王丹妮 鄭春靜 江婷佳 劉 軍①

(1. 中國(guó)計(jì)量學(xué)院 杭州 310018; 2. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院 寧波 315010)

Wap65蛋白(Warm temperature acclimation 65kDa protein)是血漿蛋白的一種, 最早發(fā)現(xiàn)于金魚(yú)、鯉魚(yú)體內(nèi)(Kikuchiet al, 1995)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 金魚(yú)和鯉魚(yú)在高溫誘導(dǎo)下, 有一種分子量為65kDa的蛋白大量存在于各組織中, 被命名為Wap65, 此蛋白與哺乳動(dòng)物的血紅素結(jié)合蛋白高度同源(Altrudaet al, 1985;Nikkilaet al, 1991; Morganet al, 1993; Tolosanoet al,2002)。研究發(fā)現(xiàn), Wap65基因在不斷進(jìn)化中, 由于受到串聯(lián)機(jī)制和全基因組重復(fù)的影響(Shaet al, 2008),產(chǎn)生了兩種不同的異構(gòu)體, 分化為兩種蛋白, 分別為Wap65-1和 Wap65-2。目前, 已經(jīng)在許多魚(yú)類(lèi)發(fā)現(xiàn)了該基因, 包括青 鳉魚(yú)(Hirayamaet al, 2004)、藍(lán)鯰魚(yú)(Peatmanet al, 2008)、斑點(diǎn)叉尾(Shaet al, 2008)、劍尾魚(yú)(Alizaet al, 2008)、 紅鰭東方 鲀(Hirayamaet al,2003)、真裸南極魚(yú)(Clarket al, 2008)、香魚(yú)(Shiet al,2010)、鱸魚(yú)(Sarropoulouet al, 2010)、大鱗泥鰍(Choet al, 2012)等。

藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorus niphonius)屬于輻鰭亞綱、鱸形目、鯖亞目、鯖科、馬鮫屬, 廣泛分布于北太平洋西部, 在我國(guó)產(chǎn)于東海、黃海和渤海, 在南海以海南文昌鋪前附近海域最為著名。由于近年來(lái)人們對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫的肆意捕撈以及環(huán)境不斷惡化, 導(dǎo)致藍(lán)點(diǎn)馬鮫的產(chǎn)量急劇減少, 目前已經(jīng)在中國(guó)寧波象山建立了藍(lán)點(diǎn)馬鮫的保護(hù)基地。藍(lán)點(diǎn)馬鮫屬近海溫水性洄游魚(yú)類(lèi), 因此高溫是藍(lán)點(diǎn)馬鮫的生存及生產(chǎn)的重要因素之一。

在NCBI數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn), 對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫Wap65的研究主要集中在微衛(wèi)星的研究上, 本研究通過(guò)克隆Wap65-1和Wap65-2的基因全長(zhǎng)序列, 并表達(dá)相應(yīng)蛋白, 研究其功能, 以期為藍(lán)點(diǎn)馬鮫耐熱品種的培育提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年 5月在浙江省寧波市象山港捕撈藍(lán)點(diǎn)馬鮫樣本12尾[平均重(750±5)g], 取頭、肌肉、肝臟、脾臟、頭腎這 5個(gè)組織迅速投入液氮中保存, 根據(jù)TRIzol?Plus RNA Purification Kit (Invitrogen)提取上述 5個(gè)組織的總 RNA(步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)), 并采用SuperScriptTMFist-Strand Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 并保存于–20°C冰箱備用。熱誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所用的魚(yú)苗來(lái)自寧波市海灣苗種繁育中心, 共取24尾[平均重(1.0±0.2)g], 熱處理后, 保存于液氮中備用。

1.2 方法

1.2.1 Wap65-1和 Wap65-2基因全長(zhǎng)的克隆 根據(jù) NCBI中黑棘鯛(Acanthopagrus schlegeli)、花鱸(Lateolabrax japonicus)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)的Wap65-1以及真裸南極魚(yú)(Harpagifer antarcticus)、花鱸(Lateolabrax japonicus)、魚(yú)(Miichthys miiuy)的Wap65-2氨基酸序列, 利用ClustalW對(duì)以上序列進(jìn)行保守性分析并分別設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物(見(jiàn)表1)。

