張 毅 方永軍 周 鋒 胡亞莉 柯尊華 周振國(guó) 羅 衛(wèi) 暢 濤

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦外科( 咸陽 712000)

丹參酮ⅡA對(duì)腦出血大鼠灶周Nestin、Neun表達(dá)的影響*

張 毅 方永軍 周 鋒 胡亞莉△柯尊華 周振國(guó) 羅 衛(wèi) 暢 濤

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦外科( 咸陽 712000)

目的:觀察丹參酮ⅡA對(duì)腦出血大鼠灶周Nestin、Neun陽性細(xì)胞數(shù)影響。方法: 78只Sprague Dawley大鼠被隨機(jī)分為4組，其中正常組6只，假手術(shù)組24只，對(duì)照組24只，治療組24只，治療組腹腔注射丹參酮ⅡA，立體定向儀自體血注入法制備大鼠腦出血模型，免疫組化染色觀察正常組及假手術(shù)組、對(duì)照組、治療組術(shù)后第3d、7d、14d、28d灶周Nestin、Neun的表達(dá)及神經(jīng)功能評(píng)分并進(jìn)行比較。結(jié)果:腦出血灶周Nestin陽性細(xì)胞數(shù)從造模后即增多，第7天時(shí)明顯增多，隨后持續(xù)升高，并于第14d時(shí)數(shù)量達(dá)到峰值，隨后逐漸減少，第28天時(shí)仍高于正常水平；治療組與對(duì)照組同期比較，在第7天 (P<0.05)及第14天 (P<0.01)差異顯著。Neun陽性細(xì)胞數(shù)在造模后3d即有明顯增多，至第7天時(shí)達(dá)高峰，此后逐漸下降，至第28天時(shí)仍高于正常水平；治療組與其他組同期比較，有明顯差異(P<0.01)。治療組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較對(duì)照組有明顯改善(P<0.05)。結(jié)論:丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)腦出血大鼠灶周內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化并改善神經(jīng)功能。

腦出血( Intracerebral hemorrhage，ICH)發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高，臨床治療腦出血的主要困難在于如何恢復(fù)神經(jīng)功能。丹參主要成分丹參酮ⅡA的臨床使用取得了良好的治療效果，對(duì)腦出血患者的神經(jīng)功能康復(fù)有明顯的促進(jìn)作用[1-2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，基底節(jié)腦出血大鼠病灶周圍可出現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[3]。然而這種狀態(tài)下內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力及對(duì)腦出血后神經(jīng)功能缺損的修復(fù)均有限。臨床使用有效的丹參酮ⅡA是否對(duì)腦出血病灶周圍內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有影響，目前尚鮮有研究，因此我們做了以下試驗(yàn)。

1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年健康雄性Sprague Dawley大鼠78只，鼠齡3～4月，體重250g～300g，由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑 腦立體定位儀(日本NARISHIGE SN-3型)，小型牙科鉆(韓國(guó)世新STRONG 204型)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)，兔抗Nestin多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗大鼠NeuN 單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 將78只SD大鼠隨機(jī)分為四組：正常組(6只)、治療組(24只)、對(duì)照組(24只)、假手術(shù)組(24只)。治療組在術(shù)后1d始腹腔注射5μg/mL丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液2mL,1d1次，直至處死；對(duì)照組在術(shù)后1d 始腹腔注射生理鹽水2mL，1d1次，直至處死；假手術(shù)組在術(shù)后1d始腹腔注射生理鹽水2mL，1d1次，直至處死。正常組于第7天全部處死，其余三組分別在術(shù)后第3、7、14、28天各處死6只動(dòng)物后取腦。

1.4 模型制備 大鼠腦出血?jiǎng)游锬Ｐ筒捎昧Ⅲw定向儀自體血注入法制備。稱重后以10%水合氯醛(0.3mL/100g)行腹腔麻醉，將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上，調(diào)整門齒托高度，保證大鼠前后囟在同一水平線上；龍膽紫標(biāo)出頭皮正中切口長(zhǎng)約1cm，常規(guī)消毒，充分暴露前囟，參照大鼠立體定位圖譜，在前囟前0.2mm，中線右旁開3mm，牙科鉆顱骨鉆孔；取非肝素抗凝的自體股動(dòng)脈血垂直進(jìn)針5.5mm至右側(cè)尾殼核區(qū)，2min內(nèi)勻速緩慢注入50μL，注血完畢后退出注射器，骨蠟封閉骨孔，依次縫合皮膚，敷料包扎。假手術(shù)組僅做穿刺，不注血，余同對(duì)照組。術(shù)后在 20℃～25℃恒溫條件下飼養(yǎng)大鼠，自由活動(dòng)并進(jìn)食水，墊料每3天更換1次。

