西安市第五醫(yī)院檢驗科(西安710082)

王夢濤 趙嬋媛 劉小玲 盧春利 王 銳

間接免疫熒光法與線性免疫印跡法對自身抗體檢測結(jié)果分析

西安市第五醫(yī)院檢驗科(西安710082)

王夢濤 趙嬋媛 劉小玲 盧春利 王 銳

目的：探討自身特異性抗體篩查試驗間接免疫熒光法(IIF)與確認試驗線性免疫印跡法(LIA)檢測結(jié)果的相關(guān)性。方法：用IIF法作為抗核抗體(ANA)的篩查試驗，用LIA法作為抗核抗體譜(ANAs)特異性抗體的確認試驗，對自身免疫性疾病組(AID)及非AID疾病對照組進行檢測分析，并將檢測結(jié)果分為四組：IIF-ANA+/LIA+組，IIF-ANA+/LIA-組，IIF-ANA-/LIA+組和IIF-ANA-/LIA-組。結(jié)果：①在611例AID組中，IIF-ANA+/LIA+ 336例(55%)，IIF-ANA+/LIA-116例(19%)，IF-ANA-/LIA+ 55例(9%)，IIF-ANA-/LIA- 104例(17%)。②在100例非AID組中，IIF-ANA+/LIA+ 2例(2%)，IIF-ANA+/LIA- 7例(7%)，IIF-ANA-/LIA+3例(3%)，IIF-ANA-/LIA- 88例(88%)，總體符合率90%。AID組與非AID組自身抗體的檢測結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 ③ IIF-ANA-/LIA+組中，以抗SSA抗體、抗Ro-52抗體、抗ds-DNA抗體、抗組蛋白抗體、抗Jo-1抗體為主要檢測出的陽性自身抗體。AID組IIF-ANA+/LIA-中，ANA檢測核型以均質(zhì)型、斑點型為主，混合核型以均質(zhì)斑點型為主，熒光檢測滴度以1∶40～1∶320為主；非AID組IIF-ANA+/LIA-中，核型以斑點型為主，熒光滴度以1∶40～1∶320為主。結(jié)論：AID患者可能會出現(xiàn)IIF-ANA檢測陽性而LIA-ANAs檢測陰性或者IIF-ANA檢測陰性而LIA-ANAs檢測陽性，檢查除了進行IIF篩查ANA外，還需進行自身抗體譜的特異性抗體確認實驗。

自身抗體檢測對于自身免疫性疾病(Autoimmune disease，AID)的診斷和鑒別診斷具有重要意義，用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence，IIF)檢測抗核抗體(Antinuclear antibody ，ANA)是目前應(yīng)用最廣泛的自身抗體篩查指標，IIF法檢測ANA作為初篩試驗，雖然不具有疾病特異性，但由于其測定是針對細胞成分的總抗體，檢測敏感性高，對疾病的診斷和鑒別診斷具有重要意義[1]。目前國內(nèi)有些實驗室在IIF-ANA檢測結(jié)果陰性的情況下，就不再進行ANA譜特異性抗體的確認試驗檢測，只有ANA檢測結(jié)果陽性，才進行ANA譜特異性抗體的測定[2]。還有一些實驗室只進行ANA譜特異性抗體檢測而不檢測ANA，但在實際工作中，IIF檢測ANA結(jié)果與LIA法檢測特異性自身抗體結(jié)果常不完全符合。我們實驗室對611例AID患者血清抗體同時采用IIF法檢測ANA，LIA法檢測12種特異性自身抗體，比較兩種檢測方法結(jié)果的符合情況，探討兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性以及是否可以作為相互補充，以提高檢測靈敏度的聯(lián)合檢測手段。

資料與方法

1 一般資料 收集2013年8月至2014年8月在我院確診為AID的住院患者標本共計611例，其中男性151例，年齡6～79歲，女性460例，年齡2～88歲。所有標本同時采用IIF法檢測ANA和LIA法檢測針對12種自身抗原(RNP/Sm、Sm、SSA、Ro-52、SSB、Scl-70、Jo-1、CENP B、雙鏈DNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白)的自身抗體。同時收集確診為其它疾病的非AID患者100例作為對照，其中男性41例，年齡6～78歲，女性59例，年齡5～82歲。所有AID患者的診斷均符合國際相關(guān)學(xué)會的診斷指南，標本均為待測患者清晨空腹靜脈血，離心分離冷凍保存的新鮮血清。

2 檢測方法

2.1 用IIF法檢測ANA:采用美國SCIMEDX公司提供的ANA檢測試劑盒，以人喉癌上皮細胞(HEp-2)為抗原基質(zhì)，用間接免疫熒光法(IIF)檢測，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光模型，抗體滴度≥1:40為陽性。

