寧官保，牛藝儒，張 鼎，李宏全，馬海利，高榮琨，郝衛(wèi)芳，高文偉，趙宇軍，高詩敏，李桂蘭，李建慧，閆 芳，田文霞*

(1.山西農業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2.山西省長治市畜牧獸醫(yī)局，長治 046000；3.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；4.太原市動物疫病預防控制中心，太原 030024)

雞源大腸桿菌耐藥性分析及中藥對大腸桿菌耐藥性消除作用的研究

寧官保1，牛藝儒2，張 鼎3，李宏全1，馬海利1，高榮琨1，郝衛(wèi)芳4，高文偉1，趙宇軍1，高詩敏1，李桂蘭1，李建慧1，閆 芳1，田文霞1*

(1.山西農業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2.山西省長治市畜牧獸醫(yī)局，長治 046000；3.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；4.太原市動物疫病預防控制中心，太原 030024)

研究雞源大腸桿菌耐藥性及中藥對大腸桿菌耐藥性消除作用。選擇22種抗生素采用Kirby-Bauer法對山西省部分地區(qū)分離的20株致病性雞源大腸桿菌進行耐藥性檢測，對分離菌株進行質粒分析和耐藥質粒轉化試驗，并分析多種中藥對大腸桿菌耐藥性的消除作用。結果顯示，20株試驗菌對測試抗生素均存在不同程度的耐藥性，其中5耐及5耐以上的菌株占分離菌株的90%，試驗菌對青霉素耐藥率最高(90%)，其次為恩諾沙星(85%)，而對黏桿菌素和呋喃妥因的耐藥性最低；分離出12種質粒譜型，同一地區(qū)、同一雞場菌株的質粒圖譜相同或相似，不同地區(qū)菌株的質粒圖譜不同，僅有部分相同或相近的流行質粒共存；對其中5株菌株進行耐藥質粒的轉化試驗，發(fā)現同一質?？删幋a1個至數個耐藥性基因，不同質?？梢詳y帶相同的耐藥性基因；中藥單劑或合劑對大腸桿菌的耐藥性有一定的消除作用，其中黃芩的消除效果最好，中藥處理后部分菌株質粒圖譜無變化，只有黃連和雙黃連造成2條質粒帶丟失；對中藥提取物作用后的消除子進行藥敏試驗，結果發(fā)現大腸桿菌對環(huán)丙沙星等多種抗生素恢復了敏感性。研究結果提示聯合使用中藥治療雞源大腸桿菌病有顯著效果。

雞；大腸桿菌；耐藥；質粒；中藥

雞致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)是引起雞大腸桿菌病的病原體，主要導致病雞大腸桿菌性敗血癥、肉芽腫、心包炎、肝周炎、氣囊炎、腸炎、臍炎、全眼球炎和卵黃性腹膜炎等癥狀，并對雛雞和胚胎雞具有很高的致死性[1]。雞致病性大腸桿菌感染還可以作為雞禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎等病毒性疾病的繼發(fā)病出現，進一步加劇疾病發(fā)展，對雞生命健康和養(yǎng)雞產業(yè)構成巨大威脅[2]。伴隨著抗生素在家禽養(yǎng)殖上的過度使用或濫用，雞大腸桿菌對藥物的耐藥性不斷增加，病雞死亡率不斷提高。雞大腸桿菌耐藥性的產生涉及多種機制，其中大腸桿菌耐藥性的增加與自身耐藥質粒的產生有著密切的關系。而且細菌攜帶的耐藥質粒，尤其是R質粒，具有遺傳性，可以在不同菌株、菌種間進行傳遞，使得耐藥性細菌持續(xù)增加、流行。研究發(fā)現，某些中草藥能夠消除細菌的耐藥質粒，起到抑制細菌耐藥性的作用[3]，這為雞大腸桿菌耐藥性的消除提供新的思路。

作者從山西省不同地區(qū)患大腸桿菌病的病雞中分離出20株致病性大腸桿菌，并挑選22種抗生素，對這些大腸桿菌的耐藥性進行檢測。同時，試驗提取大腸桿菌質粒，比較各菌株質粒譜型，揭示耐藥質粒與大腸桿菌耐藥性的關系。在細菌耐藥性檢測結果基礎上，試驗還研究中藥單劑或合劑對大腸桿菌耐藥性的消除作用，為大腸桿菌耐藥性的消除探索新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

