付寶慧　濮存海

江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校(徐州221116)

星點設計-效應面法在測定玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量的應用*

付寶慧濮存?！?/p>

江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校(徐州221116)

目的：采用星點設計-效應面法優(yōu)選玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量測定的色譜條件。方法：以乙腈與水的比例，蒸發(fā)室溫度和氮氣的流速為考察因素，以峰面積、分離度、對稱度為考察指標，進行總評歸一化，并進行多元線性回歸和二項式擬合，用效應面法選擇較佳工藝條件，并進行預測分析。結(jié)果：確定黃芪甲苷的色譜條件為乙腈-水33：67，蒸發(fā)室溫度為90 ℃，氮氣流速為1.4 SLM。結(jié)論：星點設計-效應面法優(yōu)選玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量測定的色譜條件，方法簡便，預測性良好。

玄七痛痹膠囊是治療類風濕性關節(jié)炎的有效制劑，2003年被列入國家科技部火炬計劃項目。該制劑由六味藥組成，黃芪為方中臣藥，具有增強免疫、抗疲勞、促進代謝等功用[1]。其活性成分主要為皂苷類，黃芪甲苷是其主要活性成分之一，該制劑主要通過測定黃芪甲苷的含量對成品質(zhì)量進行控制[2]。為了建立更準確的黃芪甲苷高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)含量測定方法，本文采用星點設計-效應面法對其色譜條件進行優(yōu)選。該方法是集數(shù)學和統(tǒng)計學于一體的效應面優(yōu)選法，有較強的實驗精確度，能夠建立較好的數(shù)學模型，還能考察各因素之間的相互作用[3]。本次研究旨在優(yōu)選黃芪甲苷含量測定色譜條件的同時，為探討該實驗設計法應用于優(yōu)選中藥含量測定時色譜條件的可行性提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀(日本島津，帶自動進樣器)；蒸發(fā)光散射檢測器(PL-ELS2100英國)；LC-Solution色譜工作站；Hypersil-ODS柱(4.6×250 mm，5 μm)；黃芪甲苷對照品(0781-9908，中國藥品生物制品檢定所)；玄七通痹膠囊(111201，111202，111203，自制)；乙腈為色譜純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件的優(yōu)選

2.1.1對照品溶液的制備：用甲醇制成每1 mL含0.2 mg黃芪甲苷的對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備：精密稱取玄七通痹膠囊內(nèi)容物約2 g，加甲醇提取4h，提取液蒸干，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次15 mL，合并正丁醇層，用氨試液洗滌兩次，正丁醇液蒸干，殘渣加水使溶解，用三氯甲烷萃取，揮去三氯甲烷，通過D101型大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，繼用40%乙醇洗脫，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干后用甲醇定容到一定濃度作為供試品溶液。

2.1.3星點設計：通過預試驗可知，確定流動相乙腈與水的比例、蒸發(fā)室溫度及其氮氣流速各最大值最小值后，每個因素設置5個水平，用代碼值±α、±1、±0來表示，α=1.732，因素水平見表1，實驗方案見表2。

表1　星點設計因素水平表

表2　星點試驗安排及效應值

注：實驗15～20用均值表示，因其是重復性試驗

2.1.4數(shù)據(jù)處理：將峰面積、分離度、對稱度均標準化為0～1之間的歸一值，各指標“歸一值”求算幾何平均數(shù)，得總評“歸一值”(OD)。公式如下：OD = (d1d2…dk)1/kk 為指標數(shù)，dmin = (Ymax -Yi )/ (Ymax -Ymin )。

2.1.5模型擬合與結(jié)果：采用design expert 7.1得到回歸方程，y=124.25-4.76A-3.11B+29.21C+0.13AB-1.66AC-7.83BC+0.03A2+0.01B2-0.57C2-9.26A2B+0.026A2C-3.26AB2(R2=0.9288，R2adj=0.8066，r=0.9637)。模型方差P<0.05，說明該模型具有顯著性。本實驗以此方程作為分析及預測的模型，得到如下的效應面三維圖。見圖1～3。從圖1可以看出，當?shù)獨饬魉僭黾拥?.65 SLM時，其對OD值增加的影響已不顯著，且如果氮氣流速繼續(xù)增加，OD值將降低；蒸發(fā)室溫度與氮氣流速呈負性相關，說明試驗中若要升高蒸發(fā)室的溫度，相應地也要降低氮氣的流速。從圖2可以看出，當溫度大于90 ℃時，隨著溫度的升高，總評歸一值OD就會相應的增大；當溫度小于90 ℃時，隨著溫度的降低，總評歸一值OD就會相應的增大。從圖3可以看出，當流動相乙腈增加到34.24時，OD值開始下降；AC呈負相關。從圖上可以直接讀取的較優(yōu)范圍為：A：乙腈32.65～34.24，B：90～120 ℃，C：1.38～1.65 SLM，最后預測出的最佳工藝為流動相乙腈-水(33∶67)，蒸發(fā)室溫度90 ℃，氮氣流速1.4 SLM。

2.2方法學考察

2.2.1線性關系考察：稱取黃芪甲苷對照品30 mg，精密稱定，置于15 mL量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，即得到每1 mL甲醇含2.08 mg黃芪甲苷的對照品溶液，作為母液，精密吸取母液2.5 mL3份，分別置于5mL、10mL、20 mL量瓶中，用甲醇定容，得1號、2號、3號溶液，另精密吸取母液1.25 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇定容，得4號溶液，另精密吸取4號溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，得5號溶液，20 μL進樣，數(shù)據(jù)見表3，標準曲線見圖4。結(jié)果表明：黃芪甲苷在1.3 μg～41.6 μg范圍內(nèi)，線性關系良好?；貧w方程為：y= 1.5657X+5.1267，r=0.999。

