桓聰聰，許厚強(qiáng)，陳 偉，陳 祥，趙佳福，張 雯，周 迪，夏 丹

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠C2C12細(xì)胞中的表達(dá)

桓聰聰1，2，許厚強(qiáng)2*，陳 偉1，2，陳 祥2，趙佳福2，張 雯2，周 迪2，夏 丹2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

本研究旨在探究關(guān)嶺牛4個(gè)不同長(zhǎng)度的MyoDI啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，初步確定該基因核心啟動(dòng)子位置。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)關(guān)嶺牛不同組織中MyoDI基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。以關(guān)嶺牛血液DNA為模板，設(shè)計(jì)5'端加磷的引物，PCR擴(kuò)增獲得4個(gè)不同長(zhǎng)度的關(guān)嶺牛MyoDI啟動(dòng)子，定向精確替換pEGFP-N3載體的CMV啟動(dòng)子區(qū)，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N3-MyoDI。利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞，依據(jù)小鼠C2C12細(xì)胞發(fā)光的強(qiáng)弱判斷MyoDI啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。結(jié)果顯示，MyoDI基因在關(guān)嶺牛肌肉組織中表達(dá)量較高；目的片段成功替換pEGFP-N3載體的CMV區(qū)；重組質(zhì)粒能在小鼠C2C12細(xì)胞中成功表達(dá)，細(xì)胞在激發(fā)光下發(fā)綠色熒光。本研究成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pEGFP-N3-MyoDI，4個(gè)啟動(dòng)子均具有啟動(dòng)活性，其中P3啟動(dòng)子在小鼠C2C12細(xì)胞中表達(dá)量最高，初步推斷P3啟動(dòng)子為該基因的核心啟動(dòng)子。

MyoDI；真核表達(dá)載體；C2C12細(xì)胞；啟動(dòng)子；基因表達(dá)量

啟動(dòng)子是位于基因5′端上游轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的一段DNA序列，根據(jù)基因表達(dá)情況，可分為組成型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子，前者在各種組織中均能啟動(dòng)基因表達(dá)，后者僅在一定發(fā)育時(shí)期的特定組織中啟動(dòng)基因表達(dá)，肌肉特異性啟動(dòng)子在肌肉組織內(nèi)能夠高效地表達(dá)外源基因，但在非肌肉組織內(nèi)的啟動(dòng)效率很低[1-2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肌肉特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及其對(duì)肌肉細(xì)胞增殖和分化的作用進(jìn)行了深入研究[3]，但是由于肌肉細(xì)胞的分化特性和多種肌肉特異性啟動(dòng)子只在終末分化的肌肉細(xì)胞內(nèi)才能啟動(dòng)基因表達(dá)，所以在體外培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)效率很低，給肌肉機(jī)理研究帶來(lái)困難[4-5]。

生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenic regulatory factors，MRFs)，也稱生肌決定因子家族(MDFS)，骨骼肌表達(dá)的生肌調(diào)節(jié)因子稱為MyoD基因家族[6]。MyoD基因家族包括4種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的基因：MyoDI、MyoG、Myf5和MRF4[7-8]，它們對(duì)生肌發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用，可使成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分化，影響家畜肌肉的生長(zhǎng)。這些基因編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達(dá)來(lái)參與肌細(xì)胞定向和分化。Myf5和MyoDI在成肌細(xì)胞增殖過(guò)程中表達(dá)，Myf5基因所起的作用基本能夠被MyoDI基因替代，二者的功能有許多相似的特征[9-11]。MRFs家族成員的表達(dá)時(shí)間和功能特點(diǎn)對(duì)于骨骼肌的發(fā)生、分化和成熟起著重要作用。MyoDI和Myf5基因主要在骨骼肌發(fā)育早期的肌前體細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化的過(guò)程中發(fā)揮作用，而MyoG和MRF4基因主要在骨骼肌發(fā)育晚期的成肌細(xì)胞向終末骨骼肌纖維細(xì)胞分化的過(guò)程中發(fā)揮作用[12-15]。