以藍(lán)點(diǎn)馬鮫肝臟 cDNA為模板, 采用巣式 PCR(第一輪引物采用F1和R1, 第二輪引物采用F2和R2),克隆 Wap65-1和 Wap65-2的部分片段, 采用Platinum?PCR SuperMix High Fidelity酶(Invitrogen),進(jìn)行兩輪PCR, 體系為25μL, 反應(yīng)條件均為: 94°C預(yù)變性 2min; 94°C 30s, 62°C 30s, 68°C 2min, 38 個(gè)循環(huán),產(chǎn)物保存于–20°C。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列Tab.1 The sequence of primers used in this study

然后根據(jù)已獲得的 Wap65-1和Wap65-2基因部分片段分別設(shè)計(jì)3′和5′RACE特異性引物(見(jiàn)表1), 利用Gene RACETMKit擴(kuò)增得到cDNA全長(zhǎng)。第一輪PCR反應(yīng)體系為12.5μL, 反應(yīng)條件: 94°C預(yù)變性2min;98°C 10s, 72°C 30s, 5個(gè)循環(huán); 98°C 10s, 70°C 30s, 5個(gè)循環(huán); 98°C 10s, 65°C 30s, 25個(gè)循環(huán); 最后, 68°C徹底延伸 5min。第二輪 PCR反應(yīng)體系 20μL, 反應(yīng)條件:94°C, 2min, 98°C 10s, 65°C 30s, 30個(gè)循環(huán); 最后68°C徹底延伸5min。PCR產(chǎn)物保存于–20°C。

上述所有 PCR產(chǎn)物與 pUCm-T載體連接, 轉(zhuǎn)化到E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 培養(yǎng)過(guò)夜, 每塊板隨機(jī)挑選 5個(gè)菌落, 然后進(jìn)行菌落檢測(cè), 選取陽(yáng)性菌,送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

序列拼接后, 得到 Wap65-1和 Wap65-2基因的cDNA 序列全長(zhǎng), 并設(shè)計(jì)引物, 進(jìn)行全長(zhǎng)克隆, 克隆所得的基因序列與拼接序列一致, 從而確定基因的序列。

1.2.2 生物信息學(xué)的分析 運(yùn)用 NCBI中的BLASTN對(duì)Wap65-1和Wap65-2基因的同源性進(jìn)行分析, 用MEGA 5軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 并利用 PredictProtein軟件對(duì) Wap65-1和Wap65-2蛋白序列進(jìn)行功能位點(diǎn)分析, 采用DNAMAN軟件將藍(lán)點(diǎn)馬鮫的這兩種氨基酸序列和已知的其它魚(yú)類(lèi)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析, 采用Signal P 4.1工具進(jìn)行蛋白信號(hào)肽分析。

1.2.3 藍(lán)點(diǎn)馬鮫幼體高溫脅迫及兩種基因的表達(dá)特征分析 將藍(lán)點(diǎn)馬鮫的幼體在 20°C、25°C、30°C、35°C的溫度下進(jìn)行 1h的熱誘導(dǎo), 然后提取總 RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA, 用于熒光定量表達(dá)分析。根據(jù)Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)目的基因及內(nèi)參引物(見(jiàn)表1)。采用 Power SYBR?Green PCR Master Mix進(jìn)行熒光定量 PCR(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。采用2–ΔΔCT法計(jì)算 Wap65-1和 Wap65-2基因的表達(dá)量并進(jìn)行分析, 并用SPSS11.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4 藍(lán)點(diǎn)馬鮫Wap65-1和Wap65-2原核表達(dá)及E.coliBL21 (DE3)熱耐受性實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)特異性引物(見(jiàn)表 1), 擴(kuò)增兩個(gè)基因 ORF, 用EcoRⅠ和NdeⅠ對(duì)目的基因及 pCold TF載體分別雙酶切, 根據(jù)In-Fusion?HD Cloning Kit (Clontech)構(gòu)建重組質(zhì)粒并導(dǎo)入表達(dá)宿主菌E. coliBL21 (DE3), 37°C培養(yǎng)至OD值 0.4—0.6之間, 15°C 進(jìn)行冷休克, 然后加入IPTG(至終濃度為0.5mmol/L), 15°C低溫誘導(dǎo)20 h。之后離心, 收集總蛋白, 剩下的菌液超聲破碎, 收集上清, 然后將總蛋白及上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析。再取一部分樣品, SDS-PAGE電泳后, 用His-Tag Monoclonal Antibody一抗, 做Western blot分析, 經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、雜交及顯色, 分析蛋白的表達(dá)情況。

