王 芳 李曉旭 高 瑾 梁 倩

(1.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224,2.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

?

墨西哥鼠尾草揮發(fā)油的抗菌活性研究

王 芳1李曉旭2高 瑾1梁 倩1

(1.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224,2.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

采用抑菌圈法和抑制菌絲生長(zhǎng)速率法研究了墨西哥鼠尾草揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌5種細(xì)菌及可可葡萄座腔菌、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、多主棒孢霉和尖孢炭疽菌5種真菌的抑制作用。結(jié)果表明：鼠尾草揮發(fā)油對(duì)5種供試的細(xì)菌菌株均有不同程度的抑制作用，且其最低抑菌濃度(MIC)分別為8、8、4、8、8 mg/mL；對(duì)5種真菌也有不同程度的抑制作用，其中對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50值為0.879 mg/mL;其次是尖孢炭疽菌和腐皮鐮刀菌，EC50值分別為7.565和10.731 mg/mL。

墨西哥鼠尾草；揮發(fā)油；抗菌活性；細(xì)菌；真菌

揮發(fā)油(volatile)，又稱(chēng)為植物精油(essential oils)，是一類(lèi)存在于植物體內(nèi)、常溫可以揮發(fā)、可隨水蒸汽蒸餾、具有香味的揮發(fā)性油狀液體的總稱(chēng)[1]。一般植物精油主要用于制作香水和香精，但隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高及環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，植物精油的應(yīng)用范圍也日漸擴(kuò)大，其在食品添加劑、害蟲(chóng)防治、殺菌抗菌和防腐等方面的功能也日益受到人們的關(guān)注與重視[2-3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌譜，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、原核生物和昆蟲(chóng)等都具有一定的抑制和殺滅作用[4]，可作為一種有待開(kāi)發(fā)的新型殺菌物質(zhì)。

鼠尾草屬(Salvia)植物是一個(gè)重要的藥用植物類(lèi)群，全世界有900多種。我國(guó)鼠尾草植物品種資源豐富且分布廣泛，據(jù)《中國(guó)藥物志》記載有83種，其中藥用有30余種，分布于全國(guó)各地[5]。鼠尾草屬植物地上部分大多含精油，使大多數(shù)植物具有揮發(fā)性芳香氣味，其中很多種還具有抑菌、殺菌活性，如從鼠尾草屬植物南歐丹參(Salviasclarea)中提取的精油，不僅可制成膠囊劑治療胃腸脹氣、消化不良、咽炎、喉頭炎、口腔炎、舌炎和牙齦炎等[6]，還能顯著抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌引起的感染[7]。

墨西哥鼠尾草(Salvialeucantha)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬的一種多年生草本植物，原產(chǎn)于中南美洲地區(qū)，具有較強(qiáng)的耐熱、耐旱性，極少有病蟲(chóng)害發(fā)生[8]，在我國(guó)很多地方均有引種，但未見(jiàn)關(guān)于該植物化學(xué)成分抗菌活性方面的相關(guān)報(bào)道，因此本試驗(yàn)對(duì)該植物揮發(fā)油的抗菌活性進(jìn)行分析，為探索其天然抗菌活性成分、開(kāi)發(fā)天然藥物制劑提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)植物材料

墨西哥鼠尾草于2013年6月18日采自云南省昆明市金馬路路邊花壇，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院杜凡教授鑒定為唇形科鼠尾草屬墨西哥鼠尾草，陰干備用。

1.2 揮發(fā)油的提取

將墨西哥鼠尾草的地上部分樣品陰干，切成長(zhǎng)度0.5 cm左右的小段，放入2 000 mL的圓底燒瓶中，采用水蒸氣蒸餾法提取得到淺黃色透明油狀物，然后用0.2 μm的濾膜過(guò)濾，進(jìn)行物理殺菌后，密封于冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 揮發(fā)油的抑菌試驗(yàn)

1.3.1 供試菌種 供試細(xì)菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)均由西南林業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供。供試真菌可可葡萄座腔菌(Botryosphaeriarhodina)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)由西南林業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3.2 抑菌試驗(yàn)所用培養(yǎng)基 本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)[9]。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g 、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，去離子水1 000 mL，pH 調(diào)至7.4～7.6；馬鈴薯培養(yǎng)基為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL[0]。