MyoDI(Myogenic differentiation Ⅰ)基因啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子[16]，是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的正調(diào)控基因。在形成肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，MyoDI起著總開(kāi)關(guān)的作用，可以結(jié)合到肌細(xì)胞生成素、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結(jié)蛋白等基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮重要調(diào)控作用，促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活[17-18]。肌分化因子MyoD原名MyoDI，1987年被首次克隆[19]?，F(xiàn)已知牛的MyoDI位于15號(hào)染色體，為2 648 bp，有3個(gè)外顯子。MyoDI基因產(chǎn)物參與多種分化細(xì)胞向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可影響肌肉結(jié)構(gòu)的表達(dá)。近年來(lái)，MyoDI基因已經(jīng)成為動(dòng)物肉質(zhì)改良育種的重要研究部分[20-21]。目前在國(guó)內(nèi)外，該基因在小鼠、雞和豬肌細(xì)胞生成的表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面報(bào)道較多；在牛方面主要集中在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的研究，而對(duì)MyoDI基因的表達(dá)調(diào)控和MyoDI基因啟動(dòng)子的功能和調(diào)控方面的研究較少[22]。田璐等在3個(gè)黃牛品種及4個(gè)雜交肉牛群體MyoD基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)其顯著影響肉牛多個(gè)肉質(zhì)性狀[23]，由此可見(jiàn)，研究MyoDI基因啟動(dòng)子有著十分重要的意義。李飛等已經(jīng)證實(shí)MyoDI基因啟動(dòng)子為肌肉組織特異性啟動(dòng)子[24]，但對(duì)MyoDI基因啟動(dòng)子的活性以及核心啟動(dòng)子位置并沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)的研究。

本研究采用熒光定量PCR技術(shù)(QRT-PCR)對(duì)MyoDI基因進(jìn)行了差異表達(dá)分析；克隆關(guān)嶺牛MyoDI基因4段啟動(dòng)子區(qū)，成功構(gòu)建pEGFP-N3-MyoDI真核表達(dá)載體；通過(guò)轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞，觀察C2C12細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步確定MyoDI基因啟動(dòng)子的活性及核心啟動(dòng)子位置，同時(shí)為進(jìn)一步構(gòu)建MyoDI啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因小鼠模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、TransStart?Green qPCR SuperMix UDG、TransStart?One-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、血液基因組DNA提取試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；真核表達(dá)載體pEGFP-N3、限制性內(nèi)切酶SacI、Hind III、T4DNA連接酶、DNA marker均購(gòu)于TaKaRa公司；高保真DNA聚合酶，dNTP購(gòu)于鼎國(guó)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司；二甲基亞砜、胰酶購(gòu)自Sigma公司；C2C12細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 采集同一頭關(guān)嶺牛背最長(zhǎng)肌、小腸、肝、大腿肌、心、脂肪組織，將新鮮的組織置于液氮中，保存于-80 ℃低溫冰箱中。利用Trizol法對(duì)不同組織樣品的總RNA進(jìn)行提取，并用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。按照TransStart?One-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RNA模板1 μL，Random Primer 1 μL，gDNA Remove 1 μL，TransScriptTMRT Mix 1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，補(bǔ)加RNase-free水到10 μL。25 ℃孵育10 min后，42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min。-20 ℃保存，進(jìn)行后續(xù)的熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照NCBI中牛β-actin(AY152693)和MyoDI(NM_001040478)基因序列，結(jié)合Primier5.0和Oligo軟件進(jìn)行分析設(shè)計(jì)特異性qRT-RCR引物(表1)，引物由上海生工合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用10 μL反應(yīng)體系，采用Bio-rad iQ5 伯樂(lè)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。每個(gè)樣品不同基因的表達(dá)均以β-actin為對(duì)照，每個(gè)樣品檢測(cè)做3個(gè)平行試驗(yàn)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后由熔解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及Ct值計(jì)算定量結(jié)果。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列及參數(shù)

Table 1 Primer sequences and parameters used for real-time quantitative PCR

名稱Name引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature片段長(zhǎng)度/bpFragmentsizeMyoDIS:GCTACTTCGCGACCAGGACA:CGCTGTAGTCCATCATGCCGT50.7158β-actinS:GCAGGTCATCACCATCGGA:GCTGTCACCTTCACCGTTC58.3564

S.上游引物；A．下游引物

S．Sense；A．Antisense

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 SPSS18.0計(jì)算重復(fù)樣品間Ct均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)，分析MyoDI基因在不同組織中的差異表達(dá)量[25]。首先計(jì)算各組織樣的目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，即△Ct= Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，然后計(jì)算各組織樣△Ct平均值，選取小腸做對(duì)照，用其他組織樣減去小腸組織樣的△Ct，即為比較的Ct(△△Ct)；2-△△Ct表示試驗(yàn)?zāi)康幕虻谋磉_(dá)相對(duì)于對(duì)照組變化的倍數(shù)[26]。

