李夢(mèng)蕓，李光鋒,2，楊 華，黎子云，吳小平，饒力群

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

金柑DNA結(jié)合蛋白的分離及染色質(zhì)體外組裝研究

李夢(mèng)蕓1，李光鋒1,2，楊 華1，黎子云1，吳小平1，饒力群1

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

為了研究DNA與DNA結(jié)合蛋白的相互作用，以及無細(xì)胞的染色質(zhì)體外組裝過程，從金柑葉片中提取總DNA，利用微晶纖維素得到DNA-纖維素層析配體，經(jīng)DNA-纖維素層析分離得到DNA結(jié)合蛋白，再將純化的DNA和DNA結(jié)合蛋白在低鹽條件下按一定比例混合，并進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)表表明，該混合物產(chǎn)生絮狀沉淀，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)念珠狀的小黑圓點(diǎn)，因此推測(cè)DNA和DNA結(jié)合蛋白發(fā)生互作，可能形成核小體引起染色質(zhì)體外組裝。

金柑；DNA結(jié)合蛋白；纖維素層析；體外組裝

在真核生物細(xì)胞核中，染色質(zhì)是由DNA和組蛋白一起被壓縮成一個(gè)高度有序的結(jié)構(gòu)，以核小體為基本結(jié)構(gòu)單位。由146 bp的DNA 圍繞一個(gè)八聚體的組蛋白（兩分子的H2A-H2B二聚體，兩分子的H3和兩分子的H4）形成核小體的核心結(jié)構(gòu)，核小體之間由組蛋白H1與DNA結(jié)合，并經(jīng)過進(jìn)一步的折疊纏繞及自我組裝形成染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)[1-4]。然而，高度致密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)影響DNA的復(fù)制、重組、鏈裂解、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等[5-7]，調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)是真核基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵步驟。在染色體水平上研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用過程能有效地反映體內(nèi)蛋白質(zhì)調(diào)控基因表達(dá)的真實(shí)狀況。

序列特異性DNA結(jié)合蛋白（Sequence-specifc DNA binding proteins) 能與DNA上特定的靶位點(diǎn)相互作用，從而在基因的表達(dá)和DNA復(fù)制、重組等過程中進(jìn)行調(diào)控，與細(xì)胞周期中染色體的一系列變化相關(guān)，包括組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、單鏈結(jié)合蛋白、解鏈酶、DNA聚合酶以及RNA聚合酶等[8]。呂湘等[9]研究表明，DNA結(jié)合蛋白與DNA、組蛋白先形成復(fù)合物，再通過招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物，可引起染色質(zhì)重塑，而應(yīng)用不同的組裝因子也可將DNA模板組裝成適當(dāng)?shù)娜旧|(zhì)結(jié)構(gòu)[10]。

本研究通過提取真核細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白，與基因組DNA相互作用，建立起無細(xì)胞的染色質(zhì)體外組裝，以期為進(jìn)一步研究如何改變?nèi)旧w空間構(gòu)象和引起基因的激活或抑制轉(zhuǎn)錄提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材的處理

挑選長(zhǎng)勢(shì)相近的1年生金柑（Fortunella margarita (Lour.) Swingle），摘取葉片若干，保存于－80℃超低溫冰箱中，備用。

1.2 方法

1.2.1 金柑葉片蛋白質(zhì)的提取 用液氮將30 g金柑葉片研磨成粉末；加入100 mL蛋白質(zhì)提取液[20 mmol/L Hepes (pH值 7.5)，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 mol/ L NaCl，0.2 mmol/L EDTA，25%甘油，0.5 mmol/L DTT，0.2 mmol/L PMSF]，充分混勻；4℃條件下浸提2 h，12 000 r/min離心20 min；上清液即為金柑葉片蛋白質(zhì)溶液。

1.2.2 DNA-纖維素層析分離DNA結(jié)合蛋白 將層析管中裝入纖維素晶粉固定的雙鏈化DNA，先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡；再用5 mL金柑葉片蛋白質(zhì)溶液上柱，仍用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫；待洗凈雜質(zhì)后，改用1 mol/L NaCl溶液洗脫。按2 mL每管進(jìn)行收集，同時(shí)用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，直至流出液的吸光度回歸基線，將洗脫獲所得的DNA結(jié)合蛋白混合備用[11-12]。

1.2.3 蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳 蛋白質(zhì)樣品和DNA結(jié)合蛋白混合樣品均加入5倍樣品緩沖液中混勻，沸水浴5 min，離心并等量點(diǎn)樣，采用4%濃縮膠及12.5%分離膠進(jìn)行不連續(xù)垂直平板電泳，掃描拍照，使用PDQuest 1-D軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析處理。