1.3.3 抑細(xì)菌活性試驗(yàn) 抑菌圈法[10]：將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基溶化后，倒入培養(yǎng)皿，每皿加入約20 mL，待冷凝后涂布5種細(xì)菌菌懸液200 μL(菌懸液所含活菌量在106～107 CFU/mL[11])。取直徑6 mm的無(wú)菌濾紙片，在以石油醚為溶劑的鼠尾草揮發(fā)油(0.48 g/mL)中充分浸泡后，放在含菌平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

最低抑菌濃度(MIC)法[12]：以具有明顯抑菌圈的菌種為供試菌種進(jìn)行MIC值的測(cè)定。以石油醚為溶劑，對(duì)墨西哥鼠尾草揮發(fā)油樣品進(jìn)行二倍梯度稀釋(0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 g/mL)，取稀釋后的樣品1 mL，加入到滅菌的19 mL牛肉膏培養(yǎng)基中，混勻，制成含藥平板。待冷凝后涂布細(xì)菌菌懸液200 μL，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的樣品濃度作為供試揮發(fā)油樣品溶液的MIC值。

1.3.4 抑真菌活性試驗(yàn) 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[13]：取墨西哥鼠尾草揮發(fā)油樣品原液(濃度為480 mg/mL)進(jìn)行二倍梯度稀釋?zhuān)笕? mL，加入到19 mL已溶化好的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，制成含藥平板。待冷凝后，加入已制備好的供試植物病原真菌菌餅，菌餅的直徑為6 mm，28 ℃培養(yǎng)4 d，用十字交叉法測(cè)量各個(gè)菌落的直徑，用下式求出抑菌率：

D凈生長(zhǎng)=D測(cè)量-6

R抑菌=(D對(duì)照-D處理)/D對(duì)照×100%

式中：D凈生長(zhǎng)為菌落凈生長(zhǎng)直徑(mm);D測(cè)量為菌落測(cè)量直徑(mm)；R抑菌為抑菌率;D對(duì)照為對(duì)照菌落直徑；D處理為處理菌落的直徑。

真菌半抑菌濃度(EC50)的測(cè)定[14]：將抑菌效果好的菌種的抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值，相應(yīng)的抑菌濃度轉(zhuǎn)換為其對(duì)數(shù)形式，后以濃度對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，抑制率的幾率值(Y)為縱坐標(biāo)，作毒力曲線，得毒力方程和EC50值。以EC50作為衡量樣品,對(duì)不同植物病原真菌生長(zhǎng)抑制活性大小的指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑細(xì)菌活性

經(jīng)試驗(yàn)，墨西哥鼠尾草揮發(fā)油溶液對(duì)5種細(xì)菌菌株均有不同程度的抑制作用(表1)，在濃度為0.48 g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌5種供試細(xì)菌菌株的抑菌圈平均直徑分別為13.2、10.4、16.0、6.4 mm和9.1 mm；可見(jiàn)鼠尾草揮發(fā)油對(duì)5種供試細(xì)菌的的抑菌效果為普通變形桿菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌，其中對(duì)普通變形桿菌的抑菌圈直徑最大，說(shuō)明對(duì)普通變形桿菌的抑菌效果最好。以這些菌為供試菌株指示菌，測(cè)定得墨西哥鼠尾草揮發(fā)油的MIC值分別為8、8、4、8、8 mg/mL(表1)。

表1 墨西哥鼠尾草揮發(fā)油的抑細(xì)菌作用Tab.1 Anti-bacterial activitives ofessential oil from S. leucantha

2.2 抑真菌活性

對(duì)墨西哥鼠尾草揮發(fā)油的抑真菌活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度墨西哥鼠尾草揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌的抑制作Tab.2 Inhibition effect of essential oil from S. leucantha to 5 types of pathogenic fungi