在熱耐受性實(shí)驗(yàn)中, 將帶有 pCold TF、Wap65-1-pCold TF、Wap65-2-pCold TF基因的E. coliBL21 (DE3)菌株, 接種后, 37°C擴(kuò)大培養(yǎng)使其OD值在 0.5, 然后加入 IPTG(終濃度 0.5mmol/L)低溫誘導(dǎo)20h 后, 取出測(cè)其 OD值均在 0.6—0.7, 在保證菌液濃度一致的條件下, 分別取1mL的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到45°C條件下, 熱處理 0、15、30、45和60min, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液濃度保持一致, 并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取 50μL菌液, 然后稀釋50倍后, 取100μL涂板, 37°C過(guò)夜培養(yǎng),計(jì)算每個(gè)培養(yǎng)板的菌落數(shù)目。運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行分析, 并計(jì)算細(xì)菌生存率, 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 Wap65-1和Wap65-2基因全長(zhǎng)cDNA序列分析

采用RACE的方法獲得Wap65-1和Wap65-2的cDNA序列全長(zhǎng)。登錄號(hào)分別為: KT356862和KT356863。Wap65-1 基因長(zhǎng)度為 1659bp, 其中 5′和 3′未參與編碼的堿基長(zhǎng)度分別為71bp和307bp, 開(kāi)放閱讀框(ORF)為 1281bp, 編碼區(qū)編碼 426個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量大小約為48.74kDa, 理論等電點(diǎn)為5.5, 3’端含有終止密碼子 TAA及一個(gè) ploy(A)尾巴。運(yùn)用Predictprotein分析藍(lán)點(diǎn)馬鮫的 Wap65-1蛋白功能位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)具有多個(gè)功能位點(diǎn)的蛋白序列, 包括2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(67—70和179—182), 2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(362—364和365—367); 8個(gè)酪蛋白磷酸化位點(diǎn)(40—43, 69—72, 93—96, 199—202, 286—289,293—296, 316—319及353—356); 5個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(113—120, 155—162, 185—191, 211—219及 302—309); 3個(gè) N-甲基化位點(diǎn)(62—67, 252—257及 420—425)。

Wap65-2基因長(zhǎng)度為 1725bp, 其中, 5′和 3′的未參與編碼的堿基長(zhǎng)度分別為83bp和331bp, 開(kāi)放閱讀框(ORF)為 1311bp, 編碼區(qū)編碼 436個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量大小約為48.45kDa, 理論等電點(diǎn)為5.7, 3’端含有終止密碼子 TAA及一個(gè) ploy(A)尾巴。運(yùn)用Predictprotein分析藍(lán)點(diǎn)馬鮫的 Wap65-2蛋白序列的功能位點(diǎn), 同樣發(fā)現(xiàn)具有多個(gè)功能位點(diǎn)的蛋白序列,包括3個(gè)N糖基化位點(diǎn)(78—81和208—211, 220—223), 7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(80—82, 179—181,277—279, 290—292, 334—336, 373—375 和 411—413), 11個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(51—54, 80—83,144—147, 251—254, 257—260, 277—280, 290—293,296—299, 303—306, 316—329及334—337), 2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(166—173和196—202), 3個(gè)肉蔻?；稽c(diǎn)(32—37, 240—245和387—392)。

2.2 Wap65-1和Wap65-2基因多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

使用 DNAMAN軟件對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫 Wap65-1和Wap65-2的氨基酸序列進(jìn)行同源序列分析, 結(jié)果如圖3所示, 藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorus niphonius)Wap65-1基因與花鱸(Lateolabrax japonicus)的同源性為 86%,與條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、金頭鯛(Sparusaurata)、黑棘鯛(Acanthopagrus schlegeli)的同源性為85%。利用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 結(jié)果表明, 藍(lán)點(diǎn)馬鮫 Wap65-1基因與花鱸的親緣關(guān)系比較近。藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorus niphonius)Wap65-2基因與條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、花鱸(Lateolabraxjaponicus)的同源性為 84%, 與南極真裸魚(yú)(Harpagifer antarcticus)、魚(yú)(Miichthys miiuy)的同源性為82%,與大菱鲆(Scophthalmus maximus)的同源性為 80%。利用 MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 結(jié)果表明,藍(lán)點(diǎn)馬鮫 Wap65-2與條石鯛、花鱸的親緣關(guān)系比較近。

