房炎相關(guān)病原體的鑒定，金黃色葡萄球菌、牛棒狀桿菌、牛支原體、無乳鏈球菌、壞乳鏈球菌和乳房鏈球菌［19］。樣本包括內(nèi)部聚集的聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增子混合物，結(jié)合與標(biāo)記在硝化纖維素墊基部各自的的特殊標(biāo)記抗體。上述的實驗具有高度特性，并可以在3h內(nèi)獲得結(jié)果。然而，這些類似于酶聯(lián)免疫吸附試驗和微生物的方法，樣品都需要在專門的實驗室中進(jìn)行處理。

目前已有不少關(guān)于應(yīng)用PCR 方法檢測金黃色葡萄球菌及其腸毒素成功的報道，與細(xì)菌的常規(guī)分離方法相比PCR 方法的敏感性高，而且與其他型葡萄球菌無交叉反應(yīng)。PCR 方法在金黃色葡萄球菌檢測中的應(yīng)用充分體現(xiàn)了其具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點，是準(zhǔn)確、快速檢測乳及乳制品中金黃色葡萄球菌的首選方法。唐吉思等人［20］利用牛乳中金黃色葡萄球菌毒素A 基因（SEA）的熒光反應(yīng)定性定量檢測，為快速檢測牛乳中的金黃色葡萄球菌提供了新的技術(shù)手段，其最低檢測濃度為49.5fg／μL，該方法具有較好的特異性和敏感性。同樣也有試驗利用金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc設(shè)計具有特異性的引物，建立牛乳中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其產(chǎn)毒菌株的快速檢測方法，與傳統(tǒng)分類學(xué)方法得到的結(jié)果相比具有100%的準(zhǔn)確度，并具有較高的特異性和敏感性。還有試驗利用金黃色葡萄球菌16S～23SrRNA 的特異性序列設(shè)計并合成引物，建立一種可以直接從牛乳中檢測金黃色葡萄球菌的PCR 快速檢測方法，同時優(yōu)化反應(yīng)條件，其最低檢測濃度為35ng／μL，并可在5h內(nèi)完成樣品的檢測，特異性高達(dá)100%。除此之外，利用產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素和金黃色葡萄球菌腸毒素A 基因序列，分別設(shè)計2對特異性引物，建立了牛乳中產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素和金黃色葡萄球菌腸毒素A 的雙重PCR 檢測方法，同時優(yōu)化反應(yīng)條件，試驗結(jié)果與細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢出的陽性樣本數(shù)基本保持一致，準(zhǔn)確率達(dá)到90%以上。

4.6 生物傳感器技術(shù)

一些生物傳感器已在包括牛奶在內(nèi)的人工污染的食物樣本中得到金黃色葡萄球菌的免疫診斷應(yīng)用。這項技術(shù)使用抗體標(biāo)記分子的方法，通過探測產(chǎn)生的信號發(fā)揮作用。雙抗體夾心法是利用酶聯(lián)免疫傳感器來檢測和量化用過氧化氫酶進(jìn)行金黃色葡萄球菌抗A 蛋白抗體的標(biāo)記。用于檢測的樣品由細(xì)菌培養(yǎng)及人工污染的食物組成，包括牛肉和牛奶。通過測量O2含量進(jìn)行了檢測和定量。雖然這種技術(shù)具有敏感性，但是為每個樣品的電氣檢測較為緩慢而且技術(shù)上有困難。此外，在含量測定上采用膜上包被抗體的方法，在玻璃容器中阻礙了自動化的進(jìn)程。這些類型的檢測方法均縮短了獲得結(jié)果的時間并傾向于自動化過程，但是相關(guān)成本和精密儀器的使用成為這一方法的主要困難。

4.7 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。20 世紀(jì)90年代初期，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理以及計算機(jī)技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的樣品檢測、生化分析過程實現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化的一種全新的微量分析技術(shù)，其效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍［21］。

韓旭等［22］全面綜述了PCR 方法、基因芯片和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在奶牛乳房炎主要病原菌診斷中的應(yīng)用。邢會杰等建立了奶牛乳房炎無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌5種主要致病菌的基因芯片檢測方法，結(jié)果顯示芯片檢測特異性高，檢測的靈敏度為103CFU／mL。特異性生物芯片技術(shù)作為一種新型的生物技術(shù)，是一個學(xué)科交叉性很強(qiáng)的研究領(lǐng)域，其巨大的潛力和誘人的商業(yè)前景是有目共睹的，但由于目前的一些技術(shù)難點還沒有完全攻破［23］，從而限制了市場的需求。

5 小結(jié)

綜上所述，一種具有速度快、靈敏度高、成本低和操作簡便的優(yōu)良特性的獸醫(yī)臨床診斷方法，是現(xiàn)如今疾病診斷的發(fā)展方向。隨著各類診斷方法的發(fā)展，已從血清學(xué)診斷方法到了免疫學(xué)診斷方法的新時代，具有獸醫(yī)臨床意義的疾病診斷方法在商品化時代有了新的進(jìn)展。與此同時，作為細(xì)菌培養(yǎng)的替代方法，一些免疫學(xué)診斷方法不僅能夠直接鑒定葡萄球菌性乳房炎的致病菌，而且可以用于金黃色葡萄球菌所引起的乳房炎的檢測。但是，這類檢測技術(shù)需要具有一定基礎(chǔ)儀器設(shè)施的實驗室和一定操作技能的實驗員，在實際生產(chǎn)推廣過程中還需解決一些問題。然而，通過培訓(xùn)一些技術(shù)人員或畜牧場主，讓他們基本掌握這類技術(shù)，提前做好預(yù)防或及時治療，可以大大降低這類疾病帶來的經(jīng)濟(jì)損失，還能反饋大量臨床試驗數(shù)據(jù)，更好地為改良這類技術(shù)打下基礎(chǔ)。還有報道稱，可以利用免疫學(xué)方法檢測隱性乳房炎，但是還需實際臨床推廣才能驗證。

目前為止，已有一些研究利用金黃色葡萄球菌表面蛋白原核表達(dá)的特異性，作為免疫檢測靶標(biāo)建立相應(yīng)免疫學(xué)診斷方法［24］。另外，一些研究表明，利用噬菌體改變微生態(tài)平衡條件，可以解決細(xì)菌耐藥性的問題，進(jìn)而改善甚至徹底擺脫這類疾病的困擾［25］。而且，金黃色葡萄球菌A 蛋白的生物標(biāo)記物也是近些年來的研究熱點。總之，利用免疫學(xué)原理結(jié)合我國畜牧業(yè)生產(chǎn)實際需求，這類診斷方法用于各類疾病診斷的研究還有很大上升空間，而且通過在臨床診斷的應(yīng)用還能夠不斷完善基層獸醫(yī)領(lǐng)域的建設(shè)，為我國疾病防控提供可靠的依據(jù)。

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