西電集團(tuán)醫(yī)院 (西安710077)

李 欣 汪建軍△ 任超杰 扈會(huì)整 王 欣

主動(dòng)外排機(jī)制和膜蛋白缺失在粘質(zhì)沙雷菌耐藥中的研究*

西電集團(tuán)醫(yī)院 (西安710077)

李 欣 汪建軍△任超杰 扈會(huì)整 王 欣

目的： 研究粘質(zhì)沙雷菌的耐藥性與細(xì)胞的主動(dòng)外排機(jī)制及細(xì)菌膜蛋白缺失相關(guān)性。方法： 收集對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥的粘質(zhì)沙雷菌株15株，應(yīng)用PCR擴(kuò)增和DNA序列分析，采用E試驗(yàn)觀察氰氯苯腙對(duì)亞胺培南最低抑菌濃度(MIC)的影響，以研究細(xì)胞內(nèi)是否存在主動(dòng)外排機(jī)制和膜蛋白缺失現(xiàn)象。 結(jié)果： 當(dāng)CCCP存在時(shí)，其中7株粘質(zhì)沙雷菌亞胺培南，美羅培南的 MIC 值下降，提示存在主動(dòng)外排機(jī)制。其中有1株OprD2蛋白缺失，1株外排泵MexB基因陽(yáng)性。 結(jié)論： 耐碳青霉烯類藥物的粘質(zhì)沙雷菌的耐藥性與細(xì)胞的主動(dòng)外排機(jī)制和膜蛋白缺失有關(guān)。

粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)是革蘭陰性小桿菌，單個(gè)或短鏈存在，常存在于人體泌尿道和呼吸道，在兒童胃腸道貯菌也比較常見(jiàn)。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，常能引起敗血癥、肺炎、腦膜炎等各種感染性疾病，且對(duì)多種抗生素表現(xiàn)耐藥。近年來(lái)出現(xiàn)了耐亞胺培南和美羅培南粘質(zhì)沙雷菌菌株。粘質(zhì)沙雷菌是引起院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，并出現(xiàn)散播情況，給臨床治療和院內(nèi)感染控制帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[1]。粘質(zhì)沙雷菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制[2]，是否與細(xì)胞內(nèi)存在主動(dòng)外排機(jī)制有關(guān)，我們對(duì)此作了相應(yīng)的試驗(yàn)和基因分型。

材料與方法

1 材 料

1.1 菌株來(lái)源與質(zhì)控菌株：收集2010～2014年從咸陽(yáng)地區(qū)初次培養(yǎng)亞胺培南(IMP)和美羅培南(MPM)耐藥的粘質(zhì)沙雷菌15株，大腸埃希菌ATCC25922為實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

1.2 設(shè)備和試劑：Eppendorf centrifuge5417R低溫離心機(jī)；MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)；Bio-Rad電泳儀及成像系統(tǒng)；瓊脂糖購(gòu)自O(shè)xoid公司；100 bp DNA梯帶標(biāo)志物購(gòu)自大連寶生物公司；氰氯苯腙(CCCP)終濃度5 mg/L購(gòu)自Sigma公司；IMP E test試條購(gòu)自瑞典AB Biodisk公司；M-H培養(yǎng)基購(gòu)自杭州天和生物公司；菌種及藥敏鑒定使用VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌藥敏鑒定系統(tǒng)及配套試劑(法國(guó)梅里埃公司)；PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)于上海生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 CCCP(羰基氰氯苯腙)抑制作用：在血瓊脂平板上接種細(xì)菌，35℃培養(yǎng)24h后，挑取2～3個(gè)菌落，用生理鹽水充分混勻，并調(diào)節(jié)濁度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，按K-B法涂滿整個(gè)含有CCCP(濃度為5mg/L)的M-H瓊脂平板和一般M-H瓊脂平板，并貼上E-test試紙條，35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察CCCP對(duì)IMP的MIC的逆轉(zhuǎn)作用。當(dāng)存在CCCP時(shí)IMP的MIC比不含有CCCP時(shí)IMP的MIC下降1/3，提示存在主動(dòng)外排機(jī)制，否則提示不存在主動(dòng)外排機(jī)制。

2.2 基因檢測(cè)方法：oprD2基因熱循環(huán)參數(shù)為93℃預(yù)變性2min→93℃60s→55℃40s→72℃90s，最后一個(gè)72℃延伸5 min，共循環(huán)35周期。其余基因熱循環(huán)參數(shù)為：93℃預(yù)變性2min→93℃60s→55℃40s→72℃90s，最后一個(gè)72℃延伸5min，共循環(huán)35周期；純水作為陰性對(duì)照。耐藥基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)，引物序列見(jiàn)附表。

附表 基因引物序列

結(jié) 果

1 基因檢測(cè)結(jié)果 15株耐碳青霉烯酶的粘質(zhì)沙雷菌經(jīng)上述幾種基因進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，結(jié)果有1株OprD2蛋白缺失，1株外排泵MexB基因陽(yáng)性，其他未擴(kuò)增出，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)附圖。

附圖 基因擴(kuò)增結(jié)果(1.OprD2,2. MexB,3.陰性對(duì)照,

4.M為100bp DNA梯帶)

