陜西省蒲城縣醫(yī)院(蒲城 715500)

孔令武 潘軍強(qiáng) 王 毅 姚曉偉

阿托伐他汀鈣對動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈TLR2表達(dá)的影響

陜西省蒲城縣醫(yī)院(蒲城 715500)

孔令武 潘軍強(qiáng) 王 毅 姚曉偉

目的：探討阿托伐他汀鈣對新西蘭大白兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR2表達(dá)的影響及其抗動(dòng)脈粥樣硬化TLR機(jī)制。方法: 將新西蘭大白兔30只分為高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、高脂飲食組、正常對照組，喂養(yǎng)8周后處死每組動(dòng)物取出主動(dòng)脈，測量動(dòng)脈粥樣硬化病變面積；行免疫組化染色及Western blot檢測，觀察兔主動(dòng)脈粥樣硬化程度及TLR2蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)。結(jié)果:高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、高脂飲食組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積與動(dòng)脈內(nèi)膜面積比值及TLR2蛋白表達(dá)均高于正常對照組；高脂飲食加阿托伐他汀鈣組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積與動(dòng)脈內(nèi)膜面積比值及TLR2蛋白表達(dá)均低于高脂飲食組。結(jié)論:阿托伐他汀鈣可使主動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)下調(diào)，具有顯著抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)常累積心、腦、腎等主要器官，致殘率及病死率高。脂質(zhì)代謝異常是動(dòng)脈硬化最重要的危險(xiǎn)因素，其發(fā)病機(jī)制成為心血領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。眾多研究認(rèn)為AS是一種動(dòng)脈血管的慢性、非特異性炎癥性病變。相關(guān)研究顯示：Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs) 是一組跨膜受體蛋白質(zhì)，TLR2是啟動(dòng)炎性反應(yīng)的促炎因子，TLR2高水平在AS發(fā)生、發(fā)展中所起促進(jìn)作用[1]。阿托伐他汀鈣作為一種經(jīng)典的調(diào)脂藥，除具有降低低密度脂蛋白膽固醇的作用外，還具有“多效性”如：改善血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化等功能[2]。本研究通過觀察阿托伐他汀鈣對兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而探討了其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心新西蘭兔30只，雄性，1月齡，體重1.2～1.5kg。在實(shí)驗(yàn)室使用普通飼料喂養(yǎng)1周后，稱重，隨機(jī)分為三組：正常對照組、高脂飲食組及高脂飲食加阿托伐他汀鈣(國藥準(zhǔn)字H20051408)組，每組各10只。分別給予正常飼料120g/d、高膽固醇飼料120g/d、高膽固醇飼料120g/d+阿托伐他汀鈣10mg/(kg·d)灌胃，喂養(yǎng)8周后處死上述各組動(dòng)物。

2 方 法

2.1 標(biāo)本取材及留?。焊鹘M實(shí)驗(yàn)動(dòng)物末次給藥前12 h禁食，在預(yù)定實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)3%戊巴比妥鈉30mg/kg耳緣靜脈注射，全身麻醉后立即開胸取出從近主動(dòng)脈弓部到髂動(dòng)脈分叉處全部主動(dòng)脈。所取組織分作兩段，一段以4%多聚甲醛液固定用于組織病理學(xué)檢測,另一段置于- 70℃冰箱用于提取蛋白。

2.2 免疫組化特異性染色鏡下觀察 ：疫組化法觀察新西蘭大白兔主動(dòng)脈斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)水平。斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)的陽性結(jié)果為：血管壁染成棕黃色。用顯微鏡顯像系統(tǒng)采集圖像，隨機(jī)選取血管壁3個(gè)視野(×400)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)測量并計(jì)算A值。

2.3 Western blot檢測主動(dòng)脈TLR2蛋白的表達(dá)：提取總蛋白并用BCA試劑盒測蛋白總濃度及變性。每孔以50g總蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，加入一抗(1∶250鼠抗兔TLR2單克隆抗體或者1∶1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育過夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋)4℃孵育過夜。應(yīng)用凝膠掃描成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描分析，以β-actin作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1 三組間 AS斑塊面積變化 見表1。高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、高脂飲食組AS斑塊面積與動(dòng)脈內(nèi)膜面積比值均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高脂飲食加阿托伐他汀鈣組AS斑塊面積與動(dòng)脈內(nèi)膜面積比值低于高脂飲食組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 組斑塊面積百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高脂飲食組比較，#P<0.05

2 三組間TLR2蛋白特異性染色表達(dá)陽性面積比比較 見表2、圖1。高脂飲食加阿伐他汀鈣組、高脂飲食組血管壁TLR2蛋白表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食加阿托伐他汀鈣組血管壁TLR2蛋白表達(dá)高于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組主動(dòng)脈血管壁TLR2蛋白表達(dá)半定量分析