20株雞致病性大腸桿菌從山西省不同地區(qū)雞場送檢的病雞中分離。其中1～7號分離自臨汾市；8～10號分離自太原市；11～14號分離自太谷縣；15～16號分離自文水縣；17～20號分離自平遙縣。大腸桿菌質控菌株ATCC25922購自北京天壇藥物技術開發(fā)公司。質粒轉化使用的受體菌株DH5α購自Promega公司。

1.2 藥敏紙片

利福平(RA)、慶大霉素(GM)、黏桿菌素(PMB)、卡那霉素(K)、環(huán)丙沙星(CIP)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻肟(CTX)、氧氟沙星(OFL)、紅霉素(E)、諾氟沙星(NOR)、強力霉素(DO)、泰樂菌素(TL)、氟苯尼考(FF)、恩諾沙星(ENR)、氨芐西林(AM)、頭孢曲松鈉(CFX)、頭孢拉啶(CED)、呋喃妥因(NFT)、四環(huán)素(TE)、青霉素(P)、鏈霉素(S)、阿米卡星(AMK)等購自杭州天和藥物技術開發(fā)公司。

1.3 中藥

大黃、黃連、黃芩、金銀花、連翹、三黃湯和雙黃連口服液均購自太谷廣譽遠中藥房。

1.4 抗菌藥物

慶大霉素標準品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.5 菌株分離

雞大腸桿菌的分離、純化和鑒定參照文獻方法進行[4-5]。

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗參照臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的Kirby-Bauer法進行[6]。每次測定均以標準質控菌株ATCC25922作參照。結果判定按CLSI 2008年標準進行，級別分為耐藥(R)、中度敏感(M)和敏感(S)三種。每株菌株的藥敏試驗均做3次重復，耐藥率取三次重復試驗結果的平均值。

1.7 大腸桿菌質粒提取及譜型鑒定

SDS堿裂解法提取細菌質粒，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA，凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗結果，并按照文獻[7]的方法測定質粒相對分子質量。

1.8 大腸桿菌耐藥質粒的轉化試驗

試驗選取耐慶大霉素的5個菌株為研究對象，提取菌株質粒，導入用大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細菌，37 ℃環(huán)境LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h篩選轉化子。以大腸埃希菌ATCC25922為質控菌，進行原菌株與轉化子的耐藥性試驗，判斷耐藥性質粒的轉化效果。

1.9 中藥對耐藥菌耐藥性消除試驗

1.9.1 中藥亞抑菌質量濃度的選擇 藥敏試驗結果顯示，9號菌株耐藥譜最廣，達到19耐，所以中藥對大腸桿菌耐藥性消除試驗部分作者選擇以9號菌株為試驗對象。所得試驗結果用與9號菌株具有相同耐藥譜的另外兩株菌株進行驗證。調整9號株大腸桿菌濃度至1×104CFU·mL-1，各取100 μL加入到中草藥提取液起始質量濃度為200 mg·mL-1的2倍梯度稀釋的LB培養(yǎng)基中，一共9管，另設1管不加藥物的培養(yǎng)基作為對照。觀察細菌生長狀況，并判定各中藥提取物對受試菌的亞抑菌質量濃度?；瘜W消除劑SDS的亞抑菌質量濃度為100 μg·mL-1。1.9.2 中藥單劑或合劑對雞源大腸桿菌耐藥性消除試驗 取9號菌株液100 μL，接種于含亞抑菌質量濃度中藥的 LB肉湯中，分別培養(yǎng) 24、48和72 h。設SDS處理組為對照組。取100 μL菌液接種于GC板，待長出單個菌落后，隨機挑選500個菌落，以影印培養(yǎng)法，對應點種于含慶大霉素藥物質量濃度為100 μg·mL-1的平板和不含藥物的普通平板上，18 h后比較各組菌落生長狀況。在普通平板上生長而在抗生素平板上不生長的菌落即為消除子。根據消除菌落數與菌落總數，計算中藥處理后大腸桿菌耐藥性的消除率。消除試驗在每個時間點均做3次重復，最終消除率取3次重復試驗結果的平均值。1.9.3 消除子質粒鑒定和藥敏試驗 SDS堿裂解法提取消除子質粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定譜型與相對分子質量大小，并對中草藥作用過的消除子進行藥敏試驗。