1.5 神經(jīng)功能測(cè)定 造模后及處死前，參照 Bederson 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)術(shù)后大鼠進(jìn)行評(píng)分。以完全清醒后大鼠的行為學(xué)改變作為造模成功的依據(jù)。觀察大鼠運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡能力及生理反射的變化。正常為0分，總分4分，分值越高提示其神經(jīng)損害越嚴(yán)重。均選取1～4分作為成功模型，造模不成功者補(bǔ)充大鼠。

1.6 標(biāo)本的采集 用10%水合氯醛麻醉大鼠后，開胸經(jīng)左心室插管進(jìn)行灌注，先用37℃ 100 mL生理鹽水沖凈后，再用4%多聚甲醛灌注，待肢體變硬后取腦。

1.7 切片制作、免疫組化檢測(cè) 鼠腦標(biāo)本用4%多聚甲醛浸泡 4～6h，30%蔗糖溶液中過夜(4 ℃)至沉底，腦組織石蠟包埋切片，將大鼠腦組織以進(jìn)針處為中心，冠狀位連續(xù)切片，每片厚約 6μm，每隔5 張片取2張片，用防脫玻片直接貼附，室溫下晾干，-20℃下保存?zhèn)溆?。免疫組化檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。光鏡下采集圖像,用南京捷達(dá)JD-801圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)Nestin，NEU陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果 2.1 大鼠神經(jīng)功能測(cè)定 見表1、表2。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)Bederson評(píng)分(分

組 別n3d造模后處死前7d造模后處死前14d造模后處死前28d造模后處死前正常組60.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00假手術(shù)組240.60±0.210.50±0.220.67±0.210.33±0.210.67±0.210.17±0.170.67±0.210.10±0.10對(duì)照組242.83±0.212.80±0.172.83±0.172.33±0.213.00±0.262.33±0.213.00±0.261.67±0.26治療組243.00±0.012.17±0.412.83±0.171.67±0.523.17±0.311.33±0.212.83±0.170.33±0.52

表2 各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果(F,P)

2.2 各時(shí)間點(diǎn)腦出血大鼠灶周Nestin陽性細(xì)胞數(shù) 見表3。

表3 各時(shí)間點(diǎn)大鼠灶周Nestin陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)

注：治療組與假手術(shù)組同期相比， ◇P<0.05， ◆P<0.01；治療組與正常值比對(duì) □P<0.05；治療組與對(duì)照組同期對(duì)比▲P<0.05，△P<0.01；治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較P<0.01，假手術(shù)組、對(duì)照組內(nèi)比較P>0.05

2.3 各時(shí)間點(diǎn)腦出血大鼠灶周Neun陽性細(xì)胞數(shù) 見表4。

3 討 論 如何改善腦出血患者的神經(jīng)功能缺損，是長(zhǎng)期困擾臨床的一大難題，以往認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞不可再生，腦出血后神經(jīng)功能康復(fù)只能靠殘存神經(jīng)細(xì)胞代償。近年來大量研究顯示，在哺乳動(dòng)物胚胎期的大部分腦區(qū)和成年期的室管膜下層及海馬齒狀回的顆粒下區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells ，NSCs)。Nestin 免 疫 陽 性 結(jié) 構(gòu) 在 隔 - 斜 角 帶 復(fù) 合 體 、Meynert 基底核、室管膜區(qū)、室管膜下區(qū)、海馬齒狀回、 CA1 區(qū)、 CA3 區(qū)、視上核、正中隆起等多處均有分布[5]。

表4 各時(shí)間點(diǎn)大鼠灶周Neun陽性細(xì)胞數(shù) (個(gè)

注：治療組與假手術(shù)組同期相比，◇P<0.01；治療組與正常值比對(duì)◆P<0.01；治療組與對(duì)照組同期對(duì)比△P<0.01;治療組、假手術(shù)組、對(duì)照組內(nèi)比較P<0.01

正常情況下這些極少數(shù)的神經(jīng)干細(xì)胞處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，病理狀態(tài)或在白介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素等細(xì)胞因子的作用下可被激活，并在原位或異位增生后向傷灶趨化遷移并增殖分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，腦出血后，在細(xì)胞因子、黏附分子、激素及遞質(zhì)作用下， 出血灶及缺血半暗區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞可被激活并出現(xiàn)增殖分化[3]。然而這種狀態(tài)下內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力及對(duì)腦出血后神經(jīng)功能缺損的修復(fù)均有限。雷勛明等[6]應(yīng)用三七總皂甙觀察其對(duì)腦缺血新生鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增值分化的影響，實(shí)驗(yàn)表明治療組新生鼠海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)在3、7、14天較對(duì)照組明顯增加，提示三七總皂甙對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞有促進(jìn)增殖及分化作用，說明中藥及其有效成分對(duì)腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有誘導(dǎo)作用。