圖2 Wap65-2開(kāi)放閱讀框核苷酸序列及推導(dǎo)編碼的氨基酸Fig.2 The open reading frame of full length cDNA of Wap65-2 gene and deduced amino acid sequence方框里ATG為起始密碼子, TAG為終止密碼子, 下劃線為信號(hào)肽

2.3 Wap65-1和Wap65-2在不同溫度下mRNA的表達(dá)特征分析

qRT-PCR結(jié)果表明: 藍(lán)點(diǎn)馬鮫 Wap65-1基因和Wap65-2 基因在 20°C、25°C、30°C、35°C 分別都有表達(dá), 而 Wap65-2的表達(dá)量隨著溫度的增高而明顯增高, 這一結(jié)果與所查文獻(xiàn)所得出的結(jié)果類(lèi)似, 在藍(lán)點(diǎn)馬鮫體內(nèi), 主要參與溫度調(diào)節(jié)的基因是Wap65-2。

圖3 藍(lán)點(diǎn)馬鮫Wap65-1和Wap65-2氨基酸序列與其它魚(yú)類(lèi)氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of Wap65-1 and Wap65-2 from S. niphonius with other fishes同種氨基酸用相同顏色背景表示; 缺失的氨基酸用“.”表示

圖4 藍(lán)點(diǎn)馬鮫Wap65-1和Wap65-2基因與其它魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Wap65-1 and Wap65-2 from S. niphonius and other fishes

圖5 藍(lán)點(diǎn)馬鮫幼體在不同溫度下Wap65-1和Wap65-2的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Expression characterization of Wap65-1 and Wap65-2 transcript in different temperature

2.4 藍(lán)點(diǎn)馬鮫 Wap65-1和 Wap65-2原核表達(dá)及 E.coli BL21 (DE3)熱耐受性實(shí)驗(yàn)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE檢測(cè)表明在相對(duì)分子質(zhì)量為100kDa處出現(xiàn)濃度較高的表達(dá)條帶, 由于 pCold TF載體自帶表達(dá)伴侶, 所以表達(dá)出的蛋白分子量應(yīng)減掉自帶分子伴侶的分子量(48kDa)。經(jīng)過(guò)計(jì)算后, 所得蛋白的分子量與預(yù)測(cè)一致, 并且用His-Tag Monoclonal Antibody一抗進(jìn)行Western blot分析(見(jiàn)圖6)。

通過(guò)對(duì)表達(dá) pCold TF、Wap65-1-pCold TF、Wap65-2-pCold TF 的E. coliBL21 (DE3)進(jìn)行 45°C 的熱處理, 在處理15、30、45和60min后, 細(xì)菌生存率分別是40%、22%、15%、7%, 以及75%、60%、45%、30%; 而對(duì)照組(含pCold TF)細(xì)菌生存率在上述各時(shí)間點(diǎn)分別是30%、17%、10%和5%(見(jiàn)圖 7), 這說(shuō)明熱刺激條件下, Wap65-1-pCold TF和Wap65-2-pCold TF對(duì)細(xì)菌都起到了一定程度的保護(hù)作用, 而 Wap65-2與空白對(duì)照組比較, 表明其保護(hù)作用尤為顯著。

圖6 藍(lán)點(diǎn)馬鮫Wap65基因的原核表達(dá)Fig.6 Prokaryotic expression of S. niphoniusa. Wap65兩種蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果; b. Wap65兩種蛋白的Western bolt分析結(jié)果

圖7 Wap65基因在高溫脅迫下保護(hù)實(shí)驗(yàn)Fig.7 The protection experiments of Wap65 under high temperature stress

