王 磊，曹平華，蔡 蓓，高 印，高 康，楊雨鑫，楊明明，袁 超，陳玉林*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100； 2.青海大學青海省畜牧獸醫(yī)科學院，西寧 810016；3.河南科技大學動物科技學院，洛陽471003； 4.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

轉(zhuǎn)內(nèi)切葡聚糖酶基因羅伊乳酸桿菌的構建及其肉雞飼喂效果驗證

王 磊1,2，曹平華1,3，蔡 蓓1，高 印1，高 康1，楊雨鑫1，楊明明1，袁 超4，陳玉林1*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100； 2.青海大學青海省畜牧獸醫(yī)科學院，西寧 810016；3.河南科技大學動物科技學院，洛陽471003； 4.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

本研究旨在構建可胞外分泌內(nèi)切葡聚糖酶，且具有降解β-葡聚糖能力的轉(zhuǎn)內(nèi)切葡聚糖酶基因羅伊乳酸桿菌，并對其進行肉雞飼喂效果驗證，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌在動物生產(chǎn)中的應用奠定基礎。采用PCR和酶切連接方法構建pLEM4157(cel) 載體，轉(zhuǎn)化Lactobacillus.reuteriXC1感受態(tài)細胞，進行聚丙烯胺凝膠電泳表達譜分析和內(nèi)切葡聚糖酶活性測定，同時測定其肉雞飼喂效果。結果表明，克隆的內(nèi)切葡聚糖酶基因大小為1 500 bp，經(jīng)測序比對，與已報道基因序列相似性為99%，氨基酸序列相似性為100%；Native-PAGE 和SDS-PAGE分析結果表明，內(nèi)切葡聚糖酶基因celW成熟肽在羅伊乳酸桿菌的蛋白分子量均為52 ku左右，與理論計算值相符；L.reuteripLEM4157(cel) 培養(yǎng)上清和胞內(nèi)上清內(nèi)切葡聚糖酶活性分別為(0.96±0.08)和(0.37±0.09) U·mL-1；L.reuteripLEM4157(cel) 對肉仔雞生長性能無顯著影響，但可顯著降低21日齡肉仔雞十二指腸、空腸pH，促進21日齡肉仔雞腎、法氏囊、胸腺和胰腺的生長發(fā)育，增加42 日齡肉仔雞的胸腺和胰腺指數(shù)，提高肉仔雞21日齡血清白球比、鈣、磷含量和42 日齡血清葡萄糖含量。L.reuteripLEM4157(cel) 成功分泌表達了內(nèi)切葡聚糖酶，具有降解羧甲基纖維素的能力和一定的肉雞飼喂效果。

轉(zhuǎn)基因；內(nèi)切葡聚糖酶基因；羅伊乳酸桿菌；飼喂效果；肉雞

目前，畜牧業(yè)養(yǎng)殖嚴重依賴抗生素，其被廣泛地用于治療疾病或作為生長促進劑，從而造成抗生素的濫用和誤用，同時使畜禽和人類自身產(chǎn)生極強的耐藥性，嚴重威脅到人類的健康[1]。乳酸桿菌是動物胃腸道的優(yōu)勢細菌之一[2-3]，其可以產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸降低腸道pH[4]或與致病菌競爭腸上皮細胞黏附位點，來抑制致病菌的生長[5]，同時腸道來源的乳酸桿菌具有極強的黏附和定植能力以及耐酸、耐膽鹽特性[6]。因此乳酸桿菌作為抗生素替代品或飼料添加劑被廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖，或作為載體(宿主)來表達外源基因和抗原[7-8]。

β-葡聚糖是谷物細胞壁的主要成分，具有極強的吸附和螯合能力，嚴重阻礙動物對各種營養(yǎng)素的消化和吸收，是單胃動物日糧中主要的抗營養(yǎng)因子之一[9-10]，同時由于單胃動物(如豬和家禽)缺少或很少分泌 β-葡聚糖酶，大量營養(yǎng)素被排泄到體外，造成了對環(huán)境的污染。在實際生產(chǎn)中，人們往往通過在飼料中添加相應的外源酶制劑來消除這種抗營養(yǎng)因子的不良影響。許多研究已經(jīng)表明，添加 β-葡聚糖酶，可以有效地提高養(yǎng)分消化吸收效率，減少內(nèi)源損失，改善動物的生產(chǎn)性能[11-12]。但外源酶制劑的添加，只能獲得短期效應，無形之中也增加了飼料成本[13]，而且其在飼料制作過程中，易因高溫而失活[14]。因此，運用基因工程技術，構建能夠表達和分泌水解酶類的乳酸桿菌重組菌，將是一種可替代的和廉價的策略[15]。

