袁莉剛，朱峻峰，谷來鳳，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

老齡牦牛睪丸組織結(jié)構(gòu)研究

袁莉剛*，朱峻峰，谷來鳳，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

探討高原老齡牦牛睪丸組織結(jié)構(gòu)特點與其生殖機(jī)能的關(guān)系。采集9～13歲健康老齡牦牛睪丸組織，應(yīng)用組織化學(xué)染色和透射電鏡技術(shù)，觀察其細(xì)胞化學(xué)特點及結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果顯示，老齡牦牛睪丸體積及重量左側(cè)略大于右側(cè)，光鏡下睪丸被膜、間質(zhì)組織膠原纖維及網(wǎng)狀纖維豐富，小葉不明顯，Leydig 細(xì)胞散在于結(jié)締組織之間，生精小管不同程度退化，生精上皮層數(shù)為2～5層，細(xì)胞間隙變大，部分脫落，Sertoli 細(xì)胞低矮，細(xì)胞質(zhì)較少。電鏡觀察Sertoli 細(xì)胞核外形不規(guī)則，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈疏松的泡狀，次級溶酶體增加，體積增大。相鄰Sertoli 細(xì)胞間沒有觀察到并行的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層和細(xì)絲束這一血-睪屏障所特有外質(zhì)特化區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)，部分生精小管固有膜膠原纖維增生，上皮皺縮；Leydig 細(xì)胞內(nèi)脂滴異常豐富，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間存在緊密連接。間質(zhì)組織偶有肥大細(xì)胞，間質(zhì)血管及生精小管固有膜中PAS及AB-PAS陽性反應(yīng)明顯。老齡牦牛Sertoli 細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)異常，血-睪屏障中Sertoli 細(xì)胞間的連接處缺陷，且Sertoli 細(xì)胞與基膜連接的改變可能影響了Sertoli 細(xì)胞和生精細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而抑制了生精細(xì)胞的功能。

牦牛；老齡；睪丸；組織化學(xué)；超微結(jié)構(gòu)

人或動物進(jìn)入老齡后器官氧化應(yīng)激性增加，炎癥反應(yīng)敏感，細(xì)胞衰老加速以及細(xì)胞損傷反應(yīng)改變，由此會導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，器官功能障礙等[1]。哺乳動物睪丸是一個耗氧量大、不耐缺血的器官，主要功能是合成類固醇激素和精子的生成。目前關(guān)于老齡化睪丸的研究資料主要集中于人或?qū)嶒瀯游?如大鼠、小鼠等)，對于高海拔地區(qū)老齡化人或動物的研究資料很少。研究表明，在人或動物隨著年齡增加睪丸功能退化與其形態(tài)改變密切相關(guān)，包括生精功能的退化、管周組織及間質(zhì)組織的纖維化以及睪丸Leydig 細(xì)胞數(shù)量的下降等[2-3]。研究表明，缺氧對雄性生育能力的抑制不可忽視，睪丸局部血液循環(huán)中氧含量較低，可導(dǎo)致各種酶及蛋白質(zhì)降解能力降低，精子生成數(shù)量減少[4]。V.Verratti等[5]對不同年齡大鼠睪丸蔓狀靜脈叢的細(xì)胞氧化應(yīng)激研究表明，高原環(huán)境中老齡大鼠蔓狀靜脈叢對缺氧敏感性反應(yīng)降低，認(rèn)為在長期缺氧環(huán)境生活的老年大鼠可能存在特殊的適應(yīng)性機(jī)制，對氧化應(yīng)激反應(yīng)降低也許是老化后對低氧環(huán)境的適應(yīng)。高原地區(qū)，公牦牛在3歲進(jìn)入繁殖群配種期，配種年齡為4～8 歲，此時生殖能力較強(qiáng)，8、9歲以后逐漸老齡化，繁殖能力迅速減退[6]，近年來，關(guān)于成年牦牛睪丸形態(tài)及生物學(xué)方面的研究較多，但是長期生活在高海拔地區(qū)的老齡牦牛睪丸組織結(jié)構(gòu)特征尚未見報道。本研究應(yīng)用組織化學(xué)染色和透射電鏡技術(shù)，觀察9～13歲健康老齡化高原牦牛睪丸組織細(xì)胞化學(xué)特點及結(jié)構(gòu)特征，分析其與生殖生理特性的關(guān)系，為進(jìn)一步探究高原地區(qū)人或動物的衰老機(jī)制提供形態(tài)學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

