張鵬葛，盛 萍，任慧梅，安露莎，盧曉麗，王延蛟

(新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

觀察比較貝母類生物堿分布的3種切片方法

張鵬葛，盛 萍*，任慧梅，安露莎，盧曉麗，王延蛟

(新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：建立一種能更清楚有效地觀察貝母鱗莖中生物堿沉淀分布及含量的切片方法。方法：以新疆貝母為供試材料，利用石蠟切片法、徒手切片法及改良切片法制備植物鱗莖組織切片；切片經(jīng)改良碘化鉍鉀處理，并通過Mikroskop Primo Star X2005顯微鏡觀察和比較3種不同切片中生物堿沉淀分布。結(jié)果：改良切片法處理的切片中生物堿沉淀分布觀察清晰，可用于定性及定量分析，并且實驗過程中試劑對生物堿的影響較小，操作方法簡便、快速、有效。結(jié)論：貝母鱗莖生物堿的觀測適合采用改良切片法制片。

貝母；石蠟切片法；徒手切片法；改良切片法

石蠟切片法是以石蠟作為包埋劑，經(jīng)一系列處理制作永久裝片的方法，是觀察植物細(xì)胞最常用、最基本的一種方法[1]。其制作的一般流程為：取材、固定、脫水、透明、浸蠟和包埋、切片、粘片、染色、封片等九個環(huán)節(jié)[2]，并且各個環(huán)節(jié)互相制約，每一步驟對制片的質(zhì)量都有著極大的影響。徒手切片法是直接使用刀片將植物新鮮材料切成薄片的一種制片方法，操作方法簡便，快速[3]。近年，利用切片技術(shù)結(jié)合組織化學(xué)方法研究植物有效成分的分布及組織結(jié)構(gòu)多見報道[4-6]，但不同植物及植物不同部位具有不同有效成分及組織結(jié)構(gòu)，因而需要根據(jù)植物的組織結(jié)構(gòu)特點及研究目的選擇或創(chuàng)新相應(yīng)的制片方法。

貝母是一種常用中藥, 在我國有悠久的用藥歷史，來源于百合科(Liliaceae)貝母屬(FritillariaL.)多種植物的鱗莖，具有清熱潤肺，化痰止咳之功效[7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，貝母中的生物堿，是其止咳、化痰作用的主要有效成分[8]。近年，應(yīng)用切片技術(shù)對貝母中生物堿進行組織化學(xué)定位研究已見報道[9]，但由于貝母鱗莖組織結(jié)構(gòu)中富含大量淀粉粒，對其生物堿沉淀觀測中有很大影響，因此為了更清楚有效地觀察貝母藥材鱗莖中生物堿沉淀的分布和含量，本文結(jié)合貝母藥材鱗莖組織結(jié)構(gòu)特點采用一種改良切片法，并與傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)及徒手切片法進行比較，旨在探索出一種適于貝母鱗莖中生物堿沉淀觀測的切片方法。

1 儀器與材料

Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡，YD-202A輪轉(zhuǎn)式切片機。供試材料經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院盛萍教授鑒定為百合科(Liliaceae)植物新疆貝母(FritillariawalujewiiRegel)的干燥鱗莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 石蠟切片法

取材 — FA固定液(70%乙醇 ∶福爾馬林=18 ∶1, 真空抽氣30 min)固定24 h[9]— 脫水(依次70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇每級0.5～1.5 h)— 透明(1/2二甲苯+1/2乙醇2 h、純二甲苯30 min)— 透蠟(1/2二甲苯+1/2石蠟45 ℃過夜、打開瓶口60 ℃ 2 h、純石蠟2 h、純石蠟2 h)— 包埋 — 切片、貼片 — 展片 — 染色觀察。

2.1.2 徒手切片法

取材—軟化(蒸餾水中浸泡5 min)—徒手切片—濕毛筆將薄片放入含有蒸餾水培養(yǎng)皿中—挑選透明的薄片—染色觀察。

2.1.3 改良切片法

取材—軟化(1/2 50%乙醇+1/2甘油3～6 h，真空抽氣30 min)—冷凍4～8 h或過夜[10]— 切片機切片[11- 12](用胡蘿卜將供試材料夾在其中，一起放入切片機夾頭固定，切片)— 濕毛筆將薄片放入含有蒸餾水培養(yǎng)皿中漂洗2 min—將薄片放入FA固定液固定5 h—復(fù)水(50%乙醇、30%乙醇、蒸餾水每級1 min)—染色觀察。對照組處理，將新鮮材料用酒石酸酒精預(yù)處理24 h后，用同樣方法處理和觀察。

