雷建林 楊 翠 李 芳 穆旭凱 車曉俠 李 紅

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(西安 710004)

夏天無醋炙工藝研究*

雷建林 楊 翠 李 芳△穆旭凱▲車曉俠 李 紅▲

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(西安 710004)

目的：優(yōu)選夏天無醋炙最佳炮制工藝，為闡明醋炙入肝增效理論的科學(xué)性提供實驗依據(jù)。方法：以高效液相色譜法測定夏天無及其炮制品中原阿片堿、鹽酸巴馬汀兩個藥效成分含量為衡量指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選夏天無炮制工藝。結(jié)果：加米醋量20%，浸潤夏天無藥材3h，中火130℃炒制5min為最佳炮制工藝。結(jié)論： 優(yōu)選的醋炙工藝穩(wěn)定可行，能夠較好地提高藥效成分含量，醋用量、浸潤時間、炒制溫度對夏天無中有效成分溶出均有顯著影響。

夏天無系罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens (Thunb.)Pers.的干燥塊莖，又名伏地延胡索，一粒金丹，是產(chǎn)自我國的著名民間藥材，中醫(yī)臨床用于中風(fēng)偏癱，跌撲損傷，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，坐骨神經(jīng)痛，風(fēng)濕麻痹，腰腿疼痛[]。

清代《本草綱目拾遺》中便有(一粒金丹)記載。《中國藥典》1995版一部就收載了該藥材,《中國藥典》2010版一部制定了含量測定方法。自70年代起，國內(nèi)外學(xué)者就對該藥的化學(xué)成分[2]、藥理活性[3]、生藥及產(chǎn)地情況做了系統(tǒng)的研究，并開發(fā)出了夏天無片劑、夏天無注射液及夏天無眼藥水等藥品，藥效已得到充分肯定，取得了很好的社會效益和經(jīng)濟價值。但經(jīng)查找未找到夏天無的炮制資料，僅2010 年版《中國藥典》規(guī)定夏天無藥材產(chǎn)地加工方法為春季或初夏出苗后采挖，除去莖、葉及須根，洗凈，干燥。2010 版藥典規(guī)定用法為夏天無6～12g研末分3次服。中醫(yī)臨床沿用生夏天無，醋炙可以增強止痛作用，用醋調(diào)末敷貼患處可增強鎮(zhèn)痛作用，因此本課題在中藥炮制基本理論指導(dǎo)下，采用醋炙法制備醋炮制樣品，利用高效液相色譜法分析有效成分，探索夏天無炮制的最佳方法，摸索醋夏天無用醋量與生物堿成分的溶出是否有相當(dāng)療效或優(yōu)于生品。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫Agilent科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠)，WHCL-350超聲波藥品處理機(濟寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司)，XS105 Dual Range 型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，抽濾儀器微孔濾膜(孔徑規(guī)格0.22μm)。

1.2 試 藥 原阿片堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110853-200201)、鹽酸巴馬汀對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號130702，純度≥99.0%)。乙腈(色譜純)、甲醇(分析純)、冰乙酸(西安化學(xué)試劑廠，含量≥99.0%)、水為超純水。夏天無[經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院藥物研究所王衛(wèi)峰主任藥師鑒定為罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens (Thunb.)Pers.的干燥塊莖，產(chǎn)地江西]，米醋(陜西寶雞岐山)。

2 方法與結(jié)果 2.1 含量測定 2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性:Kromasil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為三乙胺醋酸-乙腈(82∶18)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長原阿片堿為289nm，鹽酸巴馬汀為345nm，進樣量為10μL；柱溫為室溫，理論塔板數(shù)以原阿片堿和鹽酸巴馬汀峰計算均應(yīng)不低于3000，對稱因子fs的平均值在0.95～1.05之間；分離度R值大于1.5。

A.原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品；B.鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品；C.醋炙夏天無樣品；D.夏天無藥材對照樣品

1.原阿片堿； 2.鹽酸巴馬汀

圖1 對照品及樣品高效液相色譜圖

2.1.2夏天無藥材對照樣品溶液的制備：稱取夏天無原藥材20g，作為對照品，粉碎，精密稱定5.0g，加甲醇200mL溶解至250mL平底燒瓶中，加入沸石，回流提取2h，冷卻至室溫，搖勻，濾過得濾液，倒入蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得用于測定含量的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備:稱取醋炙夏天無藥材20g各9份，按照正交試驗方案如表4進行炮制，分別記錄為1～9號醋炙品，粉碎，分別精密稱定5.0g，加甲醇200mL倒入平底燒瓶中，加入沸石，置于加熱回流裝置中回流加熱2h，冷卻至室溫，搖勻，濾過得濾液，倒入蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得用于測定含量的供試品溶液。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取原阿片堿對照品10mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，加1%鹽酸溶液1mL使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，制成對照品溶液。另取鹽酸巴馬汀對照品10mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，制成對照品溶液。