2 結 果

2.1 藥敏試驗結果及多重耐藥性分析

20株大腸桿菌除了對黏桿菌素和呋喃妥因完全敏感外，對其他20種抗生素均有不同程度的耐藥性，其中最少的為3耐，最多的為19耐，5耐及5耐以上的菌株占分離菌株的90%，試驗菌未出現中介菌株(表1)。大腸桿菌耐藥抗生素按嚴重程度依次為青霉素、恩諾沙星、紅霉素、利福平、諾氟沙星、阿莫西林、泰樂菌素、四環(huán)素、強力霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氧氟沙星、鏈霉素、頭孢拉啶、頭孢曲松鈉、氟苯尼考、慶大霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、阿米卡星。其中青霉素、恩諾沙星、紅霉素、利福平、諾氟沙星、阿莫西林、泰樂菌素、四環(huán)素、強力霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氧氟沙星、鏈霉素的耐藥率都大于或等于50%(圖1)。

2.2 大腸桿菌耐藥菌株質粒圖譜分析

對分離得到的20株雞源大腸桿菌進行質粒檢測。結果顯示，分離菌株的質粒獲得率為100%，質粒的電泳條帶最少為1條，最多為6條，質粒為2.1×102～13.96×103bp(圖2)。不同菌株存在相同質粒DNA電泳條帶或相同大小質粒。對所得質粒進行圖譜分析，共得到12種質粒譜型(表2)。同一地區(qū)、同一雞場菌株的質粒圖譜相同或相似，不同地區(qū)菌株的質粒圖譜不同，但它們之間會有相同或相近的少量流行質粒存在。

2.3 大腸桿菌質粒轉化試驗結果

試驗對5株耐慶大霉素菌株(第7、8、9、10、16號)質粒進行轉化后在含有慶大霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其中2株(7、9號)有少量菌落生長。將這2株轉化子提取質粒與原供體菌質粒進行譜型比對，均具有相同帶型，將轉化子獲得質粒再進行DH5α重復轉化，均獲得一致質粒譜型(圖3)。轉化子與原菌株對22種抗生素敏感性測定結果顯示同一質?？删幋a1個至數個耐藥性基因，而不同質?？梢詳y帶相同或不同的耐藥性基因。

表1 20株雞源大腸桿菌耐藥譜

Table 1 Antimicrobial susceptibility of 20E.colistrains isolated from chicken

耐藥譜數Numbers耐藥譜Antimicrobialresistancespectrum耐藥菌株數Strainnumbers3RA/DO/E14ENR/TE/P/S15RA/DO/K/TL/GM16RA/ENR/NOR/AMX/E/P410RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/E/TE/P110TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/TE/P/S111DO/TL/CIP/ENR/NOR/AMX/AM/E/TE/P/S111RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/E/TE/P/S112RA/DO/TL/FF/CIP/AMX/AM/CED/E/TE/P/S112RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AME/TE/P114RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CTX/CED/CFX/TE/P115RA/DO/TL/FF/ENR/NOR/AMX/AMCTX/CED/CFX/E/TE/P/S115RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CTX/CED/CFX/E/TE/P115DO/TL/FF/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CED/E/TE/P/S/GM119RA/DO/TL/FF/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CED/CFX/E/TE/P/S/AMK/GM/K3

圖1 20株雞源大腸桿菌耐藥率分析Fig.1 Resistance rate of E.coli(n=20)strains isolated from chicken

2.4 中藥對雞源大腸桿菌耐藥性消除作用

9號菌株用亞抑菌濃度的不同中藥處理，結果表明，各中藥提取物對大腸桿菌耐藥性均具有消除作用，且消除效率隨著處理時間的延長(24～72 h)持續(xù)上升(圖4)，其中三黃湯、雙黃連合劑對大腸桿菌耐藥性消除率高于其他中藥單劑量，而單劑中黃芩的消除效果最好。試驗同時對與9號菌株具有相同耐藥譜的另外兩株菌株(8號和10號)進行驗證，均得到一致結論。