組織樣采集自青海省大通牦牛養(yǎng)殖戶，9～13歲健康老齡牦牛9只，通過外科去勢手術(shù)采集睪丸，根據(jù)不同研究方法取樣固定。

1.2 組織化學(xué)樣本制備和觀察

組織樣品切成1 cm×1 cm×0.6 cm大小，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm，Masson三色染色(亮綠)，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)綠色，細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，紅細(xì)胞呈紅色；Gomori銀染顯示網(wǎng)狀纖維為灰色；蘇木素-伊紅復(fù)染后呈棕紅色。甲苯胺藍(lán)染色，肥大細(xì)胞呈紫藍(lán)色；PAS染色顯示糖原，紅色為陽性分布；AB-PAS染色顯示酸性黏蛋白呈藍(lán)色，中性黏蛋白呈紅色。

1.3 電鏡樣本制備和觀察

樣品切成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm組織塊，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液固定24 h，1%鋨酸后固定，丙酮乙醇梯度脫水，Epon812包埋，LKB8800型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，日本JEM-100CX透射電子顯微鏡觀察照相。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測量每一年齡牦牛睪丸大體解剖特征指數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。切片在NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行照相。每組隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取6個不重復(fù)視野(×400)，用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計每個視野下Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞數(shù)、生精小管外管徑、生精小管橫截面積及平均間質(zhì)組織面積。

2 結(jié) 果

2.1 老齡牦牛睪丸解剖結(jié)構(gòu)特點

老齡牦牛睪丸結(jié)締組織發(fā)達(dá)，去掉陰囊后眼觀顏色泛白或略黃，解剖學(xué)特征統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，睪丸大小為5.31 cm×3.60 cm×3.34 cm，左側(cè)單體睪丸長(縱)徑、短(橫)徑、厚徑及重量均略大于右側(cè)(表1)。

2.2 老齡牦牛睪丸光鏡結(jié)構(gòu)特點

光鏡下睪丸表面有一層富含膠原纖維的結(jié)締組織白膜，膜內(nèi)血管管壁膠原纖維明顯，實質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織發(fā)達(dá)，無明顯睪丸小隔及睪丸縱隔，間質(zhì)內(nèi)血管管壁膠原纖維豐富(圖1A～1C)；Leydig胞核呈圓形、橢圓形，核膜清晰明顯，散在于豐富的膠原纖維及網(wǎng)狀纖維之間(圖1C～1F)。

表1 老齡牦牛睪丸解剖特征指數(shù)(x-±s，n=9)

部位Location重量/gWeight長徑/cmDolicho-diameter短徑/cmBrachy-diameter厚徑/cmHadro-diameter左側(cè)Left118.25±3.075.38±0.303.67±1.033.44±0.32右側(cè)Right111.21±3.115.24±0.193.53±1.053.24±0.78均值A(chǔ)verage114.23±3.095.31±0.253.60±1.043.34±0.55

圖A～C示老齡牦牛睪丸結(jié)締組織(Masson染色)；圖D示生精上皮(HE染色)；圖E、F為生精小管外周網(wǎng)狀纖維(Gomori染色)；圖G示睪丸間質(zhì)肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán)染色)；圖H示生精小管及間質(zhì)糖原(PAS染色)；圖I示生精小管內(nèi)糖蛋白(AB-PAS染色)。A.被膜下動脈血管；C.毛細(xì)血管；CF.膠原纖維；Mc.肥大細(xì)胞；Gly.糖原；RF.網(wǎng)狀纖維；SA.小動脈；Sc.Sertoli細(xì)胞；St.精子細(xì)胞；Ps.初級精母細(xì)胞；Sz.精子；ST.生精小管；TA.睪丸被膜Fig.A-C.Aging yak teitis stained by Masson；Fig.D.Seminiferous tubule of aging yak stained by H&E；Fig.E，F(xiàn).Seminiferous tubule of aging yak stained by Gomori；Fig.G.Mast cell in the interstitium stained by toluidine blue；Fig.H.Aging yak teitis stained by PAS；Fig.I.Aging yak teitis stained by AB-PAS.A.Artery；C.Capillaries；CF.Collagen fiber；Mc.Mast cell；Gly.Glycogen；RF.Reticular fiber；SA.Small artery vein；Sc.Sertoli cells；St.Spermatidis；Ps.Primary spermatocyte；Sz.Spermatozoa；ST.Seminiferious tubule；TA.Tunica albuginea圖1 老齡牦牛睪丸組織的光鏡結(jié)構(gòu)Fig.1 Light micrograph of the aging yak testis