2.2 用LIA法檢測ANAs：采用Euroimmun公司提供的LIA法檢測12種特異性自身抗體試劑盒，檢測抗RNP/Sm抗體、抗Sm抗體、抗SSA抗體、抗Ro-52抗體、抗SSB抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗CENP B抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體、抗核糖體P蛋白抗體，實驗完全按照操作說明書操作。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，IIF法ANA檢測陽性而LIA法ANAs檢測陰性( IIF-ANA+/LIA-) 組、IIF法ANA檢測陰性而LIA法ANAs檢測陽性(IIF-ANA-/LIA+)組以及IIF法檢測ANA滴度組間不同疾病患者比例的比較均采用X2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在611例AID組患者中ANA與ANAs檢測結(jié)果總體符合率為72%，兩者同時陽性所占的比例為55%，遠高于兩者同時陰性的17%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=124.5，P<0.01)。在AID組和非AID組中兩種檢測方法同時陽性所占的比例分別為55%和2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=215.5，P<0.01)，兩組ANA檢測陽性而ANAs檢測陰性所占比例分別為19%和7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.13，P<0.01)，兩組ANA檢測陰性且ANAs檢測陽性所占比例分別為9%和3%，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.85，P<0.01)。AID組與非AID組IIF法檢測ANA和LIA法檢測ANAs的結(jié)果總體分布，見表1、表2。

表1 AID組中IIF法檢測ANA和LIA法檢測ANAs的總體分布

2 在AID組及非AID組中ANA檢測陰性且ANAs檢測陽性者所檢測出的主要自身抗體為抗SSA抗體、抗Ro-52抗體，其次抗Sm抗體、抗SSB抗體、抗ds-DNA抗體、抗組蛋白抗體、抗Jo-1抗體、抗Scl-70抗體也有一定的陽性率。58例IIF-ANA檢測陰性且LIA-ANAs檢測陽性患者中，AID組與非AID組比較，自身抗體的陽性率有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，兩組里抗SSA抗體和抗Ro-52抗體與其它自身抗體的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。同時，我們所檢測的AID組中IIF-ANA+/LIA-組里的熒光模型以細胞核斑點型及均質(zhì)型為主，而非AID組則以細胞核斑點型為主。在123例ANA檢測陽性且ANAs檢測陰性者中，AID組以斑點型和均質(zhì)型為主，明顯高于非AID組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表2 非AID組中IIF法檢測ANA和LIA法檢測ANAs的總體分布

3 對IIF-ANA+/LIA-組滴度的測定：AID組熒光檢測滴度以1∶40～1∶320為主，非AID組熒光滴度也以1∶40～1∶320為主。相比較AID組在1∶40～1∶80，1∶160～1∶320各組中所占比例與非AID組均接近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表3 AID組及非AID組ANA陰性而ANAs陽性者中自身抗體陽性的分布情況

表4 AID組及非AID組ANA陽性而ANAs陰性者中熒光模型分布情況

注：S為斑點型，H為均質(zhì)型，N為核仁型，SH為斑點均質(zhì)混合型，Cyto為胞漿顆粒型

表5 ANA陽性ANAs陰性組滴度測定在AID組與非AID組中的比較

討 論

自身免疫性疾病總體發(fā)病率占世界人口的3%～5%，已成為嚴重影響人類健康的疾病，自身抗體檢測對AID診斷和鑒別診斷、病情評估與治療監(jiān)測、病程轉(zhuǎn)歸與預(yù)后判斷等都具有重要的臨床應(yīng)用價值[3]。以HEp-2細胞做為基質(zhì)的間接免疫熒光法檢測ANA的方法，具有操作簡單，敏感性高，且結(jié)果易于判讀等優(yōu)點，但ANA篩查對AID診斷沒有特異性且該方法自動化程度較低，操作標準化較難[4]，另外同種特異性抗體可出現(xiàn)不同的熒光染色核型，不同特異性抗體也可出現(xiàn)同樣的熒光染色核型[5]。當我們在AID患者中，同時進行ANA篩查及ANAs確認試驗時，由于各方法的抗原所用的基質(zhì)不同，抗原來源不同，化學(xué)實驗反應(yīng)體系不同，實驗的敏感性和特異性不同，會出現(xiàn)ANA和ANAs檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象，有兩種情況需要注意：一種是IIF法檢測ANA陽性而LIA法檢測ANAs陰性的情況，這是因為ANA篩查實驗具有覆蓋ANA抗體面廣的特點，其抗體針對細胞中的所有抗原成分，而ANAs所檢測的特異性抗體對疾病的檢測具有較高的特異性，但目前免疫學(xué)所能檢測的特異性抗體僅為自身抗體中的一小部分，仍有大量的未知特異性自身抗體未被認識或未應(yīng)用于臨床檢測[6]，也就是說確認實驗檢測的是一些最常見的、臨床意義已經(jīng)明確的自身抗體，對于某些少見的、未知的抗體則只能通過熒光方法來檢測，而這些少見或未知抗體對疾病診斷也可能有一定的提示意義。另外由于檢測時的干擾現(xiàn)象或人體正常免疫反應(yīng)，以及一些非特異性的抗原會造成熒光檢測的陽性，在部分正常人血清檢測ANA時會出現(xiàn)一定比例的陽性(5%)，但滴度比較低。還有一種情況是IIF檢測ANA陰性而LIA法檢測ANAs陽性的標本，這主要是由于HEp-2細胞基質(zhì)中某些靶抗原的分布不均[7]，表達含量低(如RO-52、SSA、JO-1等)，以及不同固定方法對相關(guān)抗原的影響，細胞處理時的某些抗原位點缺失等，這些均可能造成熒光檢測的陰性，或者如果ANA譜分離的抗原不純，轉(zhuǎn)運過去的抗原也可能不純，造成多余條帶，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

