沈 霞 張 崗 陳 瑩 陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 (西安 712046)

柴胡防治乙型肝炎的網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)理初探*

沈 霞 張 崗 陳 瑩 陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 (西安 712046)

目的：乙型肝炎是危害我國(guó)人民健康的最主要疾病之一，中藥柴胡防治乙肝療效顯著，然而其分子機(jī)理尚不清楚。本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)闡明柴胡防治乙型肝炎的分子機(jī)理及其作用靶點(diǎn)。方法：本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到乙肝病毒的靶點(diǎn)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選靶點(diǎn)與化合物，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，利用Auto Dock軟件對(duì)靶點(diǎn)和小分子進(jìn)行對(duì)接打分，并通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase靶點(diǎn)與柴胡中Dextrin Corn和GLB之間存在明顯的相互作用；通過(guò)有效成分與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建闡明了柴胡有效成分防治乙肝的多成分對(duì)應(yīng)對(duì)靶點(diǎn)的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。結(jié)論：本研究揭示柴胡防治乙肝的物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在靶點(diǎn)及分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)理，為研究開(kāi)發(fā)中藥防治乙肝新藥提供理論基礎(chǔ)。

乙型肝炎是危害我國(guó)人民健康的多發(fā)疾病之一，是由乙型肝炎病毒引起的疾病。感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)可引起肝炎、肝硬化甚至肝癌。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，約有1.2億HBV攜帶者，其中2000多萬(wàn)人為慢性乙肝患者。根據(jù)衛(wèi)生部《2013中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)病毒性肝炎發(fā)病數(shù)就達(dá)138.08萬(wàn)人，占法定甲、乙類(lèi)傳染病的第1位，排在病毒感染性疾病的首位，排在疾病死亡的第4位。HBV感染不僅給患者及其家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，而且給國(guó)家?guī)?lái)巨大壓力。因此，開(kāi)發(fā)研制新的特異性防治HBV的藥物對(duì)我國(guó)具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

傳統(tǒng)中藥防治肝病歷來(lái)有之。柴胡為我國(guó)傳統(tǒng)中藥, 藥用歷史悠久。柴胡(Radix Bupleuri)為傘形科(Umbelliferae) 柴胡屬( Bupleurum L.) 植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。屬解表類(lèi)中藥，具有治療肝郁氣滯，疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣等作用[1]。在臨床上柴胡及其復(fù)方一直用于肝病的預(yù)防和治療[2]。然而，柴胡防治肝病的分子機(jī)制一直沒(méi)有進(jìn)行深入的研究?；诖耍狙芯恳韵到y(tǒng)藥理學(xué)的理論和方法為指導(dǎo)[3]，用乙肝病毒的蛋白靶點(diǎn)對(duì)柴胡中的主要有效成分進(jìn)行虛擬篩選，并構(gòu)建柴胡小分子與靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)圖。期望揭示柴胡防治乙肝的物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在靶點(diǎn)及多成分多靶點(diǎn)的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，為研究開(kāi)發(fā)中藥防治乙肝新藥提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)備 從Drug bank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索hepatitis B乙肝病毒的靶點(diǎn)。在TCMSP[4]數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相應(yīng)的柴胡化學(xué)成分。通過(guò)篩選，最終得到4個(gè)蛋白靶點(diǎn)：Chymotrypsinogen B(2CHA)、DNA gyrase subunit B(4GFN)、RAC-alphaserine/threonine-protein kinase(3096)。篩選得到的小分子化合物主要有：槲皮素、葛根素、糊精、月桂酸和莰非醇12種等。在PDB和NCBI中下載乙肝靶點(diǎn)的Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase(1X9D)三維結(jié)構(gòu)和柴胡化合物結(jié)構(gòu)。

1.2 分子對(duì)接 采用Auto dock軟件對(duì)柴胡中化合物分子去除水分子加上氫，接著處理Ligand，為其加上電荷，設(shè)置Root和可扭轉(zhuǎn)的鍵。 參數(shù)采用默認(rèn)值，遺傳算法使用拉馬克遺傳法，可以通過(guò)軟件將相應(yīng)靶點(diǎn)分子和化合物構(gòu)象載入窗口觀察到對(duì)接情況，分析聚類(lèi)構(gòu)象，在receptor環(huán)境中可以觀察對(duì)接構(gòu)象并得出對(duì)接分值。

1.3網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，建立網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。并分別用不同顏色表示靶點(diǎn)和化合物，本文中以深色圓點(diǎn)表示靶點(diǎn)，以淺色圓點(diǎn)表示化合物。