3 討論

Wap65廣泛存在于硬骨魚(yú)類(lèi)的血漿蛋白, 參與了體內(nèi)多種機(jī)制的調(diào)控。本次研究通過(guò)克隆技術(shù)獲得了藍(lán)點(diǎn)馬鮫Wap65-1和Wap65-2的cDNA全長(zhǎng)序列,通過(guò) SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明, Wap65-1和Wap65-2的分子量大約為48kDa, 與理論大致吻合。兩個(gè)基因的N端都有19個(gè)氨基酸序列為信號(hào)肽序列,與花鱸及其它硬骨魚(yú)類(lèi)的 Wap65基因一樣。雖然Wap65-1與Wap65-2是具有同源性的, 但是, Wap65-2蛋白具有魚(yú)類(lèi)Wap65的典型結(jié)構(gòu)特征, 具有保守的7個(gè)疏水殘基和2個(gè)組氨酸殘基, 這些都與血紅素結(jié)合區(qū)的形成有關(guān)(史雨紅等, 2012), 而Wap65-1卻沒(méi)有。

通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸的分析, 發(fā)現(xiàn)在氨基酸的組成中, 兩種蛋白賴氨酸和組氨酸的含量比較高, 其氨基酸上含有多個(gè)功能位點(diǎn), 例如糖基化、磷酸化等,有助于進(jìn)一步研究蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能, 同樣也促進(jìn)了蛋白質(zhì)的主要定位。

通過(guò)對(duì)其進(jìn)化的分析, 結(jié)果表明: 藍(lán)點(diǎn)馬鮫的Wap65-1與花鱸親緣關(guān)系最近, Wap65-2與條石鯛、花鱸的Wap65-2親緣關(guān)系最近。

許多資料證明, Wap65-1與Wap65-2除了在分子特征的差異, 其表達(dá)量在不同溫度下, 也有差異。在高溫處理的藍(lán)點(diǎn)馬鮫幼體組織定量結(jié)果表明,Wap65-2的表達(dá)量隨著溫度的升高表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05), 與所查文獻(xiàn)結(jié)果一致。這就說(shuō)明了在藍(lán)點(diǎn)馬鮫體內(nèi), 其參與溫度調(diào)節(jié)的主要是Wap65-2。

魚(yú)類(lèi)Wap65-1和Wap65-2表達(dá)的差異性證明了它們之間的功能的差異性。通過(guò)對(duì)魚(yú)類(lèi)在進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)性的分析, 可以知道 Wap65-2仍然處于快速的進(jìn)化當(dāng)中, 其中也存在著一些選擇位點(diǎn), 稱(chēng)為正達(dá)爾文選擇位點(diǎn), 尤其是在 Wap65-2中該位點(diǎn)更多一些(Sarropoulouet al, 2010)。

目前, 對(duì) Wap65這類(lèi)蛋白的功能研究還不是很多, 除了與溫度有關(guān), 還與其它多種環(huán)境應(yīng)激因子有關(guān), 例如水的鹽度(Choiet al, 2008), 重金屬脅迫等有關(guān)(Georgeet al, 2004; Hayeset al, 2004; Berthetet al, 2005; Burgoset al, 2005)。另外, 許多數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn), 魚(yú)類(lèi)的免疫系統(tǒng)與 Wap65之間的關(guān)系非常密切,而且細(xì)菌、LPS也會(huì)誘導(dǎo)Wap65的上調(diào)(Peatmanet al,2008), 此外, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)NF-IL6存在于Wap65-2基因 5’調(diào)控區(qū), 表明免疫因子調(diào)節(jié)與 Wap65-2的表達(dá)可能相關(guān)。但是, 目前在功能和作用途徑仍不清楚。

本次研究成功克隆了藍(lán)點(diǎn)馬鮫 Wap65-1和Wap65-2基因的cDNA序列全長(zhǎng), 并通過(guò)不同溫度下其表達(dá)量的差異, 進(jìn)一步確定Wap65-2與溫度之間的關(guān)系, 在溫度調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要的作用, 為以后深入研究 Wap65基因在魚(yú)類(lèi)或者其它動(dòng)物的功能奠定了基礎(chǔ)。

史雨紅, 陳 炯, 高珊珊等, 2012. 花鱸Wap65-2基因的克隆、理化性質(zhì)及其表達(dá)與哈維氏弧菌感染的相關(guān)性. 動(dòng)物學(xué)研究, 33(5): 481—486

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