薛 蕊 馬海濤 韓承慧 王 斐 孫國華 姜海濱①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306;2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺 264006)

微衛(wèi)星標(biāo)記是以 2—6個(gè)核苷酸單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列, 存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中, 因此又稱簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeats, SSRs)和短串聯(lián)重復(fù)(Simple tandem repeats, STRs)(Tautzet al,1984)。它由核心序列和側(cè)翼序列兩部分構(gòu)成, 核心序列高度多態(tài), 而側(cè)翼序列則一般高度保守。相較于以往的分子標(biāo)記, 微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量豐富、操作簡便、重復(fù)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)(Schuget al, 1998),因此已成為水產(chǎn)動物種群遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等方面的有效工具(Chistiakovet al, 2006)。

EST(Expressed Sequence Tag)即表達(dá)序列標(biāo)簽,是一段通過單向測序得到的200—250 bp核苷酸序列(侯戰(zhàn)輝等, 2008)。由于來源于cDNA文庫, 因此EST是功能基因的一部分, 可以對其進(jìn)行基因注釋(邱櫻,2013)。EST-SSR即存在于EST序列上的微衛(wèi)星標(biāo)記,與傳統(tǒng)的基因組微衛(wèi)星標(biāo)記(Genomic-SSR)相比,EST-SSR標(biāo)記開發(fā)成本低, 可以節(jié)省大量的人力物力,并且在不同物種間具有一定的通用性(易少奎等,2013; 董迎輝等, 2013), 因此已經(jīng)成為新型高效的開發(fā)SSR途徑。

許氏平 鲉(Sebastes schlegelii)又稱黑, 俗稱黑寨、黑老婆等, 是分布在西北太平洋近岸的溫水性巖礁棲息魚種, 廣泛存在于黃海、渤海近海海域, 為卵胎生魚類。由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富, 而且生長較為迅速, 已成為我國北方深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚種。進(jìn)行許氏平 鲉的良種選育, 既可保護(hù)自然資源,又可提高養(yǎng)殖效率, 意義重大, 而開發(fā)具有良好多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記是進(jìn)行遺傳育種的基礎(chǔ)。已有研究者采用 傳統(tǒng)方法開發(fā)了一些許氏平 鲉 Genomic-SSR標(biāo)記(Yoshidaet al, 2005; Anet al,2009; Baiet al, 2011;Yasuikeet al, 2013), 但對EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)未見報(bào)道。本研究首次利用已發(fā)表的許氏平 鲉 EST序列進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記開發(fā), 分析了與Genomic-SSR標(biāo)記的差異, 并檢測了其在近緣種朝鮮平 鲉(Sebastes koreanus)、褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)的通用性,以期為許氏平鲉良種選育提供條件。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

許氏平 鲉野生群體樣品30個(gè)取自長島附近海區(qū),朝鮮平 鲉 樣品8個(gè)取自大連, 褐菖鲉樣品8個(gè)取自威海乳山。尾鰭和肌肉樣品暫存放在70%乙醇中, 帶回實(shí)驗(yàn)室后于–20°C 冰箱保存。采用傳統(tǒng)酚/氯仿/異戊醇法抽提基因組 DNA, 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性、NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度和純度。DNA樣品保存于–20°C冰箱中, 實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行稀釋, 終濃度為50ng/μL。

1.2 EST序列獲取及分析

從 NCBI公共數(shù)據(jù)庫(http: //www.ncbi.nlm.nil.gov/sites/entrez)下 載許氏平 鲉EST序列(檢索詞為Sebastes schlegelii)。對序列進(jìn)行拼接后利用 SSR Hunter 1.3軟件查找微衛(wèi)星序列, 查找條件為: 二堿基重復(fù)5次以上(含5次); 三堿基重復(fù)4次以上(含4次); 四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)均在 3次以上(含3 次)。

1.3 EST-SSR引物設(shè)計(jì)

用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物長度控制在18—22bp; GC含量控制在40%—60%, 正反引物相差不超過10%; Tm值控制在40—60°C, 正反引物相差不超 10°C; 產(chǎn)物長度控制在 100—500bp。設(shè)計(jì)好的引物送生工生物(上海)有限公司合成。