2.2 方法學(xué)驗證 2.2.1 方法專屬性實驗:按照高效液相色譜法，分別取原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液、鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液、醋夏天無供試品溶液、夏天無對照品溶液自動進樣10μL，按“2.1.1”項下色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，各對照品色譜峰分離良好，供試品各成分的色譜峰與相鄰的色譜峰分離度符合要求，溶劑對測定無干擾，醋炙對其有效成分出峰位置沒有影響，對其含量有影響，原阿片堿的保留時間約19.5min，鹽酸巴馬汀保留時間約為50min。

2.2.2 線性關(guān)系考察:取原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密量取0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL,置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。另精取鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密量取0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，備用。設(shè)置為分別自動進樣10μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定原阿片堿、鹽酸巴馬汀峰面積(A)，并以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，分別以原阿片堿、鹽酸巴馬汀進樣濃度(C,μg)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程原阿片堿：Y=2118.1X-11.610，r=0.9999，鹽酸巴馬汀：Y=3268.6X+107.35，r=0.9999，表明原阿片堿、鹽酸巴馬汀在0.4μg-2.4μg范圍內(nèi)線性良好。

2.2.3 精密度實驗：分別精密量取對照品溶液10μL,按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)自動進樣10μL ，共6次，記錄各色譜圖，結(jié)果原阿片堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD分別為 0.045%、0.12% ，表明儀器的精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗:取同一批6號供試品溶液，分別于室溫條件下放置0，2，4，6，12，24h，按“2.1.1”項下色譜條件分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，原阿片堿RSD為0.98%，鹽酸巴馬汀RSD為0.060%，表明原阿片堿以及鹽酸巴馬汀在24h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測定的要求。

2.2.5 重復(fù)性實驗：精密稱取同一批按最佳工藝炮制的夏天無醋炙品2g，6份，按“2.1.3”項下條件制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定原阿片堿、鹽酸巴馬汀峰面積，求其平均含量，計算值分別為1.63%、1.06% ，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率實驗：取同一批已知含量的夏天無6份(原阿片堿含量0.034mg/g；鹽酸巴馬汀含量0.046mg/g)，各1.0g，精密稱定，分別精密加入一定量的原阿片堿和鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1.3”制備供試液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄原阿片堿、鹽酸巴馬汀峰面積，計算原阿片堿的平均回收率為98.48%，RSD=2.13%，巴馬汀的平均回收率為98.82%，1.19%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高，結(jié)果詳見表1、表2。

表1 原阿片堿回收率實驗(n=6)

2.3 樣品含量測定 精密稱取不同批號的9號夏天無供試品制備供試液1g，各3份，按“2.1.3”制備供試液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣10μL測定，求當(dāng)天平均值，計算夏天無中原阿片堿、鹽酸巴馬汀含量，結(jié)果詳見表3。

表3 樣品含量測定(n=3)

2.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇醋用量、炒制溫度及炒制時間為考察因素，稱取生夏天無9份，每份100g，以醋夏天無中原阿片堿、鹽酸巴馬汀含量為綜合評價指標(biāo)，采用L9( 34) 正交試驗優(yōu)選醋夏天無的炮制工藝。炮制品達到醋炙品的要求，為表面微灰黃色，有的可見焦斑，微有醋香氣。

表4 因素水平表

表5 正交設(shè)計方案及結(jié)果分析

表6 原阿片堿方差分析

注：F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99

表7 鹽酸巴馬汀方差分析

注：F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99

因為原阿片堿為鎮(zhèn)痛的主要有效成分，鹽酸巴馬汀藥理研究集中于心血管方面，所以本實驗以原阿片堿為主要因素，采用權(quán)重系數(shù)并參照表6、表7結(jié)果得出，影響各個指標(biāo)的主次關(guān)系依次為炮制溫度(D)>浸泡時間(A)>醋浸濃度(B)>炒制時間(C)，即炮制溫度影響最高，炒制時間影響最小，炮制溫度，浸潤時間以及醋浸潤濃度對考察指標(biāo)均有顯著性影響。由表6可知，6號夏天無中原阿片堿、鹽酸巴馬汀含量最高，故綜合兩因素，選定提取最佳組合為A2B3C1D2，即夏天無確定最佳醋炙工藝為：用20%含量的米醋浸潤夏天無原藥材3h，130℃炒制5min，晾干即得醋炙樣品。

