王 佩，范燕茹，金 鑫，楊銀鳳*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

枯草芽孢桿菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1表達(dá)的影響

王 佩1，2，范燕茹1，2，金 鑫1，2，楊銀鳳1，2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

選用益生枯草芽孢桿菌研究其對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。首先，在體外成功培養(yǎng)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞，然后用枯草芽孢桿菌對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行不同濃度、不同時(shí)間的刺激，利用熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR)從mRNA水平檢測(cè)刺激后上皮細(xì)胞中綿羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1，SBD-1)基因表達(dá)水平的差異。結(jié)果表明：當(dāng)菌液濃度為1010cfu·mL-1刺激上皮細(xì)胞8 h后，SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高；不同的菌液濃度誘導(dǎo)下SBD-1的表達(dá)量均有顯著增加，109、1010、1011cfu·mL-1菌液濃度刺激下，SBD-1的表達(dá)量與空白相比差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-1基因的表達(dá)。

β-防御素-1；瘤胃上皮細(xì)胞；枯草芽孢桿菌；熒光定量PCR

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一種小分子多肽，是存在于各種生物如哺乳動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、植物中的一種天然抗生素，具有對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒的廣譜抗微生物活性[1]，是許多生物的先天性免疫防御機(jī)制的一部分。防御素是一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子內(nèi)源性抗菌肽，是抗菌肽中的一個(gè)大家族。哺乳動(dòng)物中，防御素主要分為3大類：α-防御素、β-防御素、θ-防御素[2]。β-防御素在牛、羊、豬和人類等許多物種中被發(fā)現(xiàn)，主要是由各器官的上皮細(xì)胞產(chǎn)生[3]。在綿羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有兩種β-防御素存在，即綿羊β-防御素-1(SBD-1)和綿羊β-防御素-2(SBD-2)。綿羊β-防御素的表達(dá)大多在上皮細(xì)胞中，且主要在消化道和呼吸道中表達(dá)，在消化道中，SBD-2只表達(dá)于舌和遠(yuǎn)端回腸，而SBD-1表達(dá)較廣，在整個(gè)消化道(從舌到結(jié)腸)都有，并且在瘤胃中表達(dá)量最多[4-6]。

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物。在反芻動(dòng)物中，益生菌可促進(jìn)生長(zhǎng)、提高飼料利用效率[7]，而且，益生菌還能夠改善胃腸道功能，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，然而，益生菌的作用機(jī)理還尚未明確。最近的研究表明，益生菌能夠通過(guò)誘導(dǎo)抗菌肽比如防御素等來(lái)穩(wěn)定胃腸道屏障功能。2007年，M.Schlee等[8]發(fā)現(xiàn)，益生大腸桿菌Nissle 1917可誘導(dǎo)人β-防御素-2表達(dá)量的增加；2008年，M.Schlee等[9]研究表明，乳酸菌菌株也能夠誘導(dǎo)人β-防御素-2的表達(dá)。截至目前，研究者多使用的是腸上皮細(xì)胞及乳桿菌，而關(guān)于胃上皮細(xì)胞、枯草芽孢桿菌與β-防御素相互關(guān)系尚未見報(bào)道。大量研究表明，枯草芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖和正常生理狀態(tài)的維持都有重要意義，T.Marubashi等[10]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌能有效地改善鯪魚的生長(zhǎng)和免疫力，J.H.Lee等[11]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可通過(guò)抑制人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，芽孢桿菌作為益生菌開發(fā)應(yīng)用的潛力很大，并且，我國(guó)芽孢桿菌資源豐富[12]。因此，本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)益生菌枯草芽孢桿菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中SBD-1表達(dá)的影響，為在分子水平上揭示益生菌對(duì)防御素的調(diào)控機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)。細(xì)菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，1 L蒸餾水中加入10.0 g 胰蛋白胨、5.0 g 酵母提取粉、5.0 g NaCl、15.0 g 瓊脂，121 ℃ 滅菌15 min。細(xì)胞角蛋白一抗(Sigma)、飛捷FAST200 RNA提取試劑盒(飛捷公司)、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037A)、TaKaRa熒光定量PCR酶(RR820A)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、顯微成像系統(tǒng)(CKX41，Olympus)、凈化工作臺(tái)(杭州蘇凈)、多功能酶標(biāo)儀(SynergyTMH4，Biotek)、普通PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(VIIA7，ABI)等。