1.4 EST-SSR引物篩選與優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)在Eppendorf普通梯度PCR儀中進(jìn)行。第一步用3個(gè)DNA樣品混合進(jìn)行初步篩選, 選出能夠穩(wěn)定擴(kuò)增目的條帶的 EST-SSR引物; 第二步對擴(kuò)增效果不理想的引物進(jìn)行梯度優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)用酶為TIANGEN Taq DNA Polymerase ET101-02-04, 25μL反 應(yīng) 體 系 如 下: 2μL DNA 模 板(50ng/μL), 2.5μL 10×buffer, 引 物 各 1μL (50μmol/L), 0.5μL dNTP(10mmol/L), 0.2μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL), 剩余體積以滅菌水補(bǔ)齊。PCR程序設(shè)為: 94°C預(yù)變性5min,接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán): 94°C 變性45s, 退火45s, 72°C延伸 1min, 循環(huán)結(jié)束后 72°C延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%(W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染染色,并用掃描儀拍照。

1.5 野生群體多態(tài)性檢測

篩選出的EST-SSR引物進(jìn)行野生群體PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同引物篩選部分, 不同引物的退火溫度參見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8% (W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染染色、掃描儀拍照。

1.6 多態(tài)性微衛(wèi)星引物通用性檢測

用多態(tài)性微衛(wèi)星引物對朝鮮平 鲉 和褐菖 鲉DNA樣品進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同引物篩選部分, 不同引物的退火溫度參見表 1。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8% (W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染染色,掃描儀拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)各SSR位點(diǎn)DNA帶型, 估算條帶分子量大小, 統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸入POPGENE 32 (Yehet al,1999)計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和香農(nóng)多樣性指數(shù)(I)。用軟件CERVUS 3.0(Marshallet al, 1998)計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphic information content, PIC)。GENEPOP v.4.1.4(Rousset,2008)檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡和連鎖不平衡情況。另外統(tǒng)計(jì)18對多態(tài)EST-SSR 引物對朝鮮平 鲉和褐菖鲉個(gè)體的通用率和多態(tài)率, 分析各位點(diǎn)通用性情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 許氏平鲉 EST序列中SSR位點(diǎn)種類、數(shù)量及出現(xiàn)頻率

從NCBI公共數(shù)據(jù)庫下載的1980條EST序列經(jīng)拼接、SSR位點(diǎn)查找后, 發(fā)現(xiàn) 181條 EST序列含有SSR位點(diǎn), 共計(jì) 224個(gè), EST-SSR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)率為9.14%, 平均每條EST序列上有SSR位點(diǎn)1.24個(gè)。其中, 含有一個(gè)EST-SSR位點(diǎn)的144條, 兩個(gè)EST-SSR位點(diǎn)的33條, 三個(gè)及三個(gè)以上EST-SSR位點(diǎn)的4條。依據(jù)Weber(1990)提出的分類方法, 所有EST-SSR位點(diǎn)中完美型比例占到 91.52%, 二到六堿基重復(fù)均有出現(xiàn), 位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為 109、88、4、2和 2, 分別對應(yīng)百分比53.17%、42.93%、1.95%、0.98%以及0.98%。其中, 二堿基重復(fù)出現(xiàn)頻率最高, 分為 10種重復(fù)類型, 以 TG/CA基序最多, 占 33.03%, 占總完美型位點(diǎn)的 17.56%; 三堿基重復(fù)有 23類, 以 CAG/CTG出現(xiàn)頻率最高, 為 12.50%, 四到六堿基所有重復(fù)類型皆出現(xiàn)一次。

表1 18對許氏平鲉 EST-SSR引物特征Tab.1 Characteristics of 18 pairs of EST-SSR primers for S. schlegelii