在本研究中，我們通過克隆枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因，構建了既能降解β-葡聚糖又具有益生特性的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌，并對其異源酶的生產(chǎn)和肉雞飼喂效果進行了測定和驗證，以此來改善肉仔雞養(yǎng)分消化利用率、提高其生產(chǎn)性能、減少腸道疾病，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

大腸桿菌 DH5α購自全式金生物科技(北京)有限公司；B.subtilisWL001(GenBank No.：KJ528401)和L.reuteriXC1(GenBank No.：KJ528405) 由本實驗室篩選鑒定并保存；pMD19-T載體購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。大腸桿菌—乳酸菌穿梭質(zhì)粒 pLEM415 由法國 Mr.Michel Fons 惠贈?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌接種LB液體或固體培養(yǎng)基，37 °C 220 r·min-1振蕩或靜置培養(yǎng)。乳酸桿菌接種MRS液體或固體培養(yǎng)基，37 °C 厭氧靜置培養(yǎng)?？股貪舛龋喊逼S青霉素(Sigma)100 μg·mL-1，紅霉素(Sigma) 5 μg·mL-1。

1.2 工具酶和主要試劑

T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶購自美國 Promega 公司，DNA marker(Cat：N3232S)均購自美國 NEB 公司，DNA marker(Cat：D501A)和rTaqDNA 聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司，細菌基因組 DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購自美國 Omega 公司，蛋白胨、酵母抽提物購自 OXOID 公司，瓊脂粉、葡萄糖、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、剛果紅購自西安沃爾森生物有限公司和楊凌三利化玻儀器公司，甘油購自美國 Sigma 公司。

1.3 細菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA的提取

參照 Omega 公司細菌基因組 DNA 提取試劑盒操作說明提取枯草芽孢桿菌基因組DNA；參照Omega公司質(zhì)粒小量提取試劑盒操作說明提取細菌質(zhì)粒DNA。

1.4 內(nèi)切葡聚糖酶基因的擴增及鑒定

根據(jù)GenBank(NC：000964.2)提供的序列，利用軟件 Primer Premier 5.0 設計引物C1和 C2，并委托南京金斯瑞生物工程技術有限公司合成(下同)。引物序列：C1：5′-ATGAAACGGTCAAT-CTCGATTTT-3′，C2：5′-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAATCA-3′。以B.subtilisWL001基因組DNA為模板，PCR 擴增內(nèi)切葡聚糖酶基因celW，反應條件： 95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。片段回收純化后與 pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液 PCR和酶切鑒定后送南京金斯瑞生物工程技術有限公司測序驗證，陽性克隆命名為pMD19-T-celW。

1.5 乳酸桿菌原核表達載體的構建及分泌表達

1.5.1 乳酸桿菌原核表達載體的構建 根據(jù)GenBank(No.：M76708.1；M60178.1)提供的序列，委托南京金斯瑞生物技術有限公司合成包含乳酸脫氫酶啟動子PidhL、Usp45基因信號肽SPusp45和增強子LEISS的融合片段，并在上游5′端 引入BamH I酶切位點，下游3′端 引入SpeI酶切位點，雙酶切后連接pLEM415，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得pLEM4155；以陽性克隆pMD19-T-celW為模板，用引物對C4(5′引入SpeI酶切位點)/C5(3′引入XbaI酶切位點)PCR擴增celW基因成熟肽celWM，反應條件同上。引物序列：C4：5′-CGGACTAGTCAGGGACAAAAACGCCAG-3′，C5：5′-TCCCTCTAGATAATTTGGTTCTGTTCCCC-AAATCA-3′(斜體部分為酶切位點)。celWM片段回收純化后，經(jīng)SpeI和XbaI雙酶切，連接pLEM4155，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得pLEM4157(cel)，酶切鑒定、測序確保閱讀框正確。

1.5.2 pLEM4157(cel) 在羅伊乳酸桿菌中的分泌表達 重組載體質(zhì)粒 pLEM4157(cel) 轉(zhuǎn)化羅伊乳酸桿菌感受態(tài)細胞，PCR鑒定正確后，接種5 μg·mL-1紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h。離心收集菌液上清和菌體細胞，PBS沖洗重懸菌體細胞，超聲波破碎。菌液上清用超濾管濃縮后分別進行SDS-PAGE和Native-PAGE分析以及CMC-Na平板檢測。