從表2可以看出，鼠尾草揮發(fā)油對(duì)5種植物病原菌均具有不同程度的抑制作用，且其抑菌率基本隨藥液濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為24 mg/mL時(shí)，對(duì)5種植物病原真菌中的尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，抑菌率為72.97%；其次是腐皮鐮刀菌和尖孢炭疽菌，其抑菌率分別為63.65%和54.62%。

根據(jù)上述不同濃度揮發(fā)油的抑菌率大小，作毒力回歸曲線，得毒力方程，根據(jù)毒力方程計(jì)算其對(duì)各個(gè)真菌的EC50值，結(jié)果見(jiàn)表3。鼠尾草揮發(fā)油對(duì)5種植物病原真菌中的尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，其EC50為0.88 mg/mL;其次是腐皮鐮刀菌和尖孢炭疽菌，其EC50分別為10.73 mg/mL和7.57 mg/mL，對(duì)多主棒孢霉和可可葡萄座腔菌的抑菌活性相對(duì)較弱。此外，從毒力回歸曲線可以看出，墨西哥鼠尾草揮發(fā)油對(duì)植物病原菌的抗菌活性與其濃度呈正相關(guān)性，其對(duì)植物病原菌的毒力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。

表3 墨西哥鼠尾草揮發(fā)油對(duì)植物病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制的毒力測(cè)定結(jié)果Tab.3 Virulence of essential oil from S. leucantha on different pathogenic fungi

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)抑菌圈法和抑制菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定了墨西哥鼠尾草揮發(fā)油對(duì)5種供試細(xì)菌和5種供試真菌的的抑菌活性。結(jié)果顯示，墨西哥鼠尾草揮發(fā)油在同一濃度下，對(duì)細(xì)菌中普通變形桿菌的抑制效果最好，對(duì)真菌中尖孢鐮刀菌的抑制效果最好；但無(wú)論是對(duì)其他細(xì)菌還是真菌，鼠尾草揮發(fā)油溶液均具有不同程度的抑制作用，具有潛在的廣譜抗菌特點(diǎn)，對(duì)開(kāi)發(fā)天然抗菌新制劑具有很大潛力，是一種開(kāi)發(fā)利用價(jià)值很高的潛在抗菌資源。

植物揮發(fā)油具有獨(dú)特的組成和生物活性，但目前對(duì)于揮發(fā)油的研究主要集中在尋找廣泛的抗菌材料及其抗菌作用上，而對(duì)于其抗菌活性成分、抗菌作用機(jī)理及可應(yīng)用范圍研究的還不夠充分[15]。一般來(lái)說(shuō)，揮發(fā)油的組成成分、結(jié)構(gòu)及功能性基團(tuán)決定了其抗菌能力大小，其含有的萜類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)等化合物賦予了揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌能力[15]。高良姜揮發(fā)油中由于含有大量的香葉烯、萜品烯、莰烯、檸檬烯及芳樟醇、香茅醇和桉葉醇等物質(zhì)，對(duì)念珠菌(Candidaspp.)、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌和石膏樣毛癬菌(Trichophytonmentagrophyte)、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)等皮膚致病菌具有一定的抑制作用[16-17]。鼠尾草屬植物種類(lèi)繁多，分布廣泛，其功能也多樣，具有廣泛的生物活性，在采用現(xiàn)代科技方法的基礎(chǔ)上，隨著對(duì)該屬植物活性成分及其藥理作用研究的深入，該屬植物必將具有更廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)對(duì)鼠尾草屬中墨西哥鼠尾草揮發(fā)油的抗菌作用進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)油具有廣譜抗菌作用，但其抗菌作用，可能是揮發(fā)油中某種單體成分或多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，關(guān)于其具體的抑菌活性化合物的分離、鑒定，及各活性成分間可能存在的復(fù)雜的拮抗或者增效作用，有待于后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

[1] 胡林峰, 許明錄, 朱紅霞. 植物精油抑菌活性研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2011, 23(2):384-391.

[2] 張東峰. 植物精油的研究開(kāi)發(fā)新進(jìn)展[J]. 河北化工, 2008, 31(2):10-12.

[3] 王廣要, 周虎, 曾曉峰. 植物精油應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科技, 2006, 31(5):11-14.