2.2 引物篩選和多態(tài)性檢測結(jié)果

對查找到的224個(gè)EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析, 挑選出部分適合設(shè)計(jì)引物的位點(diǎn), 共設(shè)計(jì)引物56對, 篩選后共計(jì) 46對引物能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增, 野生群體多態(tài)性檢測結(jié)果顯示, 其中 18個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性(表1), 位點(diǎn)HJ4137的電泳圖見圖1。

2.3 EST-SSR位點(diǎn)在野生群體中的多態(tài)性評價(jià)

所有位點(diǎn)共檢測出70個(gè)等位基因, 每個(gè)位點(diǎn)觀測等位基因數(shù)為 2—9, 平均觀測等位基因數(shù)為3.89。觀測雜合度(Ho)在0.0333—0.8000之間, 平均觀測雜合度為 0.3037; 期望雜合度(He)在 0.0333—0.7927之間, 平均期望雜合度為0.3757; 香農(nóng)指數(shù)(I)在0.0848—1.7819之間, 平均香農(nóng)指數(shù)為0.7416; 每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)在0.0323—0.7522之間,平均多態(tài)信息含量為 0.3419, 其中高度多態(tài)(PIC>0.5)位點(diǎn)5個(gè), 中度多態(tài)(0.25

圖1 位點(diǎn)HJ4137的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of PCR amplification of locus HJ4137

表2 18個(gè)許氏平鲉 EST-SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 18 EST-SSR loci for S. schlegelii

2.4 許氏平鲉多態(tài)性微衛(wèi)星引物的通用性檢測

在朝鮮平 鲉中除位點(diǎn)HJ606和HJ4183其余位點(diǎn)均能有效擴(kuò)增, 其中6個(gè)位點(diǎn)多態(tài); 在褐菖 鲉中所有位點(diǎn)均能有效擴(kuò)增, 除位點(diǎn)HJ4215和HJ4286單態(tài)外其余位點(diǎn)均為多態(tài)。18 個(gè)位點(diǎn)在朝鮮平 鲉 和褐菖鲉中的通用率分別是88.89%和100%, 多態(tài)率為33.33%和88.89%。其中, 位點(diǎn) HJ4215和HJ4286在許氏平鲉中顯示多態(tài)而在朝鮮平 鲉 、褐菖 鲉個(gè)體中為單態(tài);位點(diǎn) HJ4136、HJ4202以及 HJ4959 對許氏平 鲉、褐菖 鲉顯示多態(tài)而在朝鮮平 鲉中為單態(tài); 位點(diǎn)HJ606和HJ4183 對許氏平 鲉、褐菖 鲉 顯示多態(tài)而在朝鮮平鲉中不能有效擴(kuò)增; 位點(diǎn) HJ126、HJ4203以及 HJ4249對許氏平 鲉 、褐菖 鲉顯示多態(tài), 且對褐菖 鲉多態(tài)性更高; 位點(diǎn) HJ4137、HJ4930、HJ4944以及 HJ9578在三個(gè)物種中均具有較高多態(tài)性, 且在許氏平 鲉中多態(tài)性最高(表3)。位點(diǎn)HJ4136 在朝鮮平 鲉 、褐菖 鲉和許氏平 鲉中的多態(tài)性檢測結(jié)果見圖2。

3 討論

到目前為止, NCBI 公共數(shù)據(jù)庫中許氏平 鲉EST序列共 1980條, 相比研究較早的水生生物來說數(shù)目較少。本研究中許氏平 鲉EST-SSR位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)率為9.14%, 而海帶為 5.03%(王國良, 2010)、壇紫菜為5.64%(楊惠等, 2009)、泥蚶為 6.50%(董迎輝等, 2013)、中華鱉為 7.45%(許曉軍等, 2013)、牙鲆為 7.95%(陳松波等, 2010), 這說明相較于其它水生生物, 許氏平鲉EST-SSR位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)率較高, 具有較好的開發(fā)潛力。本研究查找到的許氏平 鲉EST-SSR核心序列以二堿基重復(fù)出現(xiàn)頻率最高, 這一結(jié)果與有關(guān)馬氏珠母貝(邱櫻, 2013)、牙鲆(陳松波等, 2010)以及中華鱉(許曉軍等, 2013)的研究結(jié)果相同, 而在其它學(xué)者的研究中也存在不同結(jié)果, 比如在泥蚶、海帶和壇紫菜中均以三堿基重復(fù)最豐富(楊惠等, 2009; 王國良, 2010; 周小龍等, 2013)。