1.5.3 重組菌pLEM4157(cel) 酶活分析 以CMC-Na為底物，采用DNS法，分別對菌液上清和破碎后菌體上清進行酶活測定。

1.6 肉雞飼養(yǎng)試驗

1.6.1 供試菌種制備 重組羅伊乳酸桿菌的制備參照L.J.Mappley 等2013年的方法進行[16]。對重組羅伊乳酸桿菌進行平板劃線，挑取單菌落接種10 mL MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧靜置培養(yǎng) 16 h 后，1∶100比例接種100 mL MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧靜置培養(yǎng) 16 h 后，3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體細胞。菌體細胞用無菌水沖洗3遍后，重懸于20 mL 無菌水并定容到2 000 mL，使菌體細胞濃度達到2.5 × 108cfu·mL-1(細胞濃度的測定采用梯度稀釋，平板計數(shù)的方法進行)，分為4等份(500 mL·份-1)。

1.6.2 試驗動物及試驗設計 試驗采用單因子完全隨機設計。選取體重相近、健康的240 只1日齡AA肉雞，隨機分為3組，每組4個重復，每個重復20只雞，按常規(guī)程序免疫。試驗期42 d，分為育雛期(1～21 d)和育成期(21～42 d)兩個階段。第I組飼喂基礎日糧；第II組飼喂基礎日糧并飲水飼喂L.reuteripLEM4155；第III組飼喂基礎日糧并飲水飼喂L.reuteripLEM4157(cel)。

1.6.3 基礎日糧及飼養(yǎng)管理 試驗基礎日糧采用大麥-小麥型日糧，日糧組成見表1。采用籠養(yǎng)方式，自由采食，常規(guī)程序飼養(yǎng)管理。

1.6.4 生產(chǎn)性能指標測定 在整個試驗期，準確記錄每個重復肉仔雞每天的投料量，并收集剩余料(剔除羽毛、皮屑和糞便)稱重，計算飼料消耗量和平均日采食量。在肉仔雞第1、21 和42天分別進行空腹稱重，計算平均日增重。最后根據(jù)日采食量和日增重計算飼料轉(zhuǎn)化率。

1.6.5 腸道pH測定 分別在肉仔雞21和42日齡時，每個重復隨機選取1只肉仔雞，頸部放血處死后，解刨剝離十二指腸、空腸、回腸，每個腸段選取3個不同的點，用手持數(shù)顯pH計，測定pH。

1.6.6 免疫器官指數(shù)的測定 在試驗開始后的第21和42 天，每重復組隨機抽取1只雞，稱量活體重，頸靜脈放血處死后，分別采摘心、胸腺、胰腺、法氏囔、肝、腎和脾并稱重，測定免疫器官指數(shù)。

1.6.7 血液生理生化指標測定 在試驗開始后的第21 和42天，每重復組隨機抽取1只雞，頸靜脈放血處死后，收集血液制備血清，置于-20 ℃低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩Ｑ逅蜅盍韪咝录夹g示范區(qū)醫(yī)院測定血清生理生化指標。

表1 試驗日糧組成

Table 1 Composition of the experimental diet

%

1.預混料(/kg 日糧)：1～21 d：Mn 120 mg，F(xiàn)e 100 mg，I 0.7 mg，Zn 100 mg，Se 0.3 mg，Cu 8 mg，VA 8 000 IU，VE 20 IU，VD31 000 IU；核黃素 8.0 mg，VK 0.5 mg，硫胺素 2.0 mg，煙酸 35 mg，VB63.5 mg，生物素 0.18 mg，VB120.01 mg，泛酸 10.0 mg，抗氧化劑 0.4 g，葉酸 0.55 mg，氯化膽堿 1 g；22～42 d：Mn 60 mg，F(xiàn)e 60 mg，I 0.6 mg，Mn 80 mg，Se 0.3 mg，Cu 8 mg，VA 6 000 IU，VE 30 IU，VD3500 IU，核黃素 5.0 mg，VK 0.5 mg，硫胺素 2.0 mg，煙酸 30 mg，VB63.0 mg，生物素 0.15 mg，VB120.01 mg，泛酸 10.0 mg，抗氧化劑 0.5 g，葉酸 0.55 mg，氯化膽堿 1 g