1.2.4 DNA結(jié)合蛋白的酶解及質(zhì)譜鑒定 參照考王鴻麗[13]和廖翔[14]的研究方法進(jìn)行。

1.2.5 染色質(zhì)體外組裝 取1.2.2中經(jīng)1 mol/L NaCl洗脫收集得到的蛋白質(zhì)溶液1 mL，加入濃度OD260為10的金柑葉片DNA溶液50 μL，溫和混勻，4℃靜置3 h，再加入9 mL 0.01 mol/L的EDTA溶液，溫和混勻，4℃靜置，并觀察直至絮狀的沉淀出現(xiàn)，用雙蒸H2O分散少量沉淀并滴加到銅網(wǎng)上，待水分晾干后，使用投射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA-纖維素層析制備DNA結(jié)合蛋白

先用0.1 mol/L NaCl溶液洗滌雜蛋白，從第8管起出現(xiàn)紫外吸收峰，至第19管出現(xiàn)最大紫外吸收峰值，其后出現(xiàn)2個(gè)吸收峰，第48管后，其紫外吸光度低于0.001，持續(xù)洗脫到第100管，其紫外吸光度均低于0.001。再更換1 mol/L NaCl溶液洗脫DNA結(jié)合蛋白，從第107管起出現(xiàn)紫外吸收峰，至第113管出現(xiàn)第一個(gè)峰，此后出現(xiàn)幾個(gè)未分開的吸收峰，到第135管后紫外吸光度低于0.001，為確保DNA結(jié)合蛋白洗脫干凈，持續(xù)使用1 mol/L NaCl溶液洗脫至第170管，其紫外吸光度均低于0.001。將DNA結(jié)合蛋白和雜蛋白洗脫峰面積分別積分，其積分比約為1∶9（圖1）。

2.2 SDS-PAGE分析DNA結(jié)合蛋白

從圖2可以看出，經(jīng)過DNA-纖維素層析得到的DNA結(jié)合蛋白條帶明顯比總蛋白條帶要少，是因?yàn)榭偟鞍字幸恍┑拓S度的蛋白得到了富集，而大部分高豐度的蛋白得以去除，DNA結(jié)合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量基本上小于974 000，是以小分子量的蛋白為主。

2.3 DNA結(jié)合蛋白的質(zhì)譜鑒定

將DNA-纖維素層析獲得的蛋白質(zhì)樣品利用LCMS/MS分析，共獲得2 062個(gè)肽段的信息，經(jīng)檢索鑒定得到28個(gè)同源蛋白（表1）。這些蛋白包括組蛋白、磷酸激酶、RNA合成相關(guān)的蛋白及一些功能未知的蛋白質(zhì)等。

2.4 染色質(zhì)體外組裝

將金柑葉片的DNA與DNA結(jié)合蛋白在高鹽的條件下混合，通過10倍稀釋法使鹽濃度降低，在稀釋過程中發(fā)現(xiàn)溶液中逐漸出現(xiàn)絮狀沉淀，隨著絮狀沉淀增多，絮狀沉淀慢慢地靠攏聚集形成馬尾狀（圖3）。

挑取少量馬尾狀沉淀，用雙蒸H2O分散，再通過透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)沉淀物有如植物根系般，盤根錯(cuò)節(jié)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在某些主鏈上有許多的分支，而這些主鏈和分支均是由一些球狀體連接而成（見圖4）。

在染色質(zhì)體外組裝體系中，成分有DNA、蛋白質(zhì)以及無機(jī)鹽（以NaCl為主）。顯然，單獨(dú)的純的DNA或蛋白質(zhì)，亦或是無機(jī)鹽都不會(huì)在稀釋的過程中產(chǎn)生沉淀，因此，沉淀的出現(xiàn)極可能是DNA和DNA結(jié)合蛋白相互作用形成了DNA-DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物。據(jù)趙忠亮等[10]提出的4種體外染色質(zhì)組裝體系方法中，有一種為利用組蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)媒介物（如：鹽濃度透析、組蛋白結(jié)合蛋白等），形成組蛋白體系，此體系可產(chǎn)生規(guī)范的核小體，但是形成的核小體分布卻不規(guī)則。因此，圖4中如念珠狀的小黑圓點(diǎn)極可能是核小體，進(jìn)而推測(cè)DNA和DNA結(jié)合蛋白互作發(fā)生了染色質(zhì)體外組裝現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