老齡睪丸組織生精小管部分或完全退化。部分退化的生精小管中一些生精細(xì)胞脫落入管腔，部分精子也脫離上皮。退化程度大的生精小管管腔變大，基膜增厚，上皮細(xì)胞不完整，生精細(xì)胞數(shù)量減少的同時上皮細(xì)胞之間出現(xiàn)了細(xì)胞間隙，其在上皮中的位置和大小不定，較大的間隙出現(xiàn)在靠近生精小管內(nèi)腔的部位。Sertoli 細(xì)胞和前細(xì)線期精母細(xì)胞存在于基膜處(圖1C～1D)。

甲苯胺藍(lán)染色顯示間質(zhì)內(nèi)偶有肥大細(xì)胞呈紫藍(lán)色(圖1G)；PAS染色顯示在血管壁及生精小管固有膜有紅色陽性條帶分布，Sertoli 細(xì)胞及各級生精細(xì)胞無明顯陽性分布(圖1H)；AB-PAS染色顯示睪丸生精上皮Sertoli 細(xì)胞著色淡，為弱陽性；初級精母細(xì)胞及精子細(xì)胞呈紫紅色，精子頭部呈藍(lán)色(圖1I)。9～13歲牦牛睪丸間質(zhì)血管及生精小管固有膜中PAS及AB-PAS陽性反應(yīng)隨年齡逐漸增強(qiáng)(表2)。

年齡/年Age(year)生精小管橫截面積/μm2Seminiferoustubulearea生精小管外管徑/μmTheouterdiameteroftheseminiferoustubulesSertoli細(xì)胞數(shù)/個NumbersofSertolicellsLeydig細(xì)胞數(shù)/個NumbersofLeydigcells平均間質(zhì)組織面積/μm2Meaningareaofinterstitialtissue968946.71±275.46a233.45±20.68a16.18±4.35a13.27±7.68a15013.76±144.32a1072696.36±164.58a239.78±35.22a14.91±3.48a15.57±6.79a16288.82±167.56a1182384.55±262.89a242.11±45.17a13.94±3.46a12.31±10.22a16829.61±201.58a1370846.62±196.74a232.37±50.32a12.17±5.27a11.59±9.47a19324.36±174.49b

同列所標(biāo)字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

Different letter in the same row means significant difference between the relative expressions(P<0.05)

老齡牦牛睪丸生精小管統(tǒng)計結(jié)果顯示(表2)，從9歲到13歲牦牛睪丸中，生精小管管徑及其橫截面積無明顯變化，間質(zhì)結(jié)締組織豐富，在13歲時平均間質(zhì)組織面積增加較其他年齡差異明顯，Sertoli 細(xì)胞隨年齡增加有減少的趨勢，Leydig細(xì)胞數(shù)量因為間質(zhì)形成有三角形或四角形局域變化較大，從2個左右到20個左右。

2.3 老齡牦牛睪丸超微結(jié)構(gòu)特點

電鏡下，老齡牦牛睪丸Sertoli 細(xì)胞及生精細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為典型不規(guī)則、松散的泡狀結(jié)構(gòu)，Sertoli細(xì)胞靠近基膜排列，核呈多邊形，核仁不明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及脂質(zhì)體，近腔面有較多體積較大的次級溶酶體，形狀不規(guī)則，內(nèi)含有異質(zhì)性成分和類脂褐素等，高爾基體以小的堆疊小囊形式存在，發(fā)育不完全(圖2A)。相鄰Sertoli細(xì)胞胞膜下線粒體豐富，不規(guī)則囊泡散在，但沒有觀察到Sertoli細(xì)胞之間的連接，血睪屏障的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點不明顯；雖然相鄰的Sertoli 細(xì)胞質(zhì)膜中偶爾能夠看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，但是缺乏并行的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層和細(xì)絲束這一血睪屏障所特有外質(zhì)特化區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖2B、2C)。睪丸間質(zhì)組織可見少量纖維細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)較少，間質(zhì)毛細(xì)血管管壁內(nèi)皮細(xì)胞核不規(guī)則，血管外周可見大量成束膠原原纖維(圖2D)間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞連接處仍可見緊密連接(圖2E)；Leydig 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡零散存在，脂褐素沉積，線粒體無明顯腫脹，常見脂滴異常豐富(圖2F)。