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高脂飲食組比較，#P<0.05

圖1 各組主動(dòng)脈血管壁TLR2蛋白表達(dá)(×400)

3 三組間TLR2蛋白Western blot結(jié)果比較 見圖2。高脂飲食組、 高脂飲食加阿托伐他汀鈣組、對照組TLR2蛋白表達(dá)分別為1.415±0./066、0.913±0.087、0.412±0.038。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 TLR2蛋白Western blot結(jié)果

討 論

研究顯示患有動(dòng)脈粥樣硬化癥的患者，均處于慢性、亞臨床的炎性狀態(tài)[3-4]，TLR2是啟動(dòng)慢性炎性反應(yīng)的促進(jìn)因子。本研究通過高脂飲食及高脂飲食加阿托伐他汀鈣建立動(dòng)脈粥樣硬化兔模型，應(yīng)用免疫組化法和Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，各動(dòng)脈粥樣硬化組主動(dòng)脈組織中TLR2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、進(jìn)展過程中，TLR2可能起著重要作用。

有研究報(bào)道TLR2促進(jìn)脂肪在巨噬細(xì)胞中積聚，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，后者是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志[5]。TLR2在糖尿病鼠中高表達(dá)，易發(fā)生高脂飲食誘發(fā)的胰島素抵抗；相反，用高脂飲食喂養(yǎng)老鼠，抑制TLR2功能后，胰島素敏感性增加，促炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用減弱[6-7]。此外，TLR2可通過多種可溶性細(xì)胞因子產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)：活化補(bǔ)體及內(nèi)皮細(xì)胞、增加血管通透性、聚集中性粒細(xì)胞。聚集的中性粒細(xì)胞則可進(jìn)一步釋放炎癥因子、蛋白酶、活性氧等物質(zhì)直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮損害。內(nèi)皮細(xì)胞受損后又可產(chǎn)生黏附因子，后者進(jìn)一步招募中性粒細(xì)胞，周而復(fù)始，形成惡性循環(huán)。總之，眾多研究都支持TLR2水平高表達(dá)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

本研究顯示，正常新西蘭大白兔給予高膽固醇飼料飼養(yǎng)后，可出現(xiàn)明顯的主動(dòng)脈硬化，亦有大量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。應(yīng)用免疫組化與Western-blot技術(shù)，從組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)水平、分子信息水平通過半定量與定量的分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)高脂飲食可使主動(dòng)脈血管壁TLR2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，給予他汀類調(diào)脂藥阿托伐他汀鈣干預(yù)后TLR2蛋白表達(dá)可下調(diào)。即阿托伐他汀鈣在一定程度上使主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)下調(diào)。這進(jìn)一步從分子生物信息學(xué)的角度證明TLR2參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，而阿托伐他汀鈣通過下調(diào)TLR2蛋白表達(dá)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。有關(guān)阿托伐他汀鈣通過下調(diào)TLR2蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的精確分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] Caricilli AM, Nascimento PH, Pauli JR,etal. Inhibition of toll-like receptor 2 expression improves insulin sensitivity and singnaling in muscle and white adipose tissue of mice fed a high-fat diet[J].Journal of Endocrinology, 2008,199(3):399-406.

[2] Gocmen AY, Ocak GA, Ozbilim G,etal. Effect of atorvastatin on atherosclerotic plaque formation and platelet activation in hypercholesterolemic rats[J]. Can J Pharmacol, 2013,91(9):680-685.

[3] 李永紅, 葛志明, 王其新, 等．阿托伐他汀對高膽固醇血癥患者血小板血管緊張素Ⅱ受體表達(dá)的影響[J]．中華高血壓雜志，2008, 16(10):894-898．

[4] Maiti R, Agrawal NK．Atherosclerosis in diadbetes mellitus: role of inflammation[J].Indian Journal of Medical sciences,2007,61(5): 292-306.

[5] 姚曉偉,潘軍強(qiáng),陳海潮,等. 吡咯列酮對兔主動(dòng)脈粥樣硬化程度的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，42(9):1118-1120.

[6] Dasu MR, DevardjS, Park S,etal. Increased toll-like receptor (TLR) activation and TLR ligands in rescently diagnosed type 2 diabetic subjects[J]. Diabetes Care, 2010,33(4):861-868.

[7] Zhang F． Peroxisome proliferator-activated receptor-γ as a therapeutic target for hepatic fibrosis: from bench to bedside[J]． Cell Mol Life Sci,2013,70(6): 259-276．

(收稿：2015-08-03)

@阿托伐他汀鈣 動(dòng)脈粥樣硬化/病理生理學(xué) 膽固醇/分析 Tou樣受體 兔

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.005