所有在真核細(xì)胞中發(fā)生的如轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組以及修復(fù)等生命過程，都需要染色質(zhì)的參與。趙忠亮等[10]研究表明，高度包裝的染色質(zhì)是無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的，而在轉(zhuǎn)錄延伸的過程中，染色質(zhì)必須經(jīng)過解體才能完成轉(zhuǎn)錄，這就存在一個(gè)問題，即：蛋白質(zhì)是如何涉足解體后的染色質(zhì)的重新組裝？而最早研究體外染色質(zhì)的重新組裝是在生理?xiàng)l件下依賴爪蟾卵母細(xì)胞的提取物，這些提取物富含酸性蛋白、核質(zhì)蛋白以及組蛋白等，它們能有序地結(jié)合到DNA上，裝配成有一定空間距離的多核小體，進(jìn)而組裝成染色質(zhì)[15]。Monique Barat[12]的研究表明，利用DNA纖維素層析的DNA結(jié)合蛋白能與爪蟾卵母細(xì)胞的線粒體DNA在低鹽條件下按約1∶1的比例結(jié)合形成如念珠狀的核小體染色質(zhì)。

本研究中利用純化的基因組DNA和DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行了染色質(zhì)的體外組裝，結(jié)果表明二者可以發(fā)生相互作用，產(chǎn)生沉淀，通過電鏡觀察到類似念珠狀的核小體。這一方面說明能有效采用DNA-纖維素層析方法獲取得到DNA結(jié)合蛋白；另一方面也說明DNA與DNA結(jié)合蛋白也可以發(fā)生相互作用，組裝成類似分布不規(guī)則的核小體，仍需進(jìn)一步確認(rèn)染色質(zhì)是否重建?，F(xiàn)代技術(shù)能在染色質(zhì)包裝的核小體水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和延伸進(jìn)行相關(guān)的生化與分子方面的研究，若能構(gòu)建無細(xì)胞的染色質(zhì)組裝體系，這對(duì)于進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)調(diào)控基因的表達(dá)具有重要意義。

[1] Tremethick D J．Higher-order structures of chromatin: the elusive 30 nm fber [J]．Cell，2007， 128(4) ：651-654．

[2] Richmond T J，Davcy C A．The structure of DNA in the nucleosome core [J]．Nature，2003， 423(6936)：145-150．

[3] Li G，Reinberg D．Chromatin higher-order structures and gene regulation [J]. Curr Opin Genet Dev，201l，21(2)：175-186．

[4] Luger K，Dechassa M L，Tremethick D J．New insights into nucleosome and chromatin structure：an ordered state or a disordered affair [J]．Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(7)：436-447．

[5] 凱里M，斯梅爾ST．真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控[M]．北京：科學(xué)出版社，2002．

[6] Pabo C O，Sauer R T．Transcription factors:structural families and principles of DNA recognition [J]．Annu. Rev.Biochem，1992，61：1053-1095．

[7] David S Latchman．真核生物轉(zhuǎn)錄因子(注解版第5版)[M]．北京：科學(xué)出版社，2008. 42-51．

[8] Yang H，Li H，Rao L Q，et al．A method for enrichment of DNA-binding proteins based on solubility of DNA-protein complexes [J]．Protein & Peptide Letters，2012，19：1071-1075．

[9] 呂 湘，劉德培，梁植權(quán)．染色質(zhì)重塑復(fù)合物[J]．生命的化學(xué), 2001，21(2)：96- 99．

[10] 趙忠亮，趙吉成，代 輝，等．染色質(zhì)體外組裝相關(guān)蛋白的表達(dá)純化及組裝體系的建立[J]．醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41(1)：19-23．

[11] Yang H，Huang L，Chun G．The genomic DNA immobilization on

Separation of Kumquat DNA-Binding Proteins and Chromatin Assembly in Vvitro

LI Meng-yun1，LI Guang-feng1,2，YANG Hua1，LI Zi-yun1，WU Xiao-ping1，RAO Li-qun1

（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Food and Drug Vocational College, Changsha 410208, PRC）

In order to study the interaction between DNA and DNA-binding proteins, an acellular system of chromatin assembly in vitro was established. The total DNA of kumquat leaves were extracted, the DNA-cellulose chromatography ligand was obtained with the microcrystalline cellulose, and then DNA-binding proteins were isolated through the DNA- cellulose chromatography. Finally, the purifed DNA and DNA-binding proteins were mixed at a certain proportion under low salt conditions and then observed with electron microscopy. The results showed that the mixture produced flocculent precipitates, and beaded little black dots were found out by the electron microscopy. It indicated that DNA and DNA-binding proteins had interactions, which might lead to the formation of nucleosomes and cause chromatin assembly in vitro.

kumquat; DNA-binding protein; cellulose chromatography; assembly in vitro

S666

A

1006-060X（2015）08-0004-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.002

2015-06-25

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31200963)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（No.13B046）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2009NK3096）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（No.13C576）

李夢(mèng)蕓（1988-），女，湖南雙峰縣人，碩士研究生，研究方向：植物抗逆生物化學(xué)；并列第一作者：李光鋒（1964-），男，湖南寧遠(yuǎn)縣人，博士研究生，研究方向：植物抗逆生物化學(xué)。

楊 華，饒力群