王珊珊王加啟高海娜閆素梅鄭 楠（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京100193；．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；3．農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京100193；4．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193；5．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070）

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腺苷酸活化蛋白激酶／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路介導(dǎo)能量和必需氨基酸調(diào)控乳蛋白合成

王珊珊1，2，3，4王加啟1，3，4，5高海娜1，3，4，5閆素梅2鄭 楠1，3，4?
（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京100193；2．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；3．農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京100193；4．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193；5．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070）

摘 要：乳蛋白合成是以必需氨基酸為底物的耗能過程。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是AMPK信號通路的重要分子；可通過感受細胞能量狀態(tài)的方式來維持能量平衡，從而為乳蛋白合成提供充足的能量。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是AMPK信號通路重要的下游靶點；必需氨基酸主要以mTOR介導(dǎo)的信號通路調(diào)控乳蛋白合成。本文主要綜述了能量和必需氨基酸通過AMPK／mTOR信號通路對乳蛋白合成調(diào)控的研究進展，旨在進一步闡明能量和必需氨基酸對乳蛋白合成調(diào)控的作用機理。

關(guān)鍵詞：腺苷酸活化蛋白激酶；雷帕霉素靶蛋白；必需氨基酸；能量；乳蛋白

乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白；其中酪蛋白約占其總量的80%，主要由αs－酪蛋白、β－酪蛋白、γ－酪蛋白和κ－酪蛋白組成。它不僅含有機體所需的全部必需氨基酸（essential amino acid，EAA），也可作為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。乳蛋白合成是一個以EAA為底物的耗能過程，所以充足的能量和EAA對于滿足泌乳需要是必需的。EAA已被越來越多的學(xué)者證明其不僅可作為蛋白質(zhì)合成的底物而且可作為信號分子通過mTOR信號通路調(diào)控乳蛋白合成；其穩(wěn)態(tài)可通過感知氨基酸平衡的氨基酸應(yīng)答（amino acid respones，AAR）通路來調(diào)控［1］。Proud等［2］、Burgos等［3］、Hardie等［4］通過常規(guī)小鼠灌注和奶牛乳腺上皮細胞為模型的試驗進一步證明能量物質(zhì)和EAA可作為信號分子通過腺苷酸活化蛋白激酶／結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AMPK／TSC／mTOR）信號通路作用于蛋白質(zhì)翻譯過程來調(diào)控乳蛋白合成。本文主要從能量和EAA這2個因子研究其通過AMPK／TSC／mTOR信號通路對乳蛋白合成調(diào)控的影響，旨在闡明能量和EAA對乳蛋白合成調(diào)控的作用機理。

1　AMPK／TSC／mTOR信號通路

腺苷酸活化的蛋白激酶（adenosine 5’?mono?phosphate?activated protein kinase，AMPK）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target rapamy?cin，mTOR）均屬絲氨酸／蘇氨酸磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族的成員［5］。

1．1 AMPK信號通路

AMPK復(fù)合物普遍存在于真核細胞中，可感受細胞內(nèi)能量和營養(yǎng)物質(zhì)狀態(tài)，在調(diào)節(jié)糖脂、蛋白質(zhì)和能量代謝中起著重要的作用［6－7］。AMPK為一種異源三聚體復(fù)合物，由催化亞單位α和調(diào)節(jié)亞單位β、γ組成。此前Xiao等［8］和Calabrese等［9］已分別闡明了人類的AMPK復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)α2β1γ1和α1β1γ1，二者均可通過磷酸化位于α亞單位N末端保守的蘇氨酸殘基（Thr172）和存在于腺苷一磷酸（AMP）中變構(gòu)因子A?76692，911來調(diào)控。而α、β亞單位以及含有AMP、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）結(jié)合位點的γ亞單位活性的調(diào)節(jié)主要由α亞單位的C末端負責(zé)［10］。

目前已經(jīng)確定AMPK上游磷酸化激酶分別為：1）轉(zhuǎn)化生長因子－β激活的激酶1（transfor?ming growth factor?β activated kinase1，TAK1）［5］；2）鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶激酶（calmodulin?de?pendent protein kinase kinases，CaMKKs）［11－13］；3）絲氨酸／蘇氨酸激酶11（serine／threonine kinase 11 or liver kinaose B1，LKB1）與2個亞基STE－20相關(guān)連接蛋白（STE?20 related adaptor protein，STRAD）和鼠蛋白－25（mouse protein?25，MO25）形成的復(fù)合體［14－15］。LKB1可通過激活A(yù)MPK磷酸化位點（Thr172）從而增強AMPK的活性［14－15］，此外LKB1也可激活A(yù)MPK循環(huán)相關(guān)的12個激酶同時調(diào)控其活性［16－18］。