1.1.2 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的獲取 試驗(yàn)材料來(lái)自于呼和浩特市北亞屠宰場(chǎng)的綿羊。

1.1.3 供試菌株 枯草芽孢桿菌CMCC63501購(gòu)于中國(guó)微生物菌種網(wǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 將取來(lái)的瘤胃組織用滅菌生理鹽水沖洗去除瘤胃內(nèi)容物后，鈍性分離組織的黏膜上皮層和固有層，然后將其放入PBS溶液中帶入細(xì)胞間，所用PBS溶液中含 1 mg·mL-1青霉素、 500 μg·mL-1鏈霉素、100 μg·mL-1慶大霉素、50 μg·mL-1兩性霉素。帶入細(xì)胞間后，再用上述PBS溶液反復(fù)清洗3次，之后，用0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化液于37 ℃ 消化，于顯微鏡下觀察，至消化液中出現(xiàn)上皮細(xì)胞為止，收集，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含20% 胎牛血清、 200 μg·mL-1青霉素、 100 μg·mL-1鏈霉素、50 μg·mL-1慶大霉素、25 μg·mL-1兩性霉素 、2 μg·mL-1胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、β-巰基乙醇的F12液體培養(yǎng)基。

當(dāng)原代細(xì)胞數(shù)量達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶的80%～90%后，便可將細(xì)胞傳于12孔板，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定[13]，鑒定為上皮細(xì)胞后，則可用于刺激試驗(yàn)。

1.2.2 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng) 將枯草芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1氧培養(yǎng)24 h。按照倍比稀釋法用無(wú)抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基將枯草芽孢桿菌菌液的濃度調(diào)為：1012、1011、1010、109、108cfu·mL-1，即可用于細(xì)胞刺激試驗(yàn)。

1.2.3 瘤胃上皮細(xì)胞和枯草芽孢桿菌的共培養(yǎng) 將傳代細(xì)胞用PBS洗滌3次，每孔加入1 mL 無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。孵育24 h后，向細(xì)胞板中每孔加入900 μL 的無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基，并分別加入100 μL濃度為1010、109、108、107、106cfu·mL-1的枯草芽孢桿菌菌液和DMEM/F12作為空白對(duì)照，置37 ℃ 培養(yǎng)2 h。刺激2 h后，用含雙抗的PBS沖洗3次，加入含雙抗無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)2、4、8、12和24 h。

1.2.4 瘤胃上皮細(xì)胞總RNA的提取 用含雙抗的PBS將共培養(yǎng)后的瘤胃上皮細(xì)胞沖洗3次后，按照FAST200RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA的提?。孩偌尤隦A2液500 μL，充分顛倒混勻5～10次，靜置1 min。②將樣本裂解物全部吸入或倒入內(nèi)套管，離心1 min。 ③取出內(nèi)套管，吸取外套管中液體后放回內(nèi)套管，加入500 μL洗液，離心1 min，重復(fù)一次。④取出內(nèi)套管，吸取外套管中液體后放回內(nèi)套管，不加洗液，離心1 min。⑤將內(nèi)套管移入新的1.5 mL Eppendorf管，在膜中央加入洗脫液25～50 μL。⑥室溫靜置1 min后，離心1 min，獲得總RNA。所提RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)RNA質(zhì)量，同時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)A260 nm和A280 nm及其比值，以檢測(cè)RNA濃度和純度。