2 CCCP存在與否對(duì)IMP體外抗茵活性的影響 15株IMP和MPM耐藥的粘質(zhì)沙雷菌株中，有6株外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，CCCP存在使IMP的MIC下降至4個(gè)濃度梯度的菌株有4株，下降至3個(gè)濃度梯度的菌株有1株，CCCP存在使MPM的MIC下降至4個(gè)濃度梯度的菌株有3株，其中有2株菌同時(shí)對(duì)兩種藥物有明顯外排作用，其余菌株在CCCP存在與否IMP(MPM)的MIC值無(wú)變化。

討 論

粘質(zhì)沙雷菌廣泛存在與自然界，為條件致病菌，是引起腸道感染的主要病原菌，與許多醫(yī)院的院內(nèi)感染暴發(fā)流行有關(guān)，能夠引起多種疾病，如：呼吸道疾病、尿路感染等。近幾年，由于抗生素的不合理使用，粘質(zhì)沙雷菌對(duì)抗生素的耐藥呈蔓延趨勢(shì)，且耐藥基因復(fù)雜多樣，耐藥程度也日趨嚴(yán)重，耐藥菌的治療成為一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。本研究主要對(duì)15株IMP和MPM耐藥的粘質(zhì)沙雷菌的膜蛋白缺失和主動(dòng)外排進(jìn)行檢測(cè)，并探討其耐藥機(jī)制。

外膜孔蛋白OprD分為1型和2型，研究表明：與IMP耐藥有關(guān)的為外膜孔蛋白OprD2，IMP由于分子小，通過(guò)外膜蛋白孔道可選擇性快速進(jìn)入菌體，與菌體的特異性位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，起到抗菌作用。當(dāng)外膜通透性下降，外膜蛋白的改變、減少或缺失 ，使抗菌藥物不能進(jìn)入菌體，從而產(chǎn)生耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)：15株耐碳青霉烯酶類藥物粘質(zhì)沙雷菌中，OprD2基因缺失1株。結(jié)果表明：OprD2基因缺失不是本組耐藥的主要原因，但不排除因OprD2基因突變或基因表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致粘質(zhì)沙雷菌對(duì)IMP耐藥。

粘質(zhì)沙雷菌細(xì)胞膜上的主動(dòng)外排蛋白包括外膜通道蛋白、內(nèi)膜蛋白和膜連接蛋白，主動(dòng)外排蛋白是導(dǎo)致粘質(zhì)沙雷菌對(duì)多種抗菌藥物表現(xiàn)為多重耐藥的主要原因。粘質(zhì)沙雷菌細(xì)胞膜上的這些主動(dòng)外排蛋白組成了主動(dòng)外排系統(tǒng)，主要有AcrAB[4]、SdeXY[5-6]、SmdAB[7-8]、SmfY[9]及SdeCDE[8-10]系統(tǒng)。我們研究了粘質(zhì)沙雷菌的外排泵基因MexR、MexB、acrB、acrA，其中MexB基因陽(yáng)性一株。CCCP為質(zhì)子泵抑制劑，能破壞細(xì)菌跨胞漿膜的質(zhì)子梯度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失去能量供應(yīng)而起作用。一般認(rèn)為CCCP作用使粘質(zhì)沙雷菌對(duì)IMP的MIC下降至1/3，表明細(xì)菌可能存在泵出機(jī)制，我們研究有6株外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)菌存在主動(dòng)外排系統(tǒng) ，此系統(tǒng)可以將已進(jìn)入細(xì)菌胞質(zhì)的抗菌藥物排出菌體外，使臨床上治療失敗。粘質(zhì)沙雷菌對(duì)常用抗菌藥物及對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制復(fù)雜，膜孔蛋白OprD2基因缺失以及外排泵出機(jī)制存在是其重要的耐藥機(jī)理。

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(收稿：2015-06-04)

Study on the active efflux mechanism and the absence of membrane proteins in Serratia marcescens resistence

Xidian Group Hospital (Xi’an710077)

Li Xin Wang Jianjun Ren Chaojie et al

Objective：Study the drug resistance of Serratia marcescens whether related to the cells active efflux mechanism and the absence of bacterial membrane proteins or not. Methods：collected 15 strains Serratia marcescens that resist Imipenem and Meropenem ,application PCR amplification and DNA sequence analysis. adopt E test experiment observe the influence of CCCP for Imipenem minimal inhibitory concentration. in order to study intracellular was exist active efflux mechanism and the absence of membrane proteins or not. Results：When CCCP exist, there were 7 strains serratia marcescens for imipenem and Meropenem’MIC value decreased, prompting exist active efflux mechanism bacterial, and 1 strain absent OprD2protein, 1 strain efflux pump MexB gene positive. Conclusion：The resistance of Serratia marcescens that resist Carbapenemase related to the cells active efflux mechanism and the absence of bacterial membrane proteins .

Serratia marcescens Imipenem @MexB gene @OprD2protein Drug resistance,bacterial

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K11-02-03-09)

粘質(zhì)沙雷菌 亞胺培南 @MexB基因 @OprD2蛋白 抗藥性，細(xì)菌

R446.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.029

△陜西省核工業(yè)215醫(yī)院