結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物（tuberous sclerosis com?plex，TSC）和mTOR復(fù)合物蛋白依次是AMPK下游的重要靶點，二者可通過減緩蛋白質(zhì)合成和細胞生長的耗能方式來調(diào)控ATP水平［19］。

TSC包含2個互作蛋白TSC1和TSC2，二者形成了一個穩(wěn)定的異源二聚體復(fù)合物。TSC在AMPK和mTOR信號通路之間起著重要的調(diào)控作用。在果蠅的遺傳學(xué)和哺乳動物細胞的基因研究和生物學(xué)分析中確定，TSC2是mTOR復(fù)合物1 （mTOR complex 1，mTORC1）關(guān)鍵的上游抑制劑［19］。TSC下游的直接靶點是腦中表達豐富的Ras同源類似物（Ras homolog enriched in brain，Rheb），由于TSC1不具有明顯的催化活性所以TSC2作為特殊的鳥苷三磷酸（GTPase）激活GAP抑制Rheb，Rheb直接結(jié)合mTOR的催化區(qū)域從而誘導(dǎo)mTORC1構(gòu)象改變導(dǎo)致mTORC1激活并使下游靶點磷酸化［20］。

1．2 mTOR信號通路

mTOR以2種蛋白復(fù)合物的形式存在：對雷帕霉素敏感的mTORC1和對雷帕霉素不敏感的mTOR復(fù)合物2（mTOR complex 2，mTORC2）。mTORC1包含mTOR、mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（regu?latory?associated protein of mTOR，raptor）、哺乳動物致命SEC13蛋白8（mammalian ortholog of lethal with SEC13 protein 8，mLST8）和富含脯氨酸的Akt底物40（proline?rich Akt substrate of 40 ku，PRAS40）［21］。

mTOR信號通路涉及3種翻譯機制：1）mRNA編碼核糖體蛋白S6（ribosomal Protein S6，RPS6），促進RPS6磷酸化進而增強細胞合成蛋白質(zhì)的能力；2）mTOR激活后抑制真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation fac?tor 4E binding protein 1，4EBP1）磷酸化導(dǎo)致真核細胞翻譯起始因子4E（eukaryotic Initiation Factor 4E，eIF4E）釋放4EBP1，使eIF4E的表達量增高從而促進相關(guān)蛋白的翻譯；3）mTOR調(diào)控真核細胞延伸因子（eukaryotic translation elongation factor，eEF2）的磷酸化，阻止其與核糖體蛋白結(jié)合調(diào)控其生理學(xué)功能［22］。

2　能量對乳蛋白合成的調(diào)控

哺乳動物泌乳期需要大量的能量。葡萄糖不僅是機體能量的主要來源，還可為組織器官的新陳代謝提供能量；葡萄糖供應(yīng)量的增加可減少生糖氨基酸用于合成葡萄糖的量，剩余的葡萄糖到達乳腺后便可用于乳蛋白合成。在乳腺細胞內(nèi)，葡萄糖的供應(yīng)或補充乳蛋白合成所需的能量可提高乳蛋白產(chǎn)量［23］。

AMPK作為細胞能量的監(jiān)測器，起著維持細胞內(nèi)能量平衡進而調(diào)控乳蛋白合成的作用［24－27］。腺苷酸激酶反應(yīng)（2ADP?ATP＋AMP）的進行可保持細胞內(nèi)的能量平衡。Gowans等［28］指出細胞內(nèi)ADP／ATP的上升經(jīng)常伴隨著AMP／ATP更大程度的升高，表明AMP在整個反應(yīng)中起著非常重要的作用。AMP／ATP可通過AMPK來調(diào)控，當(dāng)AMPK感受能量不足時即開啟生成ATP的代謝途徑；能量充足時，ATP即可轉(zhuǎn)化為ADP促進乳蛋白生成。前人研究證明AMPK不僅可以直接磷酸化其下游靶點TSC2還可磷酸化raptor［16，29］，而且在營養(yǎng)物質(zhì)不足時，AMPK可促進mTORC1從溶酶體上分離下來［30］，由此誘導(dǎo)抑制mTORC1活性，這樣便可減少細胞內(nèi)合成代謝，使細胞分裂增殖停止從而減少ATP的消耗，維持能量平衡。