1.The premix provided per kilogram of diets：1-21 d：Mn 120 mg，F(xiàn)e 100 mg，I 0.7 mg，Zn 100 mg，Se 0.3 mg，Cu 8 mg，VA 8 000 IU，V E 0 IU，VD31 000 IU，flavin 8.0 mg，VK 0.5 mg，thiamine 2.0 mg，niacin 35 mg，VB63.5 mg，biotin 0.18 mg，VB120.01 mg，pantothenic acid 10.0 mg，antioxidant 0.4 g，folic acid 0.55 mg，Choline-Cl 1 g；22-42 d：Mn 60 mg，F(xiàn)e 60 mg，I 0.6 mg，Zn 80 mg，Se 0.3 mg，Cu 8 mg，VA 6 000 IU，VE 30 IU，VD3500 IU，flavin 5.0 mg，mVK 0.5 mg，thiamine 2.0 mg，niacin 30 mg，VB63.0 mg，biotin 0.15 mg，VB120.01 mg，pantothenic acid 10.0 mg，antioxidant 0.5 g，folic acid 0.55 mg，Choline-Cl 1 g

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 和 SPSS 13.0 進行 One-way ANOVA 統(tǒng)計分析，采用 Duncan 法檢測分析各組差異顯著性。

2 結 果

2.1 內(nèi)切葡聚糖酶基因的擴增及鑒定

如圖1泳道1和2所示，擴增條帶大小1 500 bp，與目的條帶預期大小一致；如圖1泳道3和4所示，BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ雙酶切 pMD19-T-cel15 質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為 1 500 bp 的目的片段和大小為 2 693 bp 的空載片段，表明celW成功連接 T 載體。測序結果經(jīng) Blast 比對發(fā)現(xiàn)，克隆序列與已報道內(nèi)切葡聚糖酶基因序列相似性為99%，氨基酸序列相似性為100%，celW基因克隆成功。

M1.DNA相對分子質(zhì)量標準DL 2000；1、2.內(nèi)切葡聚糖酶基因 celW擴增片段； M2.DNA相對分子質(zhì)量標準；3、4.BamH Ⅰ+ Hind Ⅲ雙酶切 pMD19-T-celW 質(zhì)粒片段M1.DL 2000 DNA ladder；1，2.Endoglucanase gene celW fragment；M2.1 kb DNA ladder；3，4，pMD19-T-celW fragments digested by BamH Ⅰ+Hind Ⅲ圖1 內(nèi)切葡聚糖酶基因的擴增及鑒定Fig.1 Amplification and identification of endoglucanase gene celW

2.2 乳酸桿菌原核表達載體的構建

PCR擴增celW基因成熟肽編碼序列celWM，通過相應的酶切位點，克隆到 pLEM4155 載體中，產(chǎn)生 pLEM4157(cel) 載體(圖2)。pLEM4157(cel) 轉(zhuǎn)化E.coilDH5α 質(zhì)粒，經(jīng)SpeⅠ和XbaⅠ雙酶切，凝膠電泳檢測后，產(chǎn)生大小為 1 413 bp 的目的片段和 6 640 bp的骨架片段(圖3)，經(jīng)測序鑒定閱讀框完整正確，表明載體構建成功。

圖2 pLEM4157(cel) 圖譜Fig.2 pLEM4157(cel) map

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.Spe Ⅰ + Xba Ⅰ雙酶切pLEM4157(cel) 質(zhì)粒M.1 kb DNA ladder；1.pLEM4157(cel) digested by Spe Ⅰ + Xba Ⅰ圖3 pLEM4157(cel) 雙酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme analysis of pLEM4157(cel)

2.3 pLEM4157(cel) 在羅伊乳酸桿菌中的分泌表達及CMC-Na平板檢測

如圖 4所示，L.reuteripLEM4157(cel) 培養(yǎng)液經(jīng)超濾管濃縮后，SDS-PAGE(泳道3)和 Native-PAGE(泳道4)凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在 50 ku 附近呈現(xiàn)特異性條帶，與理論計算大小相符(目的片段大小約為 52.228 ku)，判斷該條帶為重組蛋白產(chǎn)物帶。 CMC-Na平板活性檢測(圖5)表明，L.reuteripLEM4157(cel) 重組菌胞外上清和胞內(nèi)上清均具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，進一步說明內(nèi)切葡聚糖酶在L.reuteripLEM4157(cel) 中被分泌到胞外，并具有一定的活性。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.L.reuteri XC1 培養(yǎng)液上清蛋白SDS-PAGE；2.L.reuteri pLEM4155 培養(yǎng)液上清蛋白SDS-PAGE；3.L.reuteri pLEM4157(cel) 培養(yǎng)液上清蛋白SDS-PAGE；4.L.reuteri pLEM4157(cel) 培養(yǎng)液上清蛋白Native-PAGEM.14-120 ku Blue PlusTM Ⅱ Protein Marker；1.SDS-PAGE analysis of the culture supernatant proteins of L.reuteri XC1；2.SDS-PAGE analysis of the culture supernatant proteins of L.reuteri pLEM4155；3.SDS-PAGE analysis of the culture supernatant proteins of L.reuteri pLEM4157(cel)；4.Native-PAGE analysis of the culture supernatant proteins of L.reuteri pLEM4157(cel)圖4 L.reuteri XC1轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清蛋白PAGE分析Fig.4 The culture supernatant proteins of L.reuteri XC1 transformants analyzed by PAGE