2 結(jié)果與討論 利用篩選得到的4個(gè)靶點(diǎn)對(duì)柴胡中的12個(gè)化合進(jìn)行虛擬篩選，最終發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase和柴胡中的Dextrin Corn、GLB分子對(duì)接結(jié)果最為合理，靶點(diǎn)與分子間的結(jié)合能Binding Energy分別為-3.96和-6.64。對(duì)接圖中表明(圖1左)，Dextrin Corn分子距離靶點(diǎn)中的氨基酸殘基GLU283、SER282、GLU273、LYS275、LYS655、TRP284較近。在Dextrin Corn分子周?chē)性S多己電離的極性氨基酸殘基，這些殘基與Dextrin Corn分子之間所形成的靜電作用對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定起重要作用。同樣(圖1右)，GLB與靶蛋白氨基酸殘基ARG334、ARG597、GLU599、PHE649、GLU689、THR688、PRO598距小分子較近。在GLB分子周?chē)性S多己電離的極性氨基酸殘基，這些殘基與GLB分子之間所形成的靜電作用對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定起重要作用。這一研究首次找到并證實(shí)了柴胡小分子防治乙肝的主要作用靶點(diǎn)。

圖1 柴胡中Dextrin Corn、GLB與靶點(diǎn)Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase對(duì)接示意圖

將篩選所得4個(gè)靶蛋白與12個(gè)柴胡化合物導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型如圖2所示：其中深色的為蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，淺色的為化合物。臨床中廣泛利用小柴胡湯治療慢性乙型肝炎, 表明小柴胡湯聯(lián)合抗病毒藥物治療慢性乙肝具有改善肝功能和清除血清標(biāo)志物的作用[5-6]。從圖中可以看出柴胡12種化學(xué)成分與4種蛋白質(zhì)靶點(diǎn)形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從分子角度展示柴胡防治乙肝的多成分對(duì)應(yīng)多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。此外，與靶蛋白R(shí)AC-alphaserine/threonine-protein kinase(3096)發(fā)生作用的化合物種類(lèi)最多。表明在柴胡防治乙肝病毒中，這一靶點(diǎn)是柴胡作用的主要靶點(diǎn)。

圖2 柴胡多成分多靶點(diǎn)的分子網(wǎng)絡(luò)模型

3 結(jié) 論 中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用模式一直是中藥研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本論文用計(jì)算機(jī)軟件研究乙肝作用靶點(diǎn)與柴胡有效成分的相互作用，從理論上篩選與乙肝靶點(diǎn)有互作的柴胡有效成分，首次闡明了柴胡防治乙肝的物質(zhì)基礎(chǔ)及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。本研究構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型展示柴胡防治乙肝多成分多靶點(diǎn)的作用關(guān)系。柴胡化學(xué)成分復(fù)雜多樣，通過(guò)分子網(wǎng)絡(luò)模型可以很好的闡釋其在治療乙肝的過(guò)程中的復(fù)合效應(yīng)。不同成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn)時(shí)其效果可能會(huì)疊加，也可能會(huì)相互抵消，這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)考證。本文通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)靶點(diǎn)和藥物成分進(jìn)行篩選，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型闡明柴胡在治療乙肝的物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在的靶點(diǎn)及分子網(wǎng)絡(luò)，為闡明中藥復(fù)雜的作用機(jī)制提供技術(shù)方法，同時(shí)為開(kāi)發(fā)中藥防治乙肝新藥提供理論基礎(chǔ)。

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典編輯委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M]． 北京: 人民衛(wèi)生出版社，2010: 263．

[2] 楊 柳,王雪瑩.北柴胡化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(3):143-145.

[3] 王永華,楊 凌.基于系統(tǒng)藥理學(xué)的現(xiàn)代中藥研究體系[J].世界中醫(yī)藥,2013,8(7):801-809.

[4] 汝錦龍，李 鵬，汪紀(jì)楠，等 ．TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines ：Journal of Cheminformatics ，2014 Apr 16 ：6(1):13.

[5] 黃幼異,黃 偉,孫 蓉.柴胡皂苷對(duì)肝臟的藥理毒理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011,17(17)：789-791.

[6] 陳丹丹,龔作炯.小柴胡湯治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2011 ，20(31)：384-386.

(收稿2014-07-08;修回2014-08-09)

*陜西省科技廳自然科學(xué)基金(2014JQ4148)

肝炎，乙型/中醫(yī)藥療法 柴胡/治療應(yīng)用 分子機(jī)理

R512.62

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.054