生精上皮下的固有膜層由基膜及I型膠原(collagen，Col Ⅰ)構(gòu)成一個非細(xì)胞區(qū)和管周肌樣細(xì)胞以及淋巴內(nèi)皮組成的細(xì)胞區(qū)組成，退化程度較大的生精上皮基膜增生明顯，凹凸不平，其上半橋粒結(jié)構(gòu)不明顯，外圍I型膠原纖維較少，膠原原纖維異常豐富(圖2A)；基本無退化的生精小管Sertoli細(xì)胞基部仍存在典型的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成的同心圓狀的結(jié)構(gòu)，基膜與Sertoli細(xì)胞間可見少量半橋粒結(jié)構(gòu)，固有膜包繞著一層較厚的I型膠原纖維，在肌樣細(xì)胞內(nèi)表面，形成一層不連續(xù)的基膜(圖2C)。

3 討 論

睪丸的發(fā)育與物種及個體年齡有關(guān)，不同動物的左、右單側(cè)睪丸存在差異性。日本猴、藏綿羊等動物左側(cè)睪丸均重于右側(cè)[7，8]，而公麝睪丸右側(cè)重于左側(cè)[9]；研究發(fā)現(xiàn)人及不同動物的睪丸體積和質(zhì)量隨著年齡的增長發(fā)育而逐漸增加[7-10]。本研究中老齡牦牛睪丸左側(cè)略重于右側(cè)，去掉陰囊后重量為114 g左右，與資料中成年牦牛睪丸重量統(tǒng)計數(shù)字相近[11]，表明在成年至老齡牦牛睪丸重量沒有明顯的變化。高原低氧環(huán)境下睪丸的重量及組織形態(tài)學(xué)發(fā)生改變其生精功能也會受到影響，睪丸重量的增加與生精小管上皮的發(fā)育有直接關(guān)系[12]，9歲到13歲牦牛睪丸生精小管管徑大小及生精小管橫截面積與朱俊峰[13]對青年牦牛睪丸的統(tǒng)計結(jié)果一致，因此，生精小管管徑及橫截面積大小隨牦牛年齡變化不明顯，其可能主要在于生精上皮發(fā)育形態(tài)的變化。

圖A.生精小管超微結(jié)構(gòu)；圖B.Sertoli 間連接處超微結(jié)構(gòu)；圖C.Sertoli 基部超微結(jié)構(gòu)；圖D.間質(zhì)組織超微結(jié)構(gòu)；圖E.間質(zhì)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)；圖F.Leydig細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。C.毛細(xì)血管；E.紅細(xì)胞；Ec.毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞；ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Fc.纖維細(xì)胞；G.高爾基器；L.溶酶體；Ley.Leydig細(xì)胞；Mi.線粒體；N.細(xì)胞核；Sc.Sertoli細(xì)胞；Sg.精原細(xì)胞；TP.固有膜Fig.A.The seminiferous tubule；Fig.B.The Sertoli cells；Fig.C.The base of Sertoli cell；Fig.D.Testis interstitial tissue；Fig.E.The capillaries in interstitium；Fig.F.Leydig cells in the interstitium.C.Capillarie；E.Erythrocyte；Ec.Endothelium cell；ER.Endoplasmic reticulum；Fc.Fiber cells；G.Golgi apparatus；L.Lysosome；Ley.Leydig cells；Mi.Mitochondrion；N.Necleus；Sc.Sertoli cells；Sg.Spermatogonia；TP.Tunica propria圖2 老齡牦牛睪丸組織的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of the aging yak testis