a.培養(yǎng)液上清；b.菌體破碎后胞內(nèi)上清。1.L.reuteri XC1菌株；2.L.reuteri pLEM4155菌株；3.L.reuteri pLEM4157(cel) 菌株a.Culture supernatant；b.Cell supernatant after sonication.1.L.reuteri XC1；2.L.reuteri pLEM4155；3.L.reuteri pLEM4157(cel)圖5 L.reuteri XC1轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清蛋白及胞內(nèi)上清蛋白內(nèi)切葡聚糖酶活性平板檢測Fig.5 Plate test for endoglucanase activity of L.reuteri XC1 transformants

2.4L.reuteripLEM4157(cel) 內(nèi)切葡聚糖酶活性測定

如表2所示，L.reuteripLEM4157(cel) 培養(yǎng)上清和胞內(nèi)上清內(nèi)切葡聚糖酶活性分別為(0.96±0.08 )和(0.37±0.09) U·mL-1。培養(yǎng)液上清酶活性是胞內(nèi)上清的2.5倍，占總酶活的72%。

2.5 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉雞生產(chǎn)性能的影響

轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌對肉雞采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的影響如表 3 所示。結果表明，與基礎日糧組和L.reuteripLEM4155組相比，L.reuteripLEM4157(cel) 組對育雛飼養(yǎng)期(1～21 d)和育成飼養(yǎng)期(21～42 d)肉仔雞日增重、日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率的影響差異均不顯著(P>0.05)，但育成飼養(yǎng)期(21～42 d)和整個飼養(yǎng)期(1～42 d)肉仔雞日采食量有輕微下降的趨勢。

表2L.reuteripLEM4157(cel) 內(nèi)切葡聚糖酶活性測定

Table 2 The endoglucanase activity ofL.reuteripLEM4157(cel)

U·mL-1

表3 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉雞生產(chǎn)性能的影響

Table 3 Effects of transformedL.reuteristrain supplementation on growth performance of broilers

組別Group基礎日糧組BasaldietgroupL.reuteripLEM4155L.reuteripLEM4157(cel)1～21d日增重/(g·d-1)BWG28.14±1.2127.83±1.1927.57±0.42日采食量/(g·d-1)Feedintake39.73±1.7239.26±1.6839.33±1.03飼料轉(zhuǎn)化率FCR1.41±0.051.41±0.021.43±0.0422～42d日增重/(g·d-1)BWG62.21±4.7861.46±8.7959.22±3.23日采食量/(g·d-1)Feedintake115.77±8.11117.47±7.98111.50±3.95飼料轉(zhuǎn)化率FCR1.86±0.041.93±0.201.89±0.081～42d日增重/(g·d-1)BWG45.31±2.3944.74±4.4443.48±1.50日采食量/(g·d-1)Feedintake77.75±4.3378.37±4.2575.42±1.99飼料轉(zhuǎn)化率FCR1.72±0.021.76±0.101.74±0.06

2.6 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞腸道pH的影響

如圖6A所示，21日齡時，L.reuteripLEM4155和L.reuteripLEM4157(cel) 組肉仔雞十二指腸和空腸pH顯著低于基礎日糧組(P<0.05)，而各處理組間肉仔雞回腸pH差異不顯著(P>0.05)；如圖6B所示，42日齡時，各處理組肉仔雞十二直腸、空腸、回腸 pH 差異均不顯著(P>0.05)，說明重組乳酸桿菌的飼喂對肉仔雞后期腸道 pH 的影響不明顯。

a，b.柱子上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)a，b.The different letters mean significant difference(P<0.05)圖6 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞腸道pH的影響Fig.6 Effects of transformed L.reuteri strain supplementation on intestinal tract pH of broilers