1.2.5 總RNA的反轉(zhuǎn)錄 以提取的瘤胃上皮細(xì)胞總RNA為模板，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR037A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所用反應(yīng)體系為10 μL：5×Prime Script Buffer 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，OLigo dT Primer(50 μmol·mL-1) 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol·mL-1) 0.5 μL，樣品RNA 6.5 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。RT產(chǎn)物cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 RT-PCR 根據(jù)GenBank中提供的SBD-1基因(U75250)和內(nèi)參因β-actin(U39357)序列，用DNAStar軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并由上海生工生物公司合成。SBD-1基因引物：上游P1：5′-GGCTCCATCACCTGCTCCTC-3′，下游P2：5′-CGTCTTCGCCTTCTGTTACTTCTT-3′，β-actin基因引物：上游P3：5′-GTCACCAACTGGGA-CGACA-3′，下游P4：5′-AGGCGTACAGGGACAGCA-3′，以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premin Ex Taq(2×) 10 μL，Up primer(10 μmol·mL-1) 0.8 μL，Down primer(10 μmol·mL-1) 0.8 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 6.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，63 ℃ 退火34 s，50個(gè)循環(huán)；熔解程序：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，每個(gè)樣品的目的基因及內(nèi)參基因分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線的Ct值計(jì)算定量結(jié)果，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，然后通過(guò)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 17.0的統(tǒng)計(jì)程序和單因子方差分析中的最小顯著法(Least significant difference)對(duì)每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析。

將cDNA以10倍濃度進(jìn)行梯度倍比稀釋，將5個(gè)濃度的樣品分別進(jìn)行SBD-1和β-actin實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，則可得到不同濃度下SBD-1和β-actin基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

SBD-1基因的相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCt法計(jì)算：ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；ΔΔCt=Ct(枯草芽孢桿菌刺激組)-Ct(對(duì)照組)。目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，當(dāng)擴(kuò)增效率接近等于1時(shí)，可簡(jiǎn)化為2-ΔCt公式進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 用0.25% 胰蛋白酶對(duì)綿羊瘤胃上皮組織連續(xù)消化后，在顯微鏡下觀察，可看到大小均一、單個(gè)存在的折光度較高的細(xì)胞，且數(shù)量較多(圖1A)，即可收集培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后，貼壁細(xì)胞有的單個(gè)存在，有的呈島嶼狀分布，形態(tài)多呈中間厚四周薄的圓形或橢圓形(圖1B)。培養(yǎng)6 d后，小島嶼狀的細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)成大片細(xì)胞(圖1C)。8 d后，片狀細(xì)胞相互連接在一起，細(xì)胞數(shù)量達(dá)80%～90%，幾乎將整個(gè)細(xì)胞瓶鋪滿，細(xì)胞成鵝卵石鋪路狀，形狀多為圓形或多角形，界限較為清晰，有個(gè)別細(xì)胞因生長(zhǎng)密度大導(dǎo)致形態(tài)有所變化(圖1D)，可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.1.2 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng) 傳代后的細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞呈鋪路石狀的單個(gè)細(xì)胞(圖2A)，與原代細(xì)胞相比，形態(tài)更加清晰，上皮樣細(xì)胞鵝卵石鋪路狀更為明顯，且相鄰距離較近。4 d后，細(xì)胞量可達(dá)到80%～90%，鏡下觀察基本沒(méi)有空余的位置，細(xì)胞界限明顯(圖2B)，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的鑒定 傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，細(xì)胞呈鋪路石狀，是典型的的上皮細(xì)胞形態(tài)(圖3A)。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定，細(xì)胞胞漿呈黃褐色，即角蛋白陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞核經(jīng)H.E染色呈現(xiàn)藍(lán)色(圖3B)。經(jīng)鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為上皮細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.消化后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞；B.培養(yǎng)4 d后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞；C.培養(yǎng)6 d后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞；D.培養(yǎng)8 d后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞A.The ruminal epithelial cells in sheep after digestion; B.The ruminal epithelial cells in sheep after 4 days primary culture; C.The ruminal epithelial cells in sheep after 6 days primary culture; D.The ruminal epithelial cells in sheep after 8 days primary culture圖1 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)結(jié)果 100×Fig.1 The primary culture of ruminal epithelial cells in sheep 100×