近年來，肥大細(xì)胞與性腺生殖生理的關(guān)系引起人們的注意。研究表明，肥大細(xì)胞在多個器官的纖維化過程中發(fā)揮作用，其在男性不育患者的睪丸中數(shù)量明顯增加[14]。M.Nistal等[15]研究表明，人睪丸在不同發(fā)育年齡段中，嬰兒期及青春期睪丸及附睪結(jié)締組織發(fā)育時期，肥大細(xì)胞數(shù)才增加，說明肥大細(xì)胞數(shù)量的變化與結(jié)締組織發(fā)育相關(guān)。本研究顯示9歲到13歲牦牛睪丸中，結(jié)締組織豐富，13歲時間質(zhì)組織面積、膠原纖維及網(wǎng)狀纖維增加明顯，但光鏡下肥大細(xì)胞在間質(zhì)組織中偶見，數(shù)量無明顯增加，纖維細(xì)胞較少，說明9歲以后并不是牦牛睪丸間質(zhì)結(jié)締組織發(fā)育時期，是否在這個年齡以前結(jié)締組織就已經(jīng)開始增加有待于進(jìn)一步研究。

睪丸Sertoli 細(xì)胞是生精小管中唯一的體細(xì)胞，為精子生成提供形態(tài)、營養(yǎng)及激素支持。研究表明老年人及老齡大鼠睪丸曲細(xì)精管發(fā)生了局部乃至全部的退化，包括局部生精小管的萎縮、精原細(xì)胞或初級精母細(xì)胞發(fā)育受阻以及Sertoli 細(xì)胞形態(tài)改變[2-4]。老齡動物睪丸Sertoli 細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的改變可致使細(xì)胞功能發(fā)生改變。成年期大鼠睪丸生精上皮Sertoli 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體的含量通常很豐富，其合成和分泌一些生精細(xì)胞所必需的蛋白。老齡后Sertoli 細(xì)胞缺乏豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核仁輪廓不規(guī)則[16]。本研究中老齡牦牛睪丸Sertoli 細(xì)胞及生精細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為典型的不規(guī)則、松散的泡狀結(jié)構(gòu)，表明其合成及分泌功能發(fā)生了改變。老齡挪威灰鼠Sertoli 細(xì)胞內(nèi)次級溶酶體數(shù)量增加引起其細(xì)胞器功能的相對減退，溶酶體體積的增大會導(dǎo)致對代謝產(chǎn)物分解力的降低，如脂褐素聚集[17]。研究表明老齡動物睪丸組織中觀察到脂褐素的沉積可能是其降解通路的降低或氧化應(yīng)激引起[18]。本研究中老齡牦牛睪丸組織中溶酶體體積變大，呈異質(zhì)性，散在于Sertoli 細(xì)胞胞質(zhì)中，這也可能是其分解能力降低，周圍類脂褐素顆粒較多的原因。據(jù)報道，成年人睪丸Sertoli 細(xì)胞的特征是核仁大居中及細(xì)胞質(zhì)中大量的脂滴，季節(jié)性發(fā)情動物在非發(fā)情季節(jié)，即生精小管處于退化的時期，Sertoli 細(xì)胞中脂滴的數(shù)量明顯增加[16，18]。缺乏維生素E會導(dǎo)致精子發(fā)育不完整、生精細(xì)胞退化以及Sertoli 細(xì)胞中脂滴數(shù)量的增加[19]。然而，本研究中發(fā)生退化的生精小管中Sertoli 細(xì)胞并沒有脂滴積聚的現(xiàn)象，這與H .Jiang等[16]在老年人睪丸的觀察相一致。同樣，組織化學(xué)觀察雖然在血管壁及生精小管固有膜陽性條帶分布，但是Sertoli 細(xì)胞糖原及糖蛋白陽性反應(yīng)較弱，表明其組織糖蛋白酶含量減少或合成能力較低，這與觀察到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體含量的較少相一致。