2.7 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞內(nèi)臟和免疫器官的影響

如表4所示，L.reuteripLEM4155和L.reuteripLEM4157(cel) 組肉仔雞21 d的腎臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著高于基礎日糧組(P<0.05)，其他各指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；L.reuteripLEM4155和L.reuteripLEM4157(cel) 組肉仔雞42 d的胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著高于基礎日糧組(P<0.05)，內(nèi)臟器官指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。結果表明，乳酸桿菌對雞胸腺、胰腺、法氏囊的發(fā)育均有促進作用，對內(nèi)臟器官的發(fā)育沒有影響。

表4 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞內(nèi)臟和免疫器官的影響

Table 4 Effects of transformedL.reuteristrain supplementation on viscera and immune organof broilers

項目Item0～21d21～42d基礎日糧組BaseddietgroupL.reuteripLEM4155L.reuteripLEM4157(cel)基礎日糧組BaseddietgroupL.reuteripLEM4155L.reuteripLEM4157(cel)心臟指數(shù)Heartindex0.62±0.030.59±0.060.61±0.120.42±0.040.51±0.100.44±0.06肝臟指數(shù)Liverindex2.41±0.182.37±0.262.25±0.261.98±0.512.11±0.362.01±0.33脾臟指數(shù)Spleenindex0.11±0.040.09±0.040.09±0.010.12±0.060.13±0.040.13±0.04腎臟指數(shù)Kindeyindex0.56±0.28b0.67±0.05a0.78±0.16a0.55±0.050.48±0.080.51±0.04法氏囊指數(shù)Bursaindex0.22±0.04b0.28±0.07a0.28±0.04a0.07±0.040.08±0.010.11±0.05胸腺指數(shù)Thymusindex0.36±0.03b0.44±0.06a0.43±0.06a0.24±0.07b0.32±0.10a0.44±0.09a胰腺指數(shù)Pancreasindex0.31±0.03b0.37±0.05a0.41±0.08a0.20±0.03b0.26±0.03a0.22±0.02a

a，b.同行肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下表同

a，b.Means within the same row with different superscript letters are significantly different(P<0.05).The same as below

2.8 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞血清生理生化指標的影響

如表5所示，L.reuteripLEM4155、L.reuteripLEM4157(cel) 組肉仔雞21 d血清白球比、鈣、磷含量顯著高于基礎日糧組(P<0.05)，L.reuteripLEM4157(cel) 組肉仔雞21 d血清葡萄糖含量顯著高于基礎日糧組和L.reuteripLEM4155組(P<0.05)，其他各指標差異不顯著(P>0.05)；L.reuteripLEM4157(cel) 組肉仔雞 42 d血清葡萄糖顯著高于基礎日糧組和L.reuteripLEM4155 組(P<0.05)，其他各指標差異不顯著(P>0.05)。結果表明，乳酸桿菌可增加肉仔雞血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量，降低血清中尿酸的含量；轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌可增加肉雞血清中葡萄糖的含量，說明分泌的內(nèi)切葡聚糖酶在雞腸道中發(fā)揮了一定的作用。

表5 轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞血清生理生化指標的影響

Table 5 Effects of transformedL.reuteristrain supplementation on serum physiological and biochemical index of broilers

項目Item0～21d21～42d基礎日糧組BaseddietgroupL.reuteripLEM4155L.reuteripLEM4157(cel)基礎日糧組BaseddietgroupL.reuteripLEM4155L.reuteripLEM4157(cel)總蛋白/(g·L-1)TP22.60±4.9922.65±4.4225.70±5.1827.70±3.7030.28±4.0730.49±8.15白蛋白/(g·L-1)ALB10.58±2.1411.82±2.5613.25±2.9012.53±1.3113.58±2.8711.35±2.47球蛋白/(g·L-1)GLO12.03±2.9410.83±1.8812.45±2.4815.18±2.4116.70±1.6219.13±6.95白球比A/G0.89±0.08b1.08±0.07a1.07±0.12a0.83±0.050.81±0.140.81±0.14尿素/(mmol·L-1)BUN0.35±0.110.36±0.150.37±0.090.35±0.120.34±0.120.33±0.03鈣/(mmol·L-1)Ca1.59±0.21b1.84±0.33a2.05±0.39a2.41±0.402.70±0.372.57±0.05磷/(mmol·L-1)P1.74±0.10b2.10±0.36a2.09±0.28a2.33±0.152.57±0.332.34±0.46葡萄糖/(mmol·L-1)GLU10.98±1.54b9.55±1.49b13.95±1.68a7.77±2.09b9.73±2.61b11.17±1.85a總膽固醇/(mmol·L-1)T-chol2.89±0.673.13±0.573.48±0.673.44±0.363.75±0.843.11±0.67甘油三酯/(mmol·L-1)TG0.45±0.060.38±0.090.49±0.150.47±0.050.56±0.150.47±0.15尿酸/(mmol·L-1)UA0.26±0.150.28±0.100.22±0.060.24±0.070.22±0.080.20±0.04