丹參及其有效成分如丹參酮等均對(duì)干細(xì)胞有誘導(dǎo)分化作用，能誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞等。文獻(xiàn)報(bào)道用丹參在體外誘導(dǎo)大鼠的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞90min 后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)了軸突或樹突樣突起，并且表達(dá)出了神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)志巢蛋白(Nestin) 和成熟神經(jīng)元的表面標(biāo)志神經(jīng)元特異性烯醇化酶( Neuron specific endolade ，NSE)[7]。李玉美等[8]選用丹參酮ⅡA作為誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞存活時(shí)間最長(zhǎng)，且NSE強(qiáng)表達(dá)，Nestin則為一過性的表達(dá)增加之后逐漸減少，且掃描電鏡也觀察到了神經(jīng)元樣細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)。由此可證實(shí)丹參酮ⅡA可在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。以上實(shí)驗(yàn)證明了丹參及其有效成分能在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。丹參酮ⅡA ( Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA) 是丹參的主要藥物成分，具有抗腫瘤作用、抗感染作用、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用、保護(hù)心肌及抗心律失常和改善微循環(huán)作用、調(diào)節(jié)和維持激素水平、調(diào)節(jié)組織修復(fù)和再生、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗衰老等作用。

本實(shí)驗(yàn)研究通過使用丹參酮ⅡA對(duì)腦出血大鼠灶周神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)增殖分化，比較Nestin、Neun陽性細(xì)胞數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)腦出血灶周Nestin陽性細(xì)胞數(shù)從造模后即增多，第7天時(shí)明顯增多，隨后持續(xù)升高，并于第14天時(shí)數(shù)量達(dá)到峰值，隨后逐漸減少，第28天時(shí)數(shù)量仍高于正常水平。治療組與對(duì)照組同期比較，在第7天及第14天差異顯著。Neun陽性細(xì)胞數(shù)在造模后3天即有明顯增多，至第7天時(shí)達(dá)高峰，此后逐漸下降，至第28天時(shí)仍高于正常水平。治療組與其他組同期比較，有明顯差異。而且治療組中大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較對(duì)照組有明顯改善，與臨床觀察相似。因此，丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)腦出血大鼠灶周神經(jīng)干細(xì)胞增殖并向神經(jīng)元分化。

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(收稿2015-07-12；修回2015-08-03)

Effects of tanshinone ⅡA to the expression of Nestin、Neun in perihematoma with intracerebral hemorrhage models of rats

Medicine (Xian yang 712000) Zhang Yi Fang Yongjun Zhou Feng et al

Neurosurgery Department of the Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese

Objective:To observe the effects of Tanshinone ⅡA to Nestin and Neun’s positive cells in perihematoma with intracerebral hemorrhage models of rats .Methods:78 Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups:normal group 6,sham-operated group 24,control group 24,treatment group 24,treatment group was given an intraperitoneal injection of Tanshinone ⅡA.Stereotaxic apparatus and infuse fresh quantitative autologous blood into rat’s brain was utilized to build up the ICH model.On 3d，7d，14d，and 28d after ICH,the rats were performed behavioral test,and the expression of Nestin and Neun’s positive cells around hematoma in ICH was analyzed by immunohistochemistry．Results:The Nestin’s positive cells started rising at the begining post operation,increased significantly at 7d,the peak appeared at 14d,then the number gradually decline,but there were still significant different compared with other groups at 28d,compared with control group, the expression of Nestin’s positive cells of treatment group were more obvious and early,especially at 7d (P<0.05)and 14d (P<0.01).The Neun’s positive cells started rising at the 3d ,the peak appeared at 7d,then dropped gradully,at 28d ,there were still higher compared with other groups.The expression of Neun’s positive cells of treatment group were more obvious(P<0.01).The rat’s neural functional recovery of treatment group was more apparent than the control group(P<0.05).Conclusion:Tanshinone ⅡA can activate endogenous neural stem cell proliferation and improve the neurological function.

Cerebral hemorrhage/ traditional Chinese medicine therapy Tanshinon ⅡA/therapeutic uses Animal experimentation Rats Nestin

*陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(自然科學(xué)專項(xiàng))( 11JK0697)

腦出血/中醫(yī)藥療法 丹參酮ⅡA/治療應(yīng)用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠 巢蛋白

R743.34

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.049

陜西省科技廳科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(自然基金) (2012JM4004)

△陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712000)