在奶牛體外試驗中，Toerien等［31］試驗發(fā)現(xiàn)，通過給泌乳奶牛瘤胃灌注葡萄糖可提高乳蛋白產(chǎn)量而S6K1磷酸化水平無明顯變化。但Rius等［32］通過瘤胃灌注淀粉得出，乳蛋白合成率增加的同時也伴隨著mTOR和RPS6的磷酸化作用的增加。對于二者試驗結(jié)果差異的原因可能是試驗動物基礎(chǔ)飼糧的差別或額外添加葡萄糖或淀粉的水平不足以影響AMPK／TSC／mTOR信號通路。近年來，Burgos等［33］以奶牛乳腺腺泡為模型，向其添加12 mmol／L葡萄糖和12 mmol／L乙酸的混合物并未影響乳蛋白合成率，S6K1和4EBP1的磷酸化水平也沒有顯著變化。Burgos等［34］而后又通過向牛乳腺上皮細胞中額外添加10 mmol／L的2－脫氧葡萄糖的試驗證實AMPK的激活可抑制mTORC1的活性，降低S6K1和4EBP1的磷酸化水平最終降低乳蛋白合成率，維持能量平衡。Appuhamy等［35］發(fā)現(xiàn)除葡萄糖外，當(dāng)額外添加足夠高水平的EAA時，EAA也可作為乳腺細胞的能源物質(zhì)。所以能量載體物質(zhì)對信號通路的影響是通過自身的調(diào)節(jié)作用還是刺激機體產(chǎn)生其他物質(zhì)引起通路的改變，目前尚不清楚需要進一步研究。

3　EAA對乳蛋白合成的調(diào)控

在哺乳期，奶牛乳腺組織可以合成和分泌大量蛋白質(zhì)［36］。乳腺組織從血液中獲取的EAA不僅可作為前體物質(zhì)有效被利用，還可作為信號蛋白激活信號通路［37－38］。乳蛋白合成率與乳腺從血液中攝取EAA的量和mRNA的翻譯效率有關(guān)［22，39］。因此，研究EAA的利用以及其對乳蛋白合成過程的調(diào)控機理是重要的。

對哺乳動物細胞來說，mTORC1激活促進蛋白質(zhì)合成代謝已經(jīng)得到了廣泛的研究。mTOR作為AMPK的下游靶點，負責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)尤其是氨基酸對信號通路的調(diào)控［40］。當(dāng)氨基酸充足時，機體可通過mTORC1信號通路感知細胞液和溶酶體中的氨基酸水平［41－42］；氨基酸不足時，感知氨基酸平衡的AAR信號通路即被激活［43］。細胞內(nèi)氨基酸含量可通過酵母轉(zhuǎn)錄激活因子（GCN2）來感知，GCN2可通過非轉(zhuǎn)運tRNA結(jié)合來激活進而激活A(yù)AR信號通路。近年來，已有學(xué)者通過試驗證明當(dāng)體外去除奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)基中的EAA時，mTOR下游靶點S6K1和4EBP1磷酸化作用下降抑制信號通路最終導(dǎo)致乳蛋白合成率降低［1］。氨基酸的缺乏會導(dǎo)致細胞內(nèi)空載tRNA增加，激活GCN2引發(fā)eEF2α（ser51）磷酸化進而減少蛋白質(zhì)的合成；與此同時在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor4，ATF4）表達量增高［44］。ATF4可通過誘導(dǎo)氨基酸轉(zhuǎn)運體和氨基酸合成酶基因表達的上調(diào)從而維持氨基酸的平衡。

Appuhamy等［45］試驗已經(jīng)證明，在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞中，EAA可通過mTOR信號通路調(diào)控mRNA翻譯的起始和延伸從而提高乳蛋白合成率。但是不論對于嚙齒類、哺乳類還是人的體內(nèi)和體外的研究均表明，氨基酸的種類和配比模式對于mTOR信號通路的調(diào)控作用均存在一定的差異［46－49］。

在所有EAA中，支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA）對乳蛋白合成的影響最為突出，Appuhany等［35］在奶牛乳腺上皮細胞和乳腺切片組織細胞的試驗中得出，亮氨酸和異亮氨酸可顯著通過作用于mTORC1從而磷酸化下游靶點S6K1和4EBP1，進而提高乳蛋白合成率。Prizant等［50］通過氨基酸單獨添加的試驗進一步驗證，BCAA可以通過增加S6K1的磷酸化水平來提高乳蛋白合成率，這與前人結(jié)果是一致的；同時Pri?zant的試驗也證明了并不是所有EAA對乳蛋白合成調(diào)控都起促進作用，賴氨酸、組氨酸、蘇氨酸的添加可以降低S6K1和mTOR的磷酸化從而使乳蛋白合成率下降；色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸的添加對信號蛋白磷酸化的影響不顯著。李喜燕等［51］向奶牛乳腺上皮細胞中添加0．4 mmol／L賴氨酸和1．2 mmol／L蛋氨酸（V∶V＝3∶1）混合液時乳腺上皮細胞總酪蛋白合成量最高達2．95 μg／mL，且均能極顯著地促進CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、mTOR和S6K基因的表達。Arrilola等［52］以乳腺上皮細胞為模型添加不同配比氨基酸的研究表明，隨著亮氨酸和蘇氨酸水平的增加，mTOR的磷酸化作用表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。但是目前對于EAA組合效應(yīng)對mTOR信號通路調(diào)控蛋白質(zhì)合成的報道較少需要更多的試驗來驗證。