3 討 論

乳酸菌(LAB)是一類低GC含量的革蘭陽性細菌，主要的代謝產(chǎn)物是乳酸，被美國FDA和歐洲食品安全權威機構認定為GRAS(Generally recognized as safe)級微生物，因此早期被廣泛地應用于發(fā)酵食品(如牛奶、蔬菜和肉類)的生產(chǎn)和保存。選擇乳酸菌作為表達宿主菌是因為其具有益生作用，能通過改善人和動物菌群平衡而對機體產(chǎn)生有利的影響。乳酸菌是人和動物體內(nèi)優(yōu)勢的益生菌之一，具有多種生理功能，如控制腸道感染，增加某些食物的營養(yǎng)價值，控制血清膽固醇水平，改善乳糖代謝，誘導體內(nèi)特異性及非特異性免疫應答以及抗腫瘤活性等功能[17-18]，廣泛地被作為宿主或載體定向表達和遞送外源蛋白到動物腸道內(nèi)。而外源基因能否在乳酸桿菌中高效地分泌表達，選擇合適有效的啟動子和信號肽是關鍵[19]。所以，本研究選用了已報道啟動子中效率較高的乳酸脫氫酶啟動子和應用較廣泛的Usp45基因信號肽，并引入了增強子，實現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶基因在乳酸桿菌中的分泌表達，并具有一定的水解活性。

本研究中，在大麥-小麥型基礎日糧中添加轉(zhuǎn)基因羅伊乳酸桿菌對肉仔雞日增重、日采食量、飼料轉(zhuǎn)化率無顯著影響。B.Yu 等研究表明，在大麥型基礎日糧中添加轉(zhuǎn) β-葡聚糖酶基因，L.reuteriPg4 能顯著提高0～37 日齡肉仔雞平均日增重，但對采食量和飼料轉(zhuǎn)化率無顯著影響[20]。J.R.Liu 等研究發(fā)現(xiàn)，在小麥型基礎日糧中添加轉(zhuǎn)木聚糖酶基因L.reuteriPg4 僅能顯著提高0～21日齡肉仔雞體增重，但對21～42日齡體增重、整個飼養(yǎng)期采食量和飼料轉(zhuǎn)化率無顯著影響[21]。L.Z.Jin 等在肉仔雞日糧中添加L.acidophilusI-26 或 12 種乳酸桿菌的混合培養(yǎng)物可提高0～6周齡肉仔雞體增重和飼料轉(zhuǎn)化率[22]。然而，B.A.Watkins等報道，添加Lactobacillusspp.培養(yǎng)物對肉仔雞的生產(chǎn)性能無明顯的改善作用[23]。綜上所述，菌株、飼喂劑量、制備方法和飼喂方式、肉仔雞健康狀態(tài)和飼養(yǎng)周期不同，其產(chǎn)生的飼喂效果也不盡相同[20]。

胸腺、法氏囊和脾是雞重要的免疫器官，其中脾是機體最重要的外周免疫器官，胸腺是雞的中樞內(nèi)分泌器官和淋巴器官，法氏囊是雞的中樞免疫器官，免疫器官相對重量增加，可以在一定程度上反映機體免疫功能的增強[24]。張春楊等研究表明，肉雞飼喂分泌蛋白酶的乳酸菌，能明顯促進免疫器官的生長發(fā)育，增加免疫器官指數(shù)[25]。相似的結果已在雞、小鼠、豬、家兔等動物中有大量報道[26-30]，本研究中，L.reuteripLEM4155和L.reuteripLEM4157(cel) 可顯著提高肉仔雞21 d的腎臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)，42 d的胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)。研究表明，益生菌可通過調(diào)整動物腸道微生物菌群，使腸道微生態(tài)系統(tǒng)處于最佳的平衡狀態(tài)，或通過特異性結合腸道抗原識別部位，活化腸黏膜內(nèi)的相關淋巴組織，誘導淋巴細胞和巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，從而增強動物機體非特異性和特異性免疫能力[31]。同時，在本研究中，L.reuteripLEM4155和L.reuteripLEM4157(cel) 可顯著降低肉仔雞十二指腸和空腸 pH，說明益生乳酸桿菌可通過產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸降低腸道pH或與致病菌競爭腸上皮細胞黏附位點，來抑制致病菌的生長，從而增強機體的免疫力。