A.傳代培養(yǎng)2 d后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞；B傳代培養(yǎng)4 d后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞A.The ruminal epithelial cells in sheep after 2 days subculture; B.The ruminal epithelial cells in sheep after 4 days subculture圖2 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)結(jié)果 100×Fig.2 The subculture of ruminal epithelial cells in sheep 100×

A.傳代培養(yǎng)4 d后的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(100×)；B.綿羊瘤胃上皮細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(200×)A. The ruminal epithelial cells in sheep after 4 days subculture(100×); B.The ruminal epithelial cells in sheep by immunocytochemical staining(200×)圖3 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的鑒定結(jié)果Fig.3 The verification of ruminal epithelial cells in sheep

2.2 瘤胃上皮細(xì)胞總RNA的檢測(cè)

將所提取的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，可見28S rRNA和18S rRNA條帶清晰完整，5.8S條帶隱約可見，均無(wú)拖尾(圖4)，說(shuō)明所提RNA無(wú)降解。酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品A260 nm/A280 nm比值在2.0左右，表明幾乎無(wú)蛋白質(zhì)和多糖污染，RNA滿足試驗(yàn)要求。

圖4 瘤胃上皮細(xì)胞總RNA電泳結(jié)果Fig.4 The total RNA of ruminal epithelial cells

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

2.3.1 瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1和β-actin基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效率曲線 將5個(gè)濃度的樣品分別進(jìn)行SBD-1和β-actin基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，儀器會(huì)自動(dòng)給出PCR擴(kuò)增效率曲線圖(圖5)。從擴(kuò)增效率曲線圖中得出，SBD-1和β-actin基因擴(kuò)增曲線的回歸系數(shù)分別為R2=0.994 0和R2=0.997 4。從待測(cè)基因SBD-1和β-actin基因表達(dá)量的對(duì)數(shù)值(x軸)和Ct值(y軸)的關(guān)系可以看出，二者之間存在著反比例的關(guān)系，且擴(kuò)增效率接近等于1，待測(cè)基因表達(dá)量的對(duì)數(shù)值與Ct值呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，表明可以用熒光定量PCR相對(duì)定量法檢測(cè)SBD-1基因的表達(dá)，并可以通過(guò)運(yùn)用2-ΔCt公式進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

圖5 SBD-1和β-actin基因的擴(kuò)增效率曲線Fig.5 The real-time PCR amplification efficiency curve of SBD-1 and β-actin genes

2.3.2 瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1和β-actin基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中SBD-1和β-actin基因表達(dá)的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線均表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)曲線特征(圖6)。

從熔解曲線上看(圖7)，SBD-1和β-actin基因的熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別在86和88.5 ℃時(shí)出現(xiàn)單一峰，均沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，也沒(méi)有出現(xiàn)異常增寬的主峰，同時(shí)主峰(熔解峰)對(duì)應(yīng)的Tm值與擴(kuò)增產(chǎn)物的理論Tm值相近，說(shuō)明熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的具有特異性的產(chǎn)物。

圖6 β-actin和SBD-1基因的擴(kuò)增曲線Fig.6 The real-time PCR amplification curve of SBD-1 and β-actin genes

2.3.3 枯草芽孢桿菌對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1表達(dá)影響的時(shí)間與濃度之間的關(guān)系 根據(jù)公式對(duì)數(shù)據(jù)處理后，運(yùn)用軟件進(jìn)行圖形處理。當(dāng)刺激2、4、8、12和24 h后，隨菌液濃度的增加，SBD-1的表達(dá)量增大，當(dāng)菌液濃度為1010cfu·mL-1時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，之后，隨菌液濃度的增大，表達(dá)量逐漸減少，且菌液濃度為109、1010、1011cfu·mL-1時(shí)，SBD-1的表達(dá)量與空白相比，均為極顯著性差異(圖8)。對(duì)于不同濃度不同時(shí)間刺激下，SBD-1的表達(dá)量從整體水平上看，菌液濃度為1010cfu·mL-1、刺激時(shí)間為8 h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大值(圖9)。