4　能量和EAA互作對乳蛋白合成的調(diào)控

乳腺組織蛋白質(zhì)合成過程不僅需要氨基酸作為底物而且還需要充足的能量。能量和EAA互作對蛋白質(zhì)合成的影響在傳統(tǒng)營養(yǎng)和分子生物學(xué)層面均被已關(guān)注。

在傳統(tǒng)營養(yǎng)方面，Safayi等［53］通過向奶山羊靜脈灌注乙酸、葡萄糖和EAA的試驗得出泌乳早期作為能量物質(zhì)的乙酸可以彌補EAA供應(yīng)不足的影響；這就意味著乙酸（或β－羥丁酸）的供應(yīng)可以通過氧化過程生成ATP的方式來提高泌乳早期蛋白質(zhì)合成過程中氨基酸的利用率。但Burgos等［33］通過向奶牛乳腺腺泡細胞中單一或混合添加氨基酸、葡萄糖和乙酸的試驗得出氨基酸的單獨添加可以使乳蛋白合成率提高50%，而葡萄糖和乙酸的額外添加卻不會增強氨基酸的作用，也不會明顯增強S6K1和4EBP1的磷酸化水平。同樣Appuhamy等［35］以奶牛乳腺上皮細胞為模型的試驗表明與EAA單獨存在時相比葡萄糖或乙酸的額外添加并不能提高乳蛋白合成率，AMPK、mTOR、4EBP1和eEF2的磷酸化作用也不存在差異。在傳統(tǒng)營養(yǎng)和分子生物學(xué)層面的研究存在一定的差異可能是由于物種或額外添加營養(yǎng)物質(zhì)水平的不同所導(dǎo)致的?？傊?，對于能量和EAA互作對乳蛋白合成調(diào)控的影響還需進一步研究探討。

5　小 結(jié)

乳蛋白合成是一個以EAA為底物的耗能過程，葡萄糖、淀粉和乙酸的添加可提供翻譯過程中所需的能量。EAA作為底物和信號分子主要通過mTOR信號通路調(diào)控乳蛋白合成。研究能量和EAA單一或互作對乳蛋白合成調(diào)控的作用機理可提高乳腺對EAA的利用率，從而提高乳蛋白合成，進而減少氮源的浪費。AMPK對能量調(diào)控的研究目前主要集中在癌癥的治療和肌肉細胞蛋白質(zhì)的合成，在乳腺組織蛋白質(zhì)合成方面的研究還不是很成熟，本綜述有助于進一步開展對能量和EAA在乳腺組織蛋白質(zhì)合成和調(diào)控方面的研究。

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Regulation of Milk Protein Synthesis by Energy and Essential Amino Acids through Adenosine 5’?Monophosphate?Activated Protein Kinase／Mammalian Target Rapamycin Signaling Pathway

WANG Shanshan

1，2，3，4

WANG Jiaqi

1，3，4，5

GAO Haina

1，3，4，5

YAN Sumei

2

ZHENG Nan

1，3，4?

（責(zé)任編輯 陳 燕）

（1．Ministry of Agriculture?Milk Risk Assessment Laboratory，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2．College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；3．Ministry of Agriculture?Milk and Dairy Product Inspection Center，Beijing 100193，China；4．State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；5．College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

?Corresponding author，associate professor，E?mail：zhengnan＿1980＠126．com

Abstract：Milk protein synthesis is a process that consumes essential amino acids（EAA）and energy．Adeno?sine 5’?monophosphate?activated protein kinase（AMPK）is an important molecule in AMPK signaling path?way，which can maintain its energy balance through the way of feeling cellular energy state with the aim of providing sufficient energy for milk protein synthesis．Mammalian target rapamycin（mTOR）is an important downstream target in AMPK signaling pathway by that EAA mainly mediated milk protein synthesis．This re?view summarized regulatory roles of energy and EAA through AMPK／mTOR signaling pathway in process of milk protein synthesis．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（8）：2342?2348］

Key words：AMPK；mTOR；EAA；energy；milk protein

通信作者：?鄭 楠，副研究員，E?mail：zhengnan＿1980＠126．com

作者簡介：王珊珊（1990—），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E?mail：imauwss＠163．com

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2011CB100805）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（nycytx?04?01）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP?IAS12）

收稿日期：2015－03－17

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．08．005

文章編號：1006?267X（2015）08?2342?07

文獻標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S852．2