血睪屏障位于間質(zhì)毛細(xì)血管腔和曲細(xì)精管腔之間，哺乳動物成熟睪丸血睪屏障由Sertoli細(xì)胞之間膜性囊泡，肌動蛋白絲及緊密連接共同形成；Sertoli 細(xì)胞質(zhì)膜下微絲束和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池構(gòu)成的細(xì)胞外質(zhì)特化(Ectoplasmic specialization，ES)結(jié)構(gòu)，其與緊密連接等共同構(gòu)成連接復(fù)合體，是哺乳動物血睪屏障建立和完善的重要標(biāo)志[20]。更多研究表明，老年人睪丸Sertoli 細(xì)胞形態(tài)異常影響血睪屏障功能[21]。本研究中相鄰Sertoli細(xì)胞血睪屏障的結(jié)構(gòu)特點不明顯；雖然間質(zhì)毛細(xì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接完整，相鄰的Sertoli 細(xì)胞質(zhì)膜中偶爾能夠看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，但是缺乏并行的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層和細(xì)絲束這一血睪屏障所特有外質(zhì)特化區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)。研究表明，外質(zhì)特化是精子與Sertoli 細(xì)胞粘連的部位[20]。老齡動物中，血睪屏障改變會引起管腔環(huán)境的異常，進(jìn)一步導(dǎo)致生精細(xì)胞發(fā)育障礙[22]。因此，老齡牦牛睪丸Sertoli 細(xì)胞外質(zhì)特化區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)的不完整可能是細(xì)胞機(jī)能老化的組織結(jié)構(gòu)特征之一。

哺乳動物生精上皮隨著年齡的增長會逐步發(fā)生變化。報道認(rèn)為老年人和老齡化挪威灰鼠睪丸生精上皮的基膜增厚，增厚的基膜與血睪屏障體系中生精小管的一些變化相輔存在，進(jìn)一步引起生精細(xì)胞的減少[16-17]。C.Paul等[22]認(rèn)為由于老齡血-睪屏障的改變，睪丸免疫微環(huán)境受到影響，處于退化過程的輸精管內(nèi)精子抗原的含量會上升。通過光學(xué)和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)老齡挪威灰鼠睪丸生精上皮形態(tài)的改變是導(dǎo)致類固醇生成和精子發(fā)生下降的根本原因[17]。本研究中退化程度大的生精小管管腔變大，基膜增厚，上皮細(xì)胞不完整，生精細(xì)胞數(shù)量減少的同時上皮細(xì)胞之間出現(xiàn)了細(xì)胞間隙，較大的間隙出現(xiàn)在靠近生精小管內(nèi)腔的部位。電鏡下增生明顯的生精小管，外圍I型膠原纖維較少，膠原原纖維異常豐富，大多數(shù)發(fā)生退化的生精小管中生精細(xì)胞的數(shù)量減少。這與老年人生精小管形態(tài)變化一致，認(rèn)為是生精小管漸進(jìn)性退化逐漸萎縮的結(jié)構(gòu)特點[16]。O.T.Pop等[23]認(rèn)為隨著年齡的變化基膜增厚，透過生精上皮的物質(zhì)減少，這可能導(dǎo)致生精細(xì)胞減少。因此，老齡牦牛血-睪屏障中Sertoli 細(xì)胞間的連接處缺陷，且Sertoli 細(xì)胞與基膜連接的改變可能影響了Sertoli 細(xì)胞和生精細(xì)胞之間的相互作用，阻礙了生精細(xì)胞的自我更新能力，這種變化是否引起睪丸免疫微環(huán)境的改變有待于進(jìn)一步研究探索。

Leydig細(xì)胞是睪丸間質(zhì)組織中最重要的內(nèi)分泌細(xì)胞，其形態(tài)和數(shù)量在動物不同發(fā)育階段差異較大。J.B.Kerr等[24]報道成年大鼠睪丸的Leydig細(xì)胞脂滴減少且沒有外層纖維細(xì)胞包圍。研究表明，小鼠睪丸細(xì)胞內(nèi)Leydig脂滴量逐漸增多，雄激素的合成能力則開始下降，直至呈靜息狀態(tài)[25]。本研究中老齡牦牛睪丸間質(zhì)纖維細(xì)胞很少，Leydig細(xì)胞脂滴異常豐富，脂褐素沉積，與R.Paniagua等[21]的研究相一致，Leydig細(xì)胞內(nèi)脂滴量的明顯降低可能與合成雄激素能力降低有關(guān)。線粒體腫脹與細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)[26]，本研究中老齡牦牛Leydig細(xì)胞并沒有明顯體現(xiàn)線粒體腫脹，也可能與長期生活在低氧環(huán)境中的老齡牦牛對缺氧應(yīng)激的敏感性下降有關(guān)。