[4] Kalemba D K A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils[J]. Current Medicinal Chemistry, 2003, 10(10):813-829.

[5] 王和英, 胡德禹, 薛偉,等. 貴州鼠尾草化學(xué)成分的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2011, 23(1):63-65.

[6] Hanes K R. Antidepressant effects of the herbSalviadivinorum: a case report.[J]. J Clin Psychopharmacol, 2001, 21(6):634-635.

[7] 屈英薇. 鼠尾草屬植物的化學(xué)成分及藥理活性[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, (6):701-702.

[8] 徐慧, 劉寶勇, 鐘漢冬. 4種鼠尾草的生物學(xué)特性及在武漢地區(qū)的應(yīng)用[J]. 中國(guó)園藝文摘, 2011, 27(2):72-73.

[9] 沈萍, 陳向東. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：高等教育出版社, 2013.

[10] 張佳, 王瑩, 張峰, 等. 濾紙片法測(cè)定黃花蒿提取物對(duì)霉菌的抑制活性[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 48(5):1153-1154.[11] 王芳,梁倩,宋曉梅,等. 粉花月見(jiàn)草粗提物抗菌活性的初步研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2014, 25(10):2339-2341.

[12] He F, Yang Y, Yang G, et al. Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide fromStreptomycesvirginiaH03 [J].Food Control, 2010, 21(9):1257-1262.

[13] 郭道森, 杜桂彩, 李麗, 等. 迷迭香酸對(duì)幾種植物病原真菌的抗菌活性[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2004, 31(4):72-73.

[14] 吳文君.植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)論[M]. 西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社, 1987.

[15] 易德瑋, 方俊, 蔣紅梅,等. 植物揮發(fā)油及其主要化學(xué)成分抗菌作用研究綜述[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008(23):358-359.

[16] 桂蜀華, 蔣東旭, 袁捷. 花椒、高良姜揮發(fā)油體外抗真菌活性研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2005, 12(8): 21-22.

[17] Jirovetz L, Buchbauer G, Shafi M P, et al. Analysis of the essential oils of the leaves, stems, rhizomes and roots of the medicinal plantAlpiniagalangafrom southern India.[J]. Acta Pharm, 2003 (2):73-81.

(責(zé)任編輯 曹 龍)

Chemical Constituents and Anti-microbial Activity of the Essential Oils fromSalvialeucantha

Wang Fang1, Li Xiaoxu2, Gao Jin1, Liang Qian1

(1.Key Laboratory of State Forestry Administration for Biodiversity Conservation in Southwest China, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224,China;2. College of Life & Environmental Science, Minzu University of China, Beijing 100081, China)

The inhibition zone method and hypha growth-inhibiting method were used to investigate the inhibition effects of essential oils from the aerial part ofSalvialeucanthawhich were extracted by steam distillation on the five types bacteria ofEscherichiacoli,Bacillussubtilis,Proteusvulgaris,StaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosaand the five types plant pathogenic fungi ofBotryosphaeriarhodina,Fusariumoxysporum,Fusariumsolani,CorynesporacassiicolaandColletotrichumacutatum. The results showed that the essential oils fromSalvialeucanthahad different anti-microbial activity to the five types of bacteria, and the minimum inhibitory concentration (MIC) were 8 mg/mL, 8 mg/mL, 4 mg/mL, 8 mg/mL and 8 mg/mL respectively; and also had different inhibition activity to the five species of fungi, which the best inhibitory effect onFusariumoxysporumwith the EC50value of 0.879 mg/mL, followed byColletotrichumacutatumandFusariumsolaniwith the EC50values of 7.565 mg/mL and 10.731 mg/mL respectively.

Salvialeucantha;essential oils; anti-microbial activity;bacteria;fungi

2015-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360003，31201572)資助。

梁倩(1975—)，女，博士，講師。研究方向：藥用植物研究。Email：liangqian533@163.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.05.017

S786

A

2095-1914(2015)05-0092-05

第1作者：王芳(1981—)，女，博士，講師。研究方向：資源微生物。Email：35445230@qq.com。