表3　繪制標準曲線的數(shù)據(jù)

2.2.2專屬性試驗：分別取對照品溶液、樣品溶液及陰性樣品(不含黃芪，按制法制備)，按上述色譜條件進行測定，色譜圖顯示樣品中黃芪甲苷的保留時間與對照品的相同，陰性無干擾。

2.2.3精密度試驗：精密吸取對照品溶液注入液相色譜儀，按優(yōu)選出的色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定，記錄峰面積，結(jié)果平均峰面積為5929806，RSD為1.65%。

2.2.4重復性試驗：取玄七通痹膠囊同一個批號(111201)的樣品6份各2g，精密稱定，照供試品溶液制備方法制備，即得。照上述色譜條件，精密吸取20μL注入色譜儀，連續(xù)進樣2次測定，計算黃芪甲苷的含量，結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為466.44 μg/g，RSD為1.51%。

2.2.5穩(wěn)定性試驗：取重復性試驗中的第1個樣品，每隔3h進樣1次，0h、3h、6h、9h、12h、15 h，共計進樣6次，測定其穩(wěn)定性。結(jié)果平均峰面積為4543510，RSD為1.94%。

2.2.6加樣回收試驗：取已知含量的玄七通痹膠囊(111201)1g，按相當于含黃芪甲苷的80%、100%、120%的量加入，每個濃度平行3份，制備加樣的樣品液，相同色譜條件測定，每份進2針，結(jié)果平均加樣回收率分別為101.69%、97.91%、100.4%，RSD分別為1.10%、0.53%、1.91%。

2.2.7藥材的含量測定：按2010年版《中國藥典》方法制備黃芪藥材供試品溶液，如上的色譜條件對3個批號的藥材進行測定，每個批號平行制備2份，進樣，每份進2針。結(jié)果藥材的平均含量為1.683 mg/g。

2.2.8樣品的含量測定：分別取3個批號的玄七通痹膠囊，按上述供試品溶液制備方法進行制備，每個批號平行制備2份，按確定好的色譜條件測定，進樣，每份2針，結(jié)果樣品的平均含量為344.71 μg/g。

2.2.9中間精密度試驗：取同一樣品，由3位不同分析人員在不同日期按供試品溶液制備法操作，每人制備2份，相同條件下測定(2號柱)，每份進2針，計算樣品含量，結(jié)果平均含量為362.50 μg/g，RSD為1.90%。

2.2.10耐用性試驗：取樣品測定中批號為111202的同一份供試品溶液分別在1、2、3號色譜柱上測定含量(2號:Hypersil C18，大連；3號:YWG C18，漢邦)，每個色譜柱上進2針，結(jié)果得平均含量為362.43 μg/g，RSD為1.39%。

3　討　論

星點設計是國外常用的實驗設計方法，近些年國內(nèi)也有用此法優(yōu)化處方或成型工藝的報道，但并未見采用此法優(yōu)選色譜條件的相關報道[4]。本實驗采用星點設計-效應面法優(yōu)選HPLC-ELSD測定黃芪甲苷的色譜條件，保證了試驗精度，分析了各因素之間的相互作用，并且試驗次數(shù)也較少，在模型建立上采用非線性數(shù)學模型擬合，復合相關系數(shù)較高，預測值更接近真實值，為該實驗設計法應用于優(yōu)選中藥含量測定的色譜條件的可行性提供了依據(jù)。根據(jù)藥材含量計算，樣品中黃芪甲苷的平均轉(zhuǎn)移率為61%，藥典規(guī)定黃芪藥材中黃芪甲苷的量不得低于0.4%，按此數(shù)據(jù)計算，玄七通痹膠囊樣品中黃芪甲苷含量應不低于110 μg/g。

[1]左軍,張文釗,胡曉陽,等.黃芪現(xiàn)代藥理及臨床研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2014,17(1):111-112．

[2]李小玲.黃芪多糖對壓力超負荷誘導的大鼠心肌營養(yǎng)素-1、血管緊張素Ⅱ表達的影響[J].陜西醫(yī)學雜志，2012,41(10):1284-1287．

[3]施昶,沈詩偲,黃海飛,等.星點設計-效應面優(yōu)化法在處方篩選和優(yōu)化中的應用[J].機電信息,2014,32(2):41-46．

[4]何鳳蘭.星點設計-效應面法優(yōu)化白芍提取工藝[J].海峽藥學,2014,19(8):23-25．

(收稿2015-01-22；修回2015-03-06)

Application of central composite design-response surface method for the determination of astragaloside content of Xuanqi Tongbi capsule

Jiangsu Province Xuzhou Pharmaceutical Vocational College(Xuzhou 221116)

Fu BaohuiPu Cunhai

Objective:Use central composite design-response surface method to prefer HPLC chromatographic conditions of astragaloside content from Xuanqi Tongbi capsule.Methods：Three factors were the acetonitrile,water ratio the temperature of evaporation room and the flow rate of nitrogen,to study the peak area,seperation and symmetry as indicators after overall normalization,multiple linear regression and binomial fitting with response surface method to choose the better process conditions,and predictive analysis.Results：The chromatographic conditions for the determination of astragaloside were the acetonitrile -water 33:67,evaporation room temperature was 90 ℃,the flow rate of nitrogen was 1.4 SLM.Conclusion： It shows that the optimum model is highly predictive.

Astragaloside@Central composite design-response surface method@Xuanqi Tongbi capsule

*國家科技部火炬計劃項目(2003EB020593)

△通訊作者：南京中山制藥有限公司(南京210012)

黃芪甲苷@星點設計-效應面法@玄七通痹膠囊

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.06.046