2.2 結(jié)果

2.2.1 3種切片的生物堿沉淀觀察

對新疆貝母鱗莖的3種切片進行生物堿沉淀反應(yīng)后，均可觀察到在新疆貝母鱗莖的薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁上含有較多黃色—深黃色生物堿沉淀，表皮細(xì)胞上有較少分布(低倍鏡下呈小黑點)；對照組各組織細(xì)胞中無生物堿沉淀(圖1:1-2)。石蠟切片的組織結(jié)構(gòu)很完整，切片厚薄均勻，但含有大量淀粉粒覆蓋在薄壁組織細(xì)胞中，滴加生物堿顯色劑后，對生物堿沉淀的觀測有一定影響(圖1:3-4)；徒手切片的組織結(jié)構(gòu)有部分破碎，切片厚薄不均，大量淀粉粒流失，并且生物堿沉淀隨染液也流失嚴(yán)重(圖1:5-6)；改良切片的組織結(jié)構(gòu)較完整，切片厚薄差異小，大量淀粉粒流失，視界清晰，但生物堿由于固定液作用，隨染液流失較少(圖1:7-8)。

2.2.2 3種切片方法比較

3種切片方法的比較如表1所示，從表中可以看出，3種方法各有優(yōu)缺點。石蠟切片對各組織結(jié)構(gòu)觀察很清楚且完整，但淀粉粒在薄壁組織細(xì)胞中分布較廣，對生物堿沉淀的觀測具有一定影響，適宜用于觀察貝母的組織結(jié)構(gòu)及其他化學(xué)成分的定位及定量分析。徒手切片操作簡單，化學(xué)試劑使用少，僅配合滴染就可以直觀的看到細(xì)胞的染色過程，不易造成生物堿化學(xué)成分的損失，但此種方法使貝母類生物堿沉淀隨染液流失比較嚴(yán)重，且切片厚度不能控制，對生物堿分布只能定性，不能定量。改良徒手切片的各組織結(jié)構(gòu)較完整，操作過程較簡單，尤其針對貝母類生物堿沉淀的觀察和測量，其試驗效果良好；并且切片厚度可以控制，對總生物堿即可以定位也可以定量分析。

圖1 新疆貝母鱗莖橫切面生物堿組織化學(xué)定位(40×)

E. 表皮；Pa. 薄壁組織；SG. 淀粉粒；P. 生物堿沉淀. 1-2.新疆貝母鱗莖對照組橫切面，示各組織細(xì)胞中無生物堿沉淀；3-4.新疆貝母鱗莖石蠟切片，示各組織細(xì)胞中生物堿沉淀分布；5-6.新疆貝母鱗莖徒手切片，示各組織細(xì)胞中生物堿沉淀分布；7-8.新疆貝母鱗莖改良切片，示各組織細(xì)胞中生物堿沉淀分布。

表1 3種切片方法比較

3 討 論

在細(xì)胞生物學(xué)和植物學(xué)研究中，切片制作的質(zhì)量非常重要，往往對實驗的進展及結(jié)果有直接影響。不同動植物及動植物不同部位具有不同組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，因而需要根據(jù)動植物的組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點結(jié)合實驗?zāi)康倪x擇或創(chuàng)新相應(yīng)的制片方法，使實驗結(jié)果更加完美。通過本實驗中3種切片技術(shù)結(jié)合組織化學(xué)方法對貝母類生物堿沉淀的觀測，結(jié)果顯示：3種切片方法均能觀察到植物的組織結(jié)構(gòu)和生物堿沉淀，但其清晰度，完整性及定量定性分析各有不同。徒手切片操作簡單，新鮮材料組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的天然色彩可以直接觀察，且操作過程使用化學(xué)試劑較少，對操作者傷害較小，但由于切片厚度無法控制，因此在組織化學(xué)中無法對有效成分進行定量分析[13]。石蠟切片可以得到完整的組織結(jié)構(gòu)，且切片厚度可以控制，可對供試材料進行定性及定量分析[14-15], 但操作過程繁瑣及使用化學(xué)試劑較多，對操作者和材料影響較大。近年，一些替代徒手切片的簡易機械制作研究已見報道[11-12]，根據(jù)其機械制作原理結(jié)合石蠟切片和徒手切片技術(shù)優(yōu)缺點進行分析，并針對貝母類生物堿沉淀觀測，改良出一種結(jié)合切片機的改良切片方法。

貝母鱗莖質(zhì)地較硬，生物堿為其有效成分，因此選擇材料需要體積較小或切成1.0 cm×0.5 cm方塊大小，不能使用含有酸的軟化劑[9]，蒸煮軟化法溫度過高對組織結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分有影響，為此軟化劑選用1/2 50%乙醇+1/2甘油，抽氣可以加速軟化劑浸入。根據(jù)文獻[10]，冰凍后切片更容易切制，并且軟化劑經(jīng)冷凍后在組織內(nèi)可以起到一定支撐作用。切制過程中，為得到完整切片因選擇鋒利的刀片及較大的切片厚度，并保持切面濕潤，切制的薄片在水中漂洗可以去除部分淀粉粒，降低淀粉粒對生物堿沉淀觀察的影響。薄片在固定液中固定數(shù)小時，可以減少組織化學(xué)顯色后生物堿沉淀隨染液流失，固定時間過短起不到效果，過長會造成薄片損壞。

