西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(西安710004)

李步榮 張 彤 李麗華 高 寧 張 毅

PCR-RDB技術(shù)在HCV基因分型中的應(yīng)用研究

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(西安710004)

李步榮 張 彤 李麗華 高 寧 張 毅

目的：評價(jià)PCR-RDB技術(shù)在丙型肝炎病毒(HCV)基因型檢測中的臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 方法：隨機(jī)收集經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測HCV RNA含量大于1×103IU/ml血清樣本總計(jì)158份，其中無臨床癥狀丙型肝炎病毒攜帶者90例，慢性丙型肝炎(CHC)患者48例，肝硬化(HS)患者16例，肝癌(LC)患者4例。全部血清樣本應(yīng)用PCR和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB)進(jìn)行HCV基因分型檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：所有標(biāo)本HCV基因分型成功，其中1b型78例，2a型65份，3a型3例，3b型2例，6a型2例，1b和2a混合感染型8例。不同疾病組HCV不同基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：HCV基因型與疾病類型無相關(guān)性；PCR-RDB雜交技術(shù)適用于臨床實(shí)驗(yàn)室開展HCV基因型檢測。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染后只有少數(shù)感染者可以憑借自身免疫系統(tǒng)清除體內(nèi)病毒，大部分感染者表現(xiàn)為持續(xù)感染，持續(xù)感染常導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化、肝癌甚至死亡。HCV基因型分布具有明顯的地域差異性和人群差異性[1]，不同基因型決定病毒某些生物學(xué)特性不盡相同，有報(bào)道不同基因型對干擾素的敏感性也有區(qū)別，引起的臨床表現(xiàn)也不完全一致。近年隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，出現(xiàn)了多種HCV基因分型方法。傳統(tǒng)的基因測序方法雖然準(zhǔn)確可靠，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于臨床實(shí)驗(yàn)室大范圍廣泛開展，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)與反向斑點(diǎn)雜交(Reverse dot blot，RDB)技術(shù)相結(jié)合開展HCV基因型檢測，其具有快速高效、高通量特點(diǎn)，花費(fèi)相對低廉，便于及時(shí)掌握本地區(qū)HCV基因型分布特征和流行趨勢，對臨床診斷、治療及預(yù)后的判斷有重要指導(dǎo)意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

對象與方法

1 研究對象 隨機(jī)收集2013年7月至2014年12月就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科和感染科門診，丙肝抗體檢測陽性，HCV RNA定量檢測結(jié)果高于1×103IU/ml患者血清樣本共158份，其中男98例，年齡6～85歲，平均42.02±17.09歲；女60例，年齡12～69歲，平均37.82±18.99歲。所有患者診斷符合《中國丙型肝炎防治指南》制定的標(biāo)準(zhǔn)，并排除丙型肝炎以外的其它類型肝炎病毒感染。其中無臨床癥狀丙型肝炎病毒攜帶者90例，慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C，CHC)患者48例，肝硬化(Hepatic sclerosis，HS)患者16例，肝癌(Liver cancer，LC)患者4例。所有患者早晨空腹靜脈采血10 ml，室溫靜置2 h，4000 rpm離心5 min分離血清，立即檢測或保存于-20℃冰箱備用。

2 主要試劑和儀器 丙型肝炎病毒基因分型試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；TC-412型TECHNE通用PCR 儀(英國Bibby Scientific Limited公司)；YN-H16型分子雜交儀(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)；TGL-16g高速低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；THZ-82恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)。

3 HCV基因分型

3.1 RNA的提取:取滅菌1.5 ml離心管，加入50 μl RNA蛋白酶K，同時(shí)加入200 μl血清，再加入200 μl病毒裂解液，振蕩混勻，高速離心10s，72℃放置10 min。小心加入250 μl無水乙醇，振蕩混勻。將混合液轉(zhuǎn)入離心柱，12000 rpm離心1 min，棄去離心液。離心柱中加入500 μl抑制物去除液，12000 rpm離心1min。離心柱中再加入500 μl去離子液，12000 rpm 離心1min，重復(fù)1次。將離心柱移入新的收集管，14000 rpm離心3 min去除殘余的乙醇。將離心柱移入新的無菌離心管中，72℃放置2 min。加入預(yù)熱的洗脫液50 μl，室溫靜置1min，14000 rpm離心1 min。

3.2 RT-PCR:在反應(yīng)管中加入30 μl提取的病毒核酸，按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃逆轉(zhuǎn)錄25 min，95℃預(yù)變性15 min (94℃ 30s；55℃ 40s；72℃ 45s)×45 cycles，72℃延伸7 min。

3.3 分子雜交:每個(gè)5 ml離心管中加入4±0.5 ml預(yù)熱的雜交液Ⅰ，放入標(biāo)記好的雜交膜條，將經(jīng)98 ℃變性10min的擴(kuò)增產(chǎn)物加入雜交液中，50 ℃雜交60 min。取50 ml滅菌離心管，加入25 ml預(yù)熱的雜交液Ⅱ和30μl溶液Ⅰ，移入膜條，50 ℃振蕩10 min。棄去雜交液Ⅱ，加入新的雜交液Ⅱ，室溫振蕩反應(yīng)10min。將膜條移入新鮮配制的顯色液，避光反應(yīng)5～10min。將膜條轉(zhuǎn)入去離子水中浸泡1～3min，肉眼直接判讀結(jié)果，必要時(shí)可借助閱讀儀掃描判讀結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和率表示。率的比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s 精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCV基因型檢測結(jié)果 158份血清樣本全部分型成功，其中1b型78例，2a型65例，3a型3例，3b型2例，6a型2例，1b和2a混合感染型8例(圖1)。1b型和2a型為主要流行基因型，占比高達(dá)90.51%(143/158)，1b型比2a型多8.23%。