圖7 SBD-1和β-actin熔解曲線Fig.7 The real-time PCR melt peak curve of SBD-1 and β-actin genes

**.P<0.01圖8 不同枯草芽孢桿菌濃度刺激瘤胃上皮細(xì)胞2、4、8、12和24 h后SBD-1的表達(dá)量Fig.8 SBD-1 gene expression in ruminal epithelial cells stimulated by Bacillus subtilis with different concentrations after 2,4,8,12 and 24 h

**.P<0.01圖9 枯草芽孢桿菌對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1表達(dá)的時(shí)間和濃度依賴關(guān)系Fig.9 SBD-1 gene expression in rumen epithelial cells stimulated by Bacillus subtilis with different concentrations at different times

3 討 論

綿羊瘤胃上皮屬于復(fù)層扁平上皮，由外到內(nèi)依次為角質(zhì)細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、棘狀細(xì)胞層和基底層，基底層和棘狀層細(xì)胞是瘤胃上皮最重要的細(xì)胞，也是體外研究瘤胃上皮的最佳細(xì)胞，但是堅(jiān)實(shí)的角質(zhì)層細(xì)胞會(huì)影響胰蛋白酶的消化作用。P.Galfi等[14]首次應(yīng)用胰蛋白酶連續(xù)消化法去除角質(zhì)層，成功的培養(yǎng)了瘤胃上皮細(xì)胞；J.L.Klotz等[15]對(duì)消化緩沖液和胰蛋白酶濃度進(jìn)行了優(yōu)化，獲得大量活細(xì)胞比例極高的瘤胃上皮細(xì)胞；孫志洪等[16]培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞時(shí)，在微生物去除、消化酶的選用和使用方面進(jìn)行了優(yōu)化；F.Stumpff 等[17]設(shè)計(jì)了特制的尤斯灌流室式的裝置來(lái)分離瘤胃上皮細(xì)胞。本試驗(yàn)借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，用青霉素、鏈霉素、慶大霉素、兩性霉素去除瘤胃內(nèi)微生物，并鈍性分離瘤胃黏膜得到上皮層，然后用0.25% 胰蛋白酶對(duì)所得上皮組織連續(xù)消化，獲得了可培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞。

益生菌已經(jīng)由糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織定義為活的微生物，可通過(guò)改善胃腸道微生物平衡有利地影響宿主動(dòng)物，可以促進(jìn)生長(zhǎng)，提高飼料利用效率，保護(hù)宿主免受腸道感染。有研究表明，在反芻動(dòng)物中，益生菌可提高動(dòng)物增長(zhǎng)率及飼料利用效率[7]?？莶菅挎邨U菌是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌生理學(xué)的研究代表[18]，最近的研究表明，枯草芽孢桿菌的益生作用在人、植物和動(dòng)物中都有所體現(xiàn)。2012年，J.H.Lee等[11]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以使人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)得到抑制；2004年，H.P.Bais等[18]研究表明，枯草芽孢桿菌可以形成一個(gè)穩(wěn)定的、廣泛的生物膜來(lái)抵抗病原菌，從而保護(hù)植物；2010年，D.Shahnaz等[19]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在作物根部感染真菌方面具有防治作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可提高體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)抗菌肽防御素的表達(dá)，表明枯草芽孢桿菌可提高機(jī)體免疫力。