圖2 位點(diǎn)HJ4136 在朝鮮平 鲉 和褐菖 鲉 以及許氏平 鲉中的檢測結(jié)果Fig.2 The results of transferability of locus HJ4136 in Sebastes koreanus, Sebastiscus marmoratus and Sebastes schlegeliia: 位點(diǎn)HJ4136 在朝鮮平鲉 中的通用性檢測結(jié)果; b: 位點(diǎn)HJ4136在褐菖鲉中的通用性檢測結(jié)果; c: 位點(diǎn)HJ4136在許氏平鲉中多態(tài)性檢測結(jié)果

表3 18個(gè)位點(diǎn)通用性檢測結(jié)果Tab.3 The results of transferability of 18 loci

許氏平 鲉EST-SSR核心序列以TG/CA基序最為常見, 在 205個(gè)完美型位點(diǎn)中占到 17.56%, 李霞等(2004)有關(guān)劍尾魚的研究結(jié)果與之類似。18個(gè)多態(tài)EST-SSR位點(diǎn)中, 有4個(gè)位點(diǎn)核心序列是TG或CA基序, 重復(fù)次數(shù)范圍在5—14之間, 占完美型多態(tài)位點(diǎn)比例 26.67%, 因此在本研究中許氏平 鮋EST-SSR位點(diǎn)TG/CA基序的開發(fā)效率較高; 上述 4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分別是 HJ126、HJ4136、HJ4959以及 HJ4137, 對應(yīng)的核心序列重復(fù)次數(shù)和等位基因個(gè)數(shù)分別為5、5、12、14和 2、4、7、9, 由此可見隨著核心序列重復(fù)次數(shù)增加位點(diǎn)多態(tài)性有逐漸增強(qiáng)的趨勢。通常認(rèn)為微衛(wèi)星多態(tài)性的形成與復(fù)制過程中的滑鏈錯(cuò)配有關(guān)(張?jiān)莆涞? 2001), 由此形成的插入或缺失突變會導(dǎo)致微衛(wèi)星核心序列長度的變化(喬洪金等, 2012), 而核心序列重復(fù)次數(shù)越高其出現(xiàn)插入或缺失突變的幾率就越大。

許氏平 鲉46對有效擴(kuò)增的EST-SSR引物中, 其中 18對具有多態(tài)性, 多態(tài)檢測率為 39.13%; An等(2009)開 發(fā)的許氏平 鲉Genomic-SSR位點(diǎn)14對有效擴(kuò)增, 其中 13對多態(tài), 多態(tài)檢測率高達(dá) 92.86%;Yasuike等(2013)設(shè)計(jì)30對完美型Genomic-SSR引物,其中 17對有效擴(kuò)增并且顯示多態(tài), 多態(tài)檢測率為100.00%。EST序列中有效擴(kuò)增的微衛(wèi)星引物中, 具有多態(tài)性的微衛(wèi)星比例明顯低于基因組中的微衛(wèi)星比例。此外, Bai等(2011)開發(fā)的多態(tài)Genomic-SSR位點(diǎn)平均觀測等位基因數(shù)、平均觀測雜合度以及平均期望雜合度分別為 5.7、0.4194和 0.5002, 均高于本研究開發(fā)的EST-SSR, 同樣的結(jié)果也存在于An等(2009)和Yasuike等(2013)開發(fā)的許氏平鲉Genomic-SSR標(biāo)記中。上述結(jié)果均證實(shí)了以往學(xué)者有關(guān) EST-SSR位點(diǎn)多態(tài)性低于 Genomic-SSR位點(diǎn)的結(jié)論(齊曉艷等,2013; 周小龍等, 2013)。一般認(rèn)為這是由于EST序列來源于基因編碼區(qū), 更易受到選擇壓力的作用從而表現(xiàn)出較高的保守性, 因此多態(tài)性要比基因組 SSR低(Chabaneet al, 2005)。