血液生化指標可以反映機體各組織器官的功能和機體營養(yǎng)代謝情況。血清總蛋白含量高低反映蛋白質(zhì)代謝水平和機體對蛋白質(zhì)的吸收利用程度；白蛋白可維持血漿膠體滲透壓恒定和營養(yǎng)供給，促進肝細胞的修復、再生、運輸和解毒[32]。在本研究中，乳酸桿菌可增加肉仔雞血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量，降低血清中尿酸的含量；轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌可增加肉雞血清中葡萄糖的含量，說明乳酸菌在促進生長時，能夠促進蛋白質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化，免疫機能增強，促進成骨生成，同時由于血糖(即血清中葡萄糖)主要來源于腸道吸收和肝糖原分解，其進入血液循環(huán)后被運送到各組織細胞供全身利用，說明轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌分泌的內(nèi)切葡聚糖酶在肉仔雞腸道內(nèi)促進了非淀粉多糖物質(zhì)的降解和碳源的消化吸收。

4 結 論

本研究成功構建了可胞外分泌內(nèi)切葡聚糖酶，具有降解β-葡聚糖能力的轉(zhuǎn)內(nèi)切葡聚糖酶基因的羅伊乳酸桿菌，肉雞飼喂效果表明，其對肉仔雞生長性能無顯著影響，但可顯著降低21日齡肉仔雞十二指腸和空腸pH，促進21日齡肉仔雞腎、法氏囊、胸腺和胰腺的生長發(fā)育，增加42 日齡肉仔雞的胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)，提高肉仔雞21 日齡血清白球比、鈣、磷含量和42 日齡血清葡萄糖含量。

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(編輯 郭云雁)

Construction of TransgenicLactobacillusreuteriwith Endoglucanase and Evaluation of Its Feeding Effectiveness on Broilers

WANG Lei1,2,CAO Ping-hua1,3,CAI Bei1,GAO Yin1,GAO Kang1,YANG Yu-xin1,YANG Ming-ming1,YUAN Chao4,CHEN Yu-lin1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China;2.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QinghaiUniversity,Xining810016,China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;4.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730050,China)

The objective of the study was to construct the transgenicLactobacillusreuteriwith the ability of exocellular secreting endoglucanase and hydrolyzing β-glucan and evaluate its feeding effect on broilers，which would establish the foundation for application of the transgenicL.reuteriin animal production.pLEM4157(cel) vector was constructed by PCR and restriction enzyme，then transformed into competent cells ofL.reuteriXC1 for SDS-PAGE analysis，determination of endoglucanase activity and evaluation of feeding effect on broilers.The results of PCR amplification and sequence blast showed that endoglucanase genecelWwas about 1 500 bp，the similarity of gene and amino acid sequence were 99% and 100%，respectively.Native-PAGE amd SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass ofcelWgene mature peptide was approximately 52 ku，which was consistent to the predicted molecular weight.The endoglucanase activity in the extracellular and intracellular fraction in the transformedL.reutericulture were(0.96±0.08) and(0.37±0.09) U·mL-1，respectively.L.reuteripLEM4157(cel) had not significant effect on growth performance of broilers，but could decrease pH in duodenum and jejunum at 21 d，promote the growth development of kidney，cloacal bursa，thymus and pancreatic at 21 d，increase the thymus and pancreatic index at 42 d，improve the A/G and the content of Ca and P at 21 d，and the content of glucose at 42 d.L.reuteripLEM4157(cel) successfully secreted and expressed endoglucanase，displayed the ability to hydrolyze carboxymethyl cellulose and feeding effect on broier.

transgenes；endoglucanase gene；Lactobacillusreuteri；feeding effect；broilers

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.013

2014-07-16

國家自然科學基金資助項目(cyh200803)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(20090300606)

王 磊(1983-)，男，甘肅永昌人，博士生，主要從事動物分子營養(yǎng)研究，E-mail：277036818@qq.com

*通信作者：陳玉林，教授，博士生導師，主要從事動物遺傳資源研究、動物飼料資源與開發(fā)利用方面的研究，E-mail：chenyulindk@163.com

S831；S815.5

A

0366-6964(2015)05-0774-10