研究表明，短吻鱷在出生后1周至5月齡，PAS陽性主要位于睪丸間質(zhì)結(jié)締組織、Leydig 細(xì)胞以及生精小管基膜，生精細(xì)胞的成熟伴隨著間質(zhì)組織增加，Leydig 細(xì)胞群的建立，PAS和AB-PAS陽性反應(yīng)區(qū)也會增加[27]；而在24～27月齡的小鼠，PAS在睪丸 Leydig 細(xì)胞以及基質(zhì)中會再次出現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)性[28]。AB、PAS陽性反應(yīng)的糖原、糖蛋白以及蛋白多糖很典型存在于結(jié)締組織、黏液以及基膜中，睪丸生精小管基膜的基本成份如層黏連蛋白是PAS特殊反應(yīng)陽性糖蛋白[27]。本研究中老齡牦牛睪丸間質(zhì)血管及生精小管固有膜中PAS及AB-PAS陽性反應(yīng)隨年齡逐漸增強(qiáng)，可能與間質(zhì)組織中結(jié)締組織合成增加相關(guān)。睪丸間質(zhì)結(jié)締組織含量的增加會引起睪丸組織纖維化，影響睪丸 Leydig 細(xì)胞分泌產(chǎn)物的輸送，進(jìn)而影響其對睪丸生精功能的調(diào)控作用[23]。因此，牦牛老齡化引起的生精功能下降與間質(zhì)結(jié)締組織、間質(zhì)面積及Leydig細(xì)胞數(shù)量、肥大細(xì)胞數(shù)量及其分泌能力之間的關(guān)系，尚需進(jìn)行內(nèi)分泌、繁殖生理等方面進(jìn)一步的研究。

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(編輯 白永平)

The Histologic Characters of Testis in Aging Yak

YUAN Li-gang*，ZHU Jun-feng，GU Lai-feng，YAN Zhen-long

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

This study was conducted to characterize the histologic structure of aging yak testis.The testis of aging yak in age from 9 to 13 years old were prepared for light and electron microscopy by histochemistry and transmission electron methods.The volume and weight of aging yak left testis were slightly larger than the right，and the observations made with the light microscope were obvious morphological changes of aging，the Leydig cells were scattered in the interstitial connective tissue which were abundant with collagen and reticular fiber between the seminiferous tubules，there were partly progressive regressed in the seminiferous epithelium and the epithelium were constructed 2-5 layers with contained large intercellular，the spermatogenic cells partially desquamated and Sertoli cells were low with less cytoplasm.The electron microscopic studies show that the Sertoli cells were irregularly shaped nuclei and the endoplasmic reticulum were represented as a loose，vesiculated network，and the lysosomes were large in shape and few in number.The typical morphological configuration of the blood-testis barrier as microfilaments constructed by the typical ectoplasmic specialization and actin filament between the adjacent Sertoli cells were not seen in aged yak.Partial lamina propria of seminiferous epithelium was shrinkage and hyperplasia of collagen fiber.The lipid droplets in Leydig cells were very rich，occasionally，the mast cell can be seen in the interstitial tissue.Moreover，there are closely connection between the adjacent interstitial capillary endothelial cells and the positive reaction of PAS and AB-PAS were obviously present throughout the basement membranes and the wall of interstitial blood vessels.Taken together，the structural abnormalities in Sertoli cells，the connection defects in blood-testis barrier and the basement membrane may affect the interaction between Sertoli cells and spermatogenic cells，thereby the functions of aging yak testis were inhibited.

yak；aging；testis；histochemistry；ultrastructure

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.024

2014-09-01

國家自然科學(xué)基金項目(31160488)；甘肅省自然科學(xué)研究基金(1010RJZA210)；甘肅省教育廳科技項目(0902B-03)

袁莉剛(1974-)，女，甘肅隴南人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail：yuan2918@126.com

S852.162

A

0366-6964(2015)05-0855-08

*通信作者：袁莉剛，Tel：0931-7631229