2.5 消除子質粒鑒定和藥敏試驗

由圖5可知，9號菌株在5種中藥作用后質粒帶無變化，經黃連(4)和雙黃連(7)提取液作用后各丟失了2條質粒帶(6 670和210 bp)。對中草藥作用過的消除子進行藥敏試驗，結果發(fā)現，該菌株對多種抗生素恢復了敏感性，其中對CIP、ENR、OFL、NOR、AMX、AM、S、AMK、GM和K等均由耐藥轉變?yōu)槊舾小?/p>

M.DL15000相對分子質量標準；1～20.大腸桿菌質粒M.DL15000 marker；1-20.plasmid of E.coli strains圖2 20株雞源大腸桿菌質粒電泳圖譜Fig.2 Plasmid profile of 20 E.coli strains isolated from chicken

表2 20株雞源大腸桿菌質粒譜型

Table 2 Plasmid profiles ofE.coli(n=20)strains isolated from chicken

質粒譜型Plasmidtypes質粒含有的堿基數/kbPlasmidbases菌株數Numbers菌株來源SourceP15.901臨汾市P27.771文水縣P38.871太谷縣P47.911.934平遙縣P56.152.710.951臨汾市P66.152.181.101臨汾市P76.342.620.951臨汾市P812.936.341.111臨汾市P912.938.036.982臨汾市P1013.936.150.951文水縣P1113.9311.356.152.273太谷縣P1212.8310.186.672.711.680.213太原市

3 討 論

大腸桿菌的耐藥性受多種因素影響，不同地區(qū)大腸桿菌耐藥種類會有所不同，且在不同時期分離的菌株耐藥性也有較大差異[8-11]。所以對當地雞源大腸桿菌耐藥性和耐藥譜的調查，能在一定程度上反映當地抗生素使用情況，為雞大腸桿菌病的治療提供參考依據。本試驗調查了山西省雞源大腸桿菌對各類抗生素的耐藥情況，發(fā)現大腸桿菌對青霉素類、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗生素耐藥性均在50%以上，其中以青霉素類抗生素耐藥率最高；氨基糖苷類抗生素、硝基呋喃類抗生素和頭孢菌素類抗生素的耐藥率較低，而對硝基呋喃類抗生素全部敏感。這些調查結果可以為當地雞大腸桿菌病治療用藥選擇提供很好的依據。

面對雞源大腸桿菌抗生素耐藥性問題的日益嚴重，人們將注意力轉向利用中藥來抑制大腸桿菌的耐藥性。研究指出，一些中藥提取劑具有良好的抗菌活性，并且與抗生素聯合使用時可以增強抗生素的抗菌活性，起到聯合治療的效果[12]。中藥對大腸桿菌耐藥性的抑制與其對菌體內耐藥性質粒的清除有密切的關系。陳群等發(fā)現黃連對大腸桿菌R質粒具有明顯的消除作用，黃連作用24 h，大腸桿菌R質粒消除率為2.42%，48 h時，其消除率可提高為22.57%[13]。張寅晨等用連翹對導入含有Ampr基因質粒的大腸桿菌作用12 h，質粒DNA電泳檢測后發(fā)現連翹對大腸桿菌質粒具有顯著消除作用[14]。最近張文平等的研究發(fā)現，金銀花水浸液對大腸桿菌R質粒也有顯著的消除作用[15]。而目前還沒有關于黃芪、大黃對大腸桿菌耐藥性和質粒消除作用研究的報道。本試驗中，作者發(fā)現黃芩、大黃、金銀花、黃連、連翹等五種中藥單劑和三黃湯、雙黃連兩種方劑對雞源大腸桿菌耐藥性均表現出不同程度的消除效果，且中藥方劑對大腸桿菌耐藥性的消除率高于單味中藥。這一結論與其他研究結果相吻合[16]。質粒圖譜分析結果表明，只有黃連和雙黃連能引起大腸桿菌質粒譜型的改變，其他中藥作用后質粒帶均無變化。這提示各味中藥對大腸桿菌的抑制機制并不相同。黃連和雙黃連造成大腸桿菌6 670和210 bp兩條質粒帶消失，推測雞大腸桿菌攜帶6 670和210 bp的質粒介導了對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星等耐藥性的產生。黃連和雙黃連可以通過消除耐藥質?；虻霓k法提高對大腸桿菌耐藥性的清除率。黃芪、大黃、金銀花等中藥則可能通過其他途徑實現對大腸桿菌耐藥性的清除，這些途徑可能涉及整合子、轉座子、染色體等遺傳物質的改變[17]。