按照以上步驟制片，結(jié)果顯示：組織結(jié)構(gòu)較完整且清晰，淀粉粒對生物堿沉淀的觀察影響較小，生物堿沉淀分布觀察清晰，可用于定量分析，并且實驗過程中試劑對生物堿的影響較小，操作方法簡便、快速、有效。該方法為今后能更清楚有效地觀察貝母類鱗莖中生物堿沉淀的切片技術(shù)提供一定的借鑒和參考。

因此，要制備一張高品質(zhì)的切片，首先要分析不同植物及植物不同部位具有的組織結(jié)構(gòu)特點，再結(jié)合研究目的，然后選擇或創(chuàng)新相應(yīng)的制片方法，不能按部就班。制備高水平的動植物切片需要長期摸索及創(chuàng)新，掌握好這項技術(shù)對今后動植物組織的研究具有重大的意義。

[1] 李貴全. 細(xì)胞學(xué)研究基礎(chǔ)[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2001.

[2] 李和平. 植物顯微技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009.

[3] 李巖, 王幼群. 徒手切片與植物細(xì)胞微管免疫熒光定位[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 1997, 7(4): 382-385.

[4] 劉世彪, 林如, 胡正海. 絞股藍人參皂苷的組織化學(xué)定位及其含量的變化[J]. 實驗生物學(xué)報, 2005, 38(1): 55-58.

[5] 李景原, 王太霞, 沈宗根, 等. 六種蘆薈葉的解剖結(jié)構(gòu)及其與蘆薈素含量的相關(guān)性[J]. 植物學(xué)報, 2003, 45(5): 597-600.

[6] 李金亭, 彭勵, 胡正海, 等. 牛膝根的結(jié)構(gòu)發(fā)育與三萜皂苷積累的關(guān)系[J]. 分子細(xì)胞生物學(xué)報, 2007, 40(2): 124-128.

[7] 國家藥典委員會. 中國藥典：一部[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2010: 132.

[8] 李萍, 季暉, 徐國鈞, 等. 貝母類中藥的鎮(zhèn)咳祛痰作用研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報, 1993, 24(6): 360-362.

[9] 楊楊, 姜虹, 傅華龍, 等. 野生和組培川貝母總生物堿含量的測定和定位研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報, 2008, 45(1): 209-213.

[10] 韓留福. 冰凍徒手切片[J]. 生物學(xué)通報, 2002, 37(6): 59.

[11] 岳麗紅. 簡易生物切片器[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2009, 34(6): 37.

[12] 李雪芬, 鐘俊杰. 替代徒手切片的簡易機械制作[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2007, 32(5): 34.

[13] 朱登峰, 唐冬英, 李明芳, 等. 觀察木質(zhì)部的3種切片方法比較[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, (7): 20-22.

[14] 王春燕, 黃秀燕. 適合植物組織原位雜交和原位PCR的切片制作[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2007, 13(7): 37-38.

[15] 呂洪飛, 羅文姬, 盛仙永, 等. 兩種石斛屬植物和小葉石仙桃生物堿的組織化學(xué)定位[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(11): 824-827.

Comparison among Three Sectioning Methods to Observe theDistribution of Alkaloid in Bulbus Fritillariae

Zhang Pengge, Sheng Ping*, Ren Huimei, An Lusha, Lu Xiaoli, Wang Yianjiao

(School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective: In order to explore and establish a kind of plant sectioning method which could observe the distribution and content of alkaloid in Bulbus Fritillariae more clearly and effectively. Methods:FritillariawalujewiiRegel was taken as material, and tissue biopsies of plant bulb were prepared by paraffin section method, free-hand section method and improved section method. Then, these sections were staining by bismuth potassium iodide. The distribution of alkaloid in these sections were observed and compared through Mikroskop Primo Star X2005 microscope. Result: The improved section method could clearly observe the distribution of alkaloid in the plant cell structure and quantitative analysis, reagents had a little influence on alkaloid in experimentation, and the operation is simple, fast and effective. Conclusion: The improved section method are more appropriate for observing the distribution of alkaloid in Bulbus Fritillariae.

Bulbus Fritillariae; paraffin section method; free-hand section method; improved section method

2014-11-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160544)。

張鵬葛(1991—)，男，在讀碩士研究生。研究方向：從事特色中藥資源質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。

*通訊作者：盛萍(1967—)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：主要從事特色中藥資源質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。E-mail: xjsphwy@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.007

R932

A

1006-9690(2015)03-0027-04