在臨床實際工作中，由于認識的誤區(qū)、局限性及考慮檢測成本的因素，許多實驗室僅對IIF法檢測ANA陽性的標本才做進一步的ANAs特異性抗體確認試驗，或者只做ANAs確認試驗而不做篩查ANA的檢測，本文通過相關(guān)的結(jié)果分析顯示兩種方法檢測的總體符合率為72%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩種方法的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，若只對ANA檢測陽性的患者再進一步做ANAs的確認試驗，則會有近9%左右的漏檢率，同樣，若只做特異性抗體的確認試驗不做ANA篩查，也會有將近19%左右的患者漏檢。由此表明，在自身抗體的篩查試驗為陰性的患者中，仍然存在經(jīng)確認試驗檢測證實為陽性的患者，同時也會出現(xiàn)篩查試驗陽性而確認試驗陰性的情況，為了避免漏檢應(yīng)同時結(jié)合各種檢查結(jié)果，并進行結(jié)果的綜合考慮，兩者不能互相替代。

綜上所述，對于疑似自身免疫性疾病的患者，無論IIF法ANA檢測初篩試驗陽性與否，均需進行針對特異性抗體的確認試驗檢測，兩種方法配合臨床診斷，將最大限度的減少自身免疫性疾病患者的漏檢率，從而爭取最佳治療時間。

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(收稿：2015-05-08)

Analysis of autoantibodies detection between indirect immunofluorescence method and linear western blot method The Fifth Hospital of Xi’an，Department of Laboratory Medicine

(Xi’an 710082)

Wang Mengtao Zhao Chanyuan Liu Xiaoling et al

Objective: To explore the correlation of the specific antibody results between screening test of IIF and validation test of LIA. Methods: IIF method as ANA screening test，using LIA method as the validation test of ANAs ，Analysis the group of AID and the disease control group of not AID，the test results can be divided into four groups: group IIF ANA + / LIA +，group IIF ANA + / LIA -，group IIF - ANA - / LIA +，group IIF - ANA - / LIA - . Results:①In 611 cases of AID groups：IIF ANA + / LIA + had 336 patients (55%)，IIF ANA + / LIA - had 116 patients (19%)，IIF ANA - / LIA + had 55 cases (9%)，IIF ANA - / LIA - had 104 patients (17%) . ②In 100 cases of the not AID group: IIF ANA + / LIA + had 2 cases (2%)，IIF ANA + / LIA - had 7 cases (7%)，IIF ANA - / LIA + had 3 cases (3%)，IIF ANA - / LIA - have 88 patients (88%)，the overall coincidence rate was 90%. Two groups autoantibodies detection results had significant statistical significance difference . ③In the IIF ANA - / LIA + group，there are anti SSA antibody，anti Ro-52 antibody，anti ds-DNA antibody，antihistonesantibody，anti Jo-1 antibody as main detected positive autoantibodies. In the AID groups of IIF ANA + / LIA -，ANA detection karyotype was given priority to with homogeneous，spots，and mixed karyotype was given priority to with homogeneous spots type，and the fluorescence detection of antibody titer was given priority to with 1∶40～1∶320; In the not AID group IIF ANA + / LIA -，karyotype was given priority to with spot type，the fluorescence detection of antibody titer was given priority to with 1∶40～1∶320. Conclusion: In the clinical test of AID may appear the IIF test positive for the ANA and LIA -ANAs test negative or IIF - ANA test negative and LIA-ANAs test positive.So in the clinical test of AID，in addition to the IIF screening test，you also need to do the confirmation experiment of autoantibodies spectrum simultaneously，so as to avoid a misdiagnosis because ofthe single test.

Autoantibodies Fluorescent antibody technique,indirect Antibodies,antinuclear Immunoblotting Fluorometry

自身抗體 熒光抗體技術(shù)，間接 抗體，抗核 免疫印跡法

R446.6

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.046