2007年德國(guó)學(xué)者M(jìn).Schlee等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人腸上皮細(xì)胞Caco-2中加入益生菌大腸桿菌Nissle1917可以誘導(dǎo)人β-防御素-2的表達(dá)，之后，M.Schlee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同的益生菌乳酸菌株也能夠誘導(dǎo)人β-防御素-2的表達(dá)。劉佳明等[20]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌細(xì)胞壁成分可上調(diào)小鼠陰道組織β-防御素-2的表達(dá)，黎觀紅等[21]發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酸桿菌LGA能夠促進(jìn)雞小腸上皮細(xì)胞β-防御素-9的表達(dá)。在試驗(yàn)中，M.Schlee等[9]所用的為不同的菌株，選取了4個(gè)濃度：106、107、108、109cells·mL-1，發(fā)現(xiàn)刺激6 h、菌液濃度為109cells·mL-1時(shí)表達(dá)量最大。劉佳明研究表明，防御素的表達(dá)量隨乳桿菌濃度增大而增多，5、20、100 mg·L-1濃度的乳桿菌細(xì)胞壁成分處理下，100 mg·L-1濃度的乳桿菌細(xì)胞壁成分對(duì)β-防御素-2表達(dá)的增加最為明顯。黎觀紅等[21]則研究了其中的3個(gè)濃度：105、106、107cfu·mL-1，發(fā)現(xiàn)菌液濃度為106cfu·mL-1、刺激時(shí)間為12 h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值。試驗(yàn)中，M.Schlee等[9]和劉佳明等[20]的結(jié)果均表明，菌液對(duì)防御素的作用存在劑量依賴關(guān)系，隨菌液濃度增大而表達(dá)量增加，而黎觀紅則僅研究了3個(gè)濃度。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，選用了108、109、1010、1011、1012cfu·mL-15個(gè)濃度，并且發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間不同濃度菌液的刺激下，SBD-1的表達(dá)量均有所不同，當(dāng)菌液濃度為1010cfu·mL-1刺激上皮細(xì)胞8 h后，SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高，之后，隨菌液濃度的增加表達(dá)量反而降低，菌液濃度的增加使本試驗(yàn)的結(jié)論更具說(shuō)服力。試驗(yàn)結(jié)果的不同可能與不同菌種其菌體的有效成分有關(guān)，有效成分的鑒定仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究利用體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞，從基因水平探討了枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-1基因的表達(dá)的可能性，結(jié)果表明，適宜濃度的枯草芽孢桿菌可顯著提高綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-1基因的表達(dá)。

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(編輯 郭云雁)

Effects ofBacillussubtilison the Expression of SBD-1 in Cultured Ruminal Epithelial Cells of Sheep

WANG Pei1，2，F(xiàn)AN Yan-ru1，2，JIN Xin1，2，YANG Yin-feng1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China； 2.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDiseaseofMinistryofAgriculture，Hohhot010018，China)

In this study，Bacillussubtiliswas selected to investigate its effect on the β-defensin expression of ovine ruminal epithelial cells culturedinvitro.Firstly，the ovine ruminal epithelial cells were culturedinvitro，then the epithelial cells were stimulated byBacillussubtiliswith different concentrations at different times，the expression ofSBD-1 mRNA was determined by real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR).The results indicated that the expression peak ofSBD-1 mRNA was after 8 h treated byBacillussubtiliswith 1010cfu·mL-1.The expression ofSBD-1 was increased significantly after treated byBacillussubtiliswith different concentrations，and the expression at 109，1010，1011cfu·mL-1showed stronger induction response than the blank(P<0.01).This study reveals thatBacillussubtiliscan induce the expression ofSBD-1 in ovine ruminal epithelial cells.

β-defensin-1；ruminal epithelial cells；Bacillussubtilis；real-time fluorescence quantitative PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.011

2014-07-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160491)

王 佩(1989-)，女，山西靈石人，主要從事反芻動(dòng)物消化道免疫研究，E-mail：wangpei1205@126.com

*通信作者：楊銀鳳，教授，博士，主要從事反芻動(dòng)物消化道免疫研究，E-mail：julie1963@163.com

S826；S813.3

A

0366-6964(2015)05-0760-08