2 不同疾病組HCV基因型檢測結(jié)果 由于本研究對象肝癌疾病組標(biāo)本只有4例，為了便于統(tǒng)計(jì)研究將肝硬化組和肝癌組合并分析，同時(shí)，將基因型3a、3b、6a合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見附表。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 5.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，χ2=0.5893，P=0.9966，統(tǒng)計(jì)表明不同疾病組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 HCV基因型分布

附表 不同疾病組HCV基因型分布

注：不同疾病組比較χ2=0.5893，P=0.9966

圖2 不同疾病類型HCV基因型分布特征比較

討 論

HCV基因型與亞型在世界范圍內(nèi)存在流行分布差異。HCV基因型與患者臨床表現(xiàn)、干擾素治療的敏感性、判斷疾病預(yù)后高度相關(guān)[2-3]。HCV主要通過血液傳播途徑，少數(shù)通過密切接觸途徑傳播。HCV基因組E1/E2/NS5為高可變區(qū)，常用作 HCV 的基因分型和進(jìn)化分析的目標(biāo)區(qū)。1993 年 Simmonds 等通過系統(tǒng)進(jìn)化分析HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5區(qū)域基因序列，將HCV基因主要分為6個(gè)基因型，80多個(gè)亞型，被國際科研人員廣泛接受。我國大部分地區(qū)漢族人群流行的HCV基因亞型主要是1b型，其次為2a型，不同區(qū)域不同人群不盡相同[4-5]。本次研究結(jié)果表明，西安地區(qū)HCV基因型分布存在多樣性，以1b最為常見，其次為2a型。3a、3b及6a型檢出率相對較低。HCV感染類型主要為單基因型感染，多基因感染是1b型和2a型混合感染，感染率5.06%(8/158)，未見其它類型混合感染。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同疾病組HCV基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有報(bào)道HCV基因型和疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，但本研究顯示基因型并不決定疾病類型，這還有可能和研究對象選擇以及樣本量的大小有關(guān)，還需要今后增大樣本量進(jìn)一步得出更科學(xué)合理的研究結(jié)論。

目前，HCV基因分型的方法有多種，全基因測序法是最為經(jīng)典可靠的基因分型法。此方法耗時(shí)長、花費(fèi)高、對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求高，難以在較大范圍開展。PCR-RDB技術(shù)是將型特異性寡核苷酸探針固定在硝酸纖維膜或尼龍膜特定檢測區(qū)域，和帶有生物素標(biāo)記的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交，通過生物素、鏈霉素和辣根過氧化酶結(jié)合，在過氧化氫的催化下使四甲基聯(lián)苯胺發(fā)生顯色反應(yīng)[6]。檢測結(jié)果可直接用肉眼分辨，操作簡便易行。本研究結(jié)果顯示全部158份樣本全部分型成功，間接說明該方法的廣泛適用性。PCR-RDB反向雜交技術(shù)是一種高通量、高效率、低成本檢測基因型方法，所需儀器設(shè)備要求不高，一般的分子診斷實(shí)驗(yàn)室都有條件開展。該方法要求樣本HCV RNA含量在1×103IU/ml以上，對于低含量樣本則存在敏感性不夠的缺點(diǎn)，以后還需進(jìn)一步提高。該方法對于新基因型病毒檢測存在缺陷，對于無法確定基因型還需通過全基因測序確定基因型。

本研究對象主要來源于醫(yī)院，尚不能夠全面真實(shí)反映本地區(qū)HCV感染者基因型分布情況，有必要在今后的研究中，增加調(diào)查人群范圍，提高研究樣本總量，以便更好掌握本地區(qū)HCV基因型的分布及變化。PCR-RDB技術(shù)操作簡便，其具有高通量特點(diǎn)，適合臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛開展。我國HCV 感染率較高，通過HCV基因型檢測，及時(shí)掌握HCV病毒的種系發(fā)育和進(jìn)化特性，為 HCV 疫苗的設(shè)計(jì)研發(fā)提供必要依據(jù)，為臨床制定合理的個(gè)體化治療方案和判斷預(yù)后提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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(收稿：2015-07-10)

Application research of genotyping for hepatitis C virus by PCR-RDB Department of Clinical Laboratory，Second Affiliated Hospital，Xi’an Jiaotong University

( Xi’an 710004)

Li Burong Zhang Tong Li Lihua et al

Objective: To evaluate the clinical practical application value of polymerase chain reaction and reverse dot blot(PCR-RDB) method on genotyping HCV in different disease groups. Methods: We conducted a cohort study with 158 participants including 90 HCV carriers without clinical symptom，48 patients with chronic hepatitis C，16 patients with hepatic sclerosis and 5 patients with liver cancer. The HCV RNA levels of all sera samples were confirmed higher than 1×103IU/ml by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(PCR). HCV genotyping was carried out using type-specific primers by means of polymerase chain reaction and reverse dot blot(RDB). And the results were statistically analyzed with GraphPad Prism 5.0 software. Results: All 158 specimens were genotyped successfully. Among them，78 cases were genotype 1b，65 cases were genotype 2a，3 cases were genotype 3a，2 cases were genotype 3b，2 cases were genotype 6a，8 cases were mixed genotypes 1b and 2a. There was no significant difference among the different disease groups about the distribution of HCV genotypes. Conclusion: There is no relationship between the HCV genotypes and disease types. PCR-RDB was a suitable method for the HCV genotyping in clinical laboratories.

Hepacivirus Genotyping techniques Polymenrase chain reaction Fluoroimmunoassay

丙型肝炎病毒 基因分型技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 熒光免疫測定

R446.6

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.047