M.DL15000相對分子質量標準；1.DH5α；2.第9號菌株；3.第9號菌的轉化子；4.第7號菌；5.第7號菌的轉化子M.DL15000 marker；1.DH5α；2.No.9 plasmid of E.coli strains；3.No.9 plasmid after transformation；4.No.7 plasmid of E.coli strains；5.No.7 plasmid after transformation圖3 耐藥質粒轉化后電泳圖譜Fig.3 Profile of isolated plasmid after transformation

圖4 不同中藥對大腸桿菌耐藥性消除率Fig.4 The clearance rate of colony (%) different Chinese herb against resistant E.coli strains from chicken

M.DL15000相對分子質量標準；1.黃芩處理；2.大黃處理；3.金銀花處理；4.黃連處理；5.連翹處理；6.三黃湯處理；7.雙黃連處理M.DL15000 marker；1.Scutellaria baicalensis treatment；2.Rheum officinale treatment；3.Honeysuckle treatment；4.Coptis chinensis treatment；5. Fructus forsythiae treatment；6.Sanhuangtang treatment；7.Shuanghuanglian treatment圖5 中草藥提取物處理后大腸桿菌質粒電泳圖譜Fig.5 Profile of isolated plasmid after drug treatment

4 結 論

用中藥對雞大腸桿菌作用后進行藥敏試驗，大腸桿菌對多種抗生素恢復了敏感性。因此，聯合使用中藥可以提高抗生素對雞源大腸桿菌的殺滅效果，具有很好的推廣價值。

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(編輯 白永平)

Studies on the Drug Resistance of Chicken IsolatedEscherichiacoliand Role of Traditional Chinese Medicines in the Drug Resistance Elimination

NING Guan-bao1，NIU Yi-ru2，ZHANG Ding3，LI Hong-quan1，MA Hai-li1，GAO Rong-kun1，HAO Wei-fang4，GAO Wen-wei1，ZHAO Yu-jun1，GAO Shi-min1，LI Gui-lan1，LI Jian-hui1，YAN Fang1，TIAN Wen-xia1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.ChangzhiAnimalHusbandryandVeterinaryBureau，Changzhi046000，China； 3.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China； 4.TaiyuanCenterforDiseaseControlandPrevention，Taiyuan030024，China)

The aim of this study was to study the drug resistance of chicken isolatedEscherichiacoliand role of traditional chinese medicines in the drug resistance elimination.Twenty kinds ofE.coliisolated from chicken around Shanxi province were tested to determine the resistant rate to 22 kinds of antibiotic by Kirby-Bauer way，the plasmid analysis and transformation test were conducted.Based on the resistance test results to antibiotic，we also evaluated the elimination effects of several traditional Chinese medicine (TCM) extracts on the isolated chickenE.coli.The results showed that the percent ofE.coliresistant to above 5 kinds of antibiotics reached 90%.The isolatedE.coliexhibited the strongest resistant rate to Penicillin G (90%)，followed by Enrofloxacin (85%)，while exhibited the highest sensitivity to Colimycin and Furadantin.According to the plasmid analysis results，12 kinds of plasmid patterns in total were found.Plasmids collected from the near farms with each other were likely to have the similar patterns，while different types among diverse areas.The transformation test results showed that one plasmid could encode single or several resistance genes，and different plasmids could have same resistance gene as well.TCM extracts，especiallyScutellariabaicalensis，had significant elimination function to the drug resistantE.coli.Majority of the TCM treated plasmids maintain the same patterns，while two plasmids change their profiles after treating with coptis chinensis and shuanghuanglian，losing two DNA bind respectively.After all，TCM extract treatment recovered the susceptibility of chickenE.colito drugs，which support the permitted use of TCM on the chickenE.colidisease control.

chicken；Escherichiacoli；drug resistance；plasmid；traditional Chinese medicine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.019

2014-12-08

山西省自然科學基金(2014011028-1；2009011043-1)；山西省科技攻關項目(20130311027-3)；國家自然科學基金(31072179)

寧官保(1961-)，男，山西聞喜人，副教授，主要從事生物技術在動物傳染病學與免疫中的應用研究，E-mail：ningguanbao034@163.com

*通信作者：田文霞，E-mail：wenxiatian@126.com

S855.1;S852.612

A

0366-6964(2015)06-1018-08