微衛(wèi)星側(cè)翼序列在近緣物種中比較保守, 根據(jù)已有物種的微衛(wèi)星引物實(shí)現(xiàn)跨物種通用是開發(fā)微衛(wèi)星引物的一種有效途徑。分子標(biāo)記可以被分為兩類,Ⅰ型分子標(biāo)記與已知功能的基因相關(guān)聯(lián), 而Ⅱ型分子標(biāo)記與基因組未知區(qū)域相關(guān)(O’Brien, 1991)。EST序列來源于功能基因, 由此開發(fā)的 EST-SSR引物屬于Ⅰ型微衛(wèi)星引物, 而Ⅰ型微衛(wèi)星引物已被證實(shí)比未知基因背景的Ⅱ型引物通用性更強(qiáng)(Holtonet al,2002)。Ma等(2010, 2011)開發(fā)了擬穴青蟹Ⅱ型和Ⅰ型微衛(wèi)星引物, 并分別檢驗(yàn)其在同屬物種中的通用情況, 結(jié)果顯示紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)對擬穴青蟹(Scylla paramamosain)Ⅰ型微衛(wèi)星引物的通用性更強(qiáng)。本研究中開發(fā)的18對多態(tài)EST-SSR引物對褐菖 鲉的通用率和多態(tài)率分別達(dá)到100%和88.89%, 顯著優(yōu)于An等(2009)開發(fā)的14對Genomic-SSR位點(diǎn),后者的相關(guān)數(shù)據(jù)分別為78.57%、78.57%。

一般認(rèn)為, 對于微衛(wèi)星引物, 親緣關(guān)系越近的物種實(shí)現(xiàn)擴(kuò)種擴(kuò)增的可能性越大, 而在本研究中, 與許氏平鲉親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的褐菖鲉 (Sebastiscus marmoratus)卻表現(xiàn)出了更好的通用性。此外, 通過分析 An等(2009)有關(guān)許氏平 鲉14對微衛(wèi)星引物在4個(gè)近緣種中的通用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知, 與許氏平 鲉親緣關(guān)系較近的Sebastes inermis通用情況(通用率 10/14, 多態(tài)率10/14)卻沒有Sebastes marmoratus(通用率 11/14, 多態(tài)率11/14)好 。同樣的結(jié)果都與褐菖 鲉(Sebastiscus marmoratus)這個(gè)物種有關(guān), 具體原因有待進(jìn)一步研究分析。另外, 上述結(jié)果與趙麗麗(2008)在青石斑魚和美洲黑石斑魚的跨種擴(kuò)增結(jié)果類似, 后者認(rèn)為這可能與跨種擴(kuò)增研究中使用的樣品數(shù)量有限、DNA復(fù)制時(shí)錯(cuò)配而產(chǎn)生假陽性帶、副產(chǎn)物帶過多、多態(tài)位點(diǎn)判斷等原因有關(guān)。此外, 通用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 位點(diǎn)HJ606和HJ4183 在許氏平 鲉 和褐菖 鲉中可以有效擴(kuò)增而在朝鮮平 鲉中不能有效擴(kuò)增, 這一結(jié)果得到進(jìn)一步確認(rèn)后可以應(yīng)用于從上述三個(gè)物種中鑒定朝鮮平 鲉的工作。

本研究結(jié)果顯示, 許氏平 鲉EST-SSR位點(diǎn)檢出率較高, 具有較好的開發(fā)潛力, 實(shí)驗(yàn)開發(fā)的多態(tài)EST-SSR 位點(diǎn)可用于許氏平 鲉群體遺傳多樣性分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析和近緣種通用性檢測等研究, 為今后許氏平 鲉的良種選育工作奠定基礎(chǔ)。

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