3 討 論 3.1 炮制工藝的選擇 醋炙法是一類常見的中藥炮制方法[4]。醋性味酸苦微溫，入肝經(jīng)血分, 具有收斂、解毒、散瘀止痛的作用，還可以降低毒性，矯臭矯味、減少副作用等。醋炙品在這些理論指導(dǎo)下在臨床也得到廣泛應(yīng)用。因此我們利用醋炙法的優(yōu)點對夏天無進行炮制，采用傳統(tǒng)醋炙法中的拌制、悶潤等過程，使操作更省時、簡便，炒制后可使藥材質(zhì)地疏松、毛焦，易于粉碎成細(xì)粉或者微粉，有利于提高異喹啉類生物堿的溶出。實驗結(jié)果表明醋炙確實顯著提高了夏天無中原阿片堿和鹽酸巴馬汀的溶出率。

3.2 流動相的選擇 由于原阿片堿含量少，不能取用工藝研究中常用的浸膏得率等指標(biāo)，故實驗選取主要生物堿含量作為工藝指標(biāo)，在制備流動相的時候次序應(yīng)為少量純凈水，再加入三乙胺，隨后加入冰醋酸，加水定容，如果先加冰醋酸后加三乙胺，溶液則出現(xiàn)渾濁，不利于測定。

3.3 提取方法的選擇 參照《中國藥典》2010年版一部回流提取的方法，有效成分出峰清晰，雜質(zhì)峰對主要成分峰無干擾。

3.4 展 望 我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)夏天無具有一定的毒性，因此有必要對該藥材中的夏無寧堿與畢枯枯林等毒性成分[5]進行深入系統(tǒng)研究，以便于更安全的開發(fā)該藥材。目前，2010 版《中國藥典》僅對鹽酸巴馬汀及原阿片堿進行質(zhì)量控制，較為單一，應(yīng)在藥效及毒理研究的基礎(chǔ)上進一步制訂該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，制訂毒性成分上限，從而提高臨床用藥的安全性和合理性。

[1] 朱經(jīng)艷，孟兆青，丁 崗，等．夏天無的研究進展[J]．世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16(12)：2713-2719．

[2] 廖惠平，歐陽輝，黃陸強，等．夏天無的化學(xué)成分研究[J]．中草藥，2014，45(21)：3067-3070．

[3] 吳安明，桂 嬋，徐 蘭，等．夏天無提取物基本理化性質(zhì)研究[J]．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，24(1)：36-39．

[4] 周 瑞，郜玉鋼，臧 埔，等．炮制對中藥活性成分及功效的影響[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21(3)：209-212．

[5] 曾 崗，張 潔．高效液相色譜法測定夏天無膠囊中原阿片堿、鹽酸巴馬汀和比枯枯靈堿的含量[J]．中南藥學(xué)，2014，(6)：588-591．

(收稿2015-05-13；修回2015-06-17)

Preparation of processed corydalis decumbens Stir-Frying with vinegar

Lei Jianlin Yang Cui Li Fang et al

The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University(Xi’an 710004)

Objective :To select the best processing vinegar and processing methods of Corydalis decumbens. To provide the experimental basis for the scientific clarify vinegar into the liver of synergistic. Methods:HPLC was applied to determine the content of protopine and palmatine from processed Corydalis decumbens and the processing was designed by orthogonal design. Results:The best sample was stir-frying at 130℃ for 5 min after adding 20% rice vinegar infiltration 3hr. Conclusion:This optimum technology is stable and feasible，it can increase the contents of effective components better．The dosage of rice vinegar，time of vinegar infiltration，processing temperature are the main factors which affect markedly the quality of processed Corydalis decumbens stir-frying with vinegar.

Corydalis decumbens Protopine Palmatine Chromatography, high performance liquid Orthogonal test

*陜西省中醫(yī)藥管理局科技項目(13-ZY001)

夏天無 原阿片堿 巴馬汀 色譜法，高壓液相 正交試驗

R932

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.044

▲西安醫(yī)學(xué)院(西安 710021)

△通訊作者：陜西省中醫(yī)藥研究院(西安710003)