1.2.4 PCR擴(kuò)增MyoDI啟動(dòng)子區(qū) 根據(jù)GenBank中公布的牛MyoDI(GenBank No.：281938)基因序列，用FIRSTEF程序(http：//rμlai.cshl.org/tools/FirstEF/)進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)，另外結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期的工作結(jié)果，用Primer5.0設(shè)計(jì)4對(duì)5′端加磷的引物(表2)，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。以關(guān)嶺牛血液DNA為模板擴(kuò)增MyoDI啟動(dòng)子P1～P4片段，擴(kuò)增體系20 μL。PCR條件(表2)：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，退火30 s；72 ℃延伸；循環(huán)35次；72 ℃延伸2 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 PCR擴(kuò)增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段 以pEGFP-N3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物：5′-GCTAGCGCTACCGGACTCA-GAT-3′，下游引物：5′-ATTAATAACTAATGCA-TGGCGG-3′，總反應(yīng)體系為20 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，10個(gè)循環(huán)； 98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表2 用于PCR擴(kuò)增的引物信息

Table 2 Information of primers for PCR

名稱Name引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature延伸時(shí)間/sExtensiontime片段長(zhǎng)度/bpFragmentssizeP1(-1895～+557bp)S:ACCTCCCGACATCATACATTA:GGTTTGGGTTGCTAGACG55802452P2(-976～+17bp)S:GTGGAGTTCCGCTTGTTGA:CTCCCCACCCCTACTTTC6035993P3(-420～+17bp)S:CTCCCTGATTCGGTAGATCA:CTCCCCACCCCTACTTTC5116437P4(-108～+17bp)S:CTCCCTGCTCTGTTCCTATTA:CTCCCCACCCCTACTTTC567125

S．上游引物；A．下游引物

S．Sense；A．Antisense

1.2.6MyoDI啟動(dòng)子與pEGFP-N3片段的連接及轉(zhuǎn)化 將PCR獲得的不同DNA片段分別用膠回收試劑盒回收純化。將4段不同長(zhǎng)度的MyoDI啟動(dòng)子片段分別與不含CMV區(qū)的pEGFP-N3片段平末端連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至預(yù)先用CaCl2法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，靜置1 h，再倒置培養(yǎng)16～24 h。

1.2.7 菌落PCR鑒定和重組質(zhì)粒PCR鑒定 將含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆菌落編號(hào)，再選取這些陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

選取電泳中和陽(yáng)性對(duì)照有一致條帶的陽(yáng)性菌落接種到含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。用提取的重組質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行重組質(zhì)粒PCR。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

1.2.8 重組質(zhì)粒的酶切及測(cè)序鑒定 選取只能擴(kuò)增出和陽(yáng)性對(duì)照有一致條帶的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Hind III酶切驗(yàn)證片段連接的順序。酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將同一陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送至上海英駿公司測(cè)序。

1.2.9 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)C2C12細(xì)胞。待C2C12細(xì)胞貼壁后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化更換新的培養(yǎng)基。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI和對(duì)照空質(zhì)粒pEGFP-N3，每個(gè)樣品重復(fù)3孔。轉(zhuǎn)染具體步驟：轉(zhuǎn)染前1 d將小鼠C2C12細(xì)胞接種至24孔板中，1×105個(gè)·孔-1，使細(xì)胞達(dá)到90%～95%。用50 μL Opti-MEM稀釋重組質(zhì)粒DNA，輕輕混合，取2 μL LipofectamineTM2000用50 μL Opti-MEM稀釋?zhuān)p輕混合，室溫孵育5 min；將50 μL LipofectamineTM2000混合物加入重組質(zhì)?；旌衔镏校傮w積為100 μL，輕輕混合，室溫孵育20 min；將100 μL DNA-LipofectamineTM2000混合物加入24孔板中，輕輕混勻，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24 h，將培養(yǎng)板置于尼康熒光倒置顯微鏡下，在藍(lán)色濾鏡下用445～490 nm的激發(fā)光光源觀察C2C12細(xì)胞有無(wú)表達(dá)的發(fā)綠色熒光的GFP物質(zhì)[27]。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物特異性分析

由圖1可見(jiàn)，β-actin和MyoDI基因擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)“S”形，說(shuō)明β-actin和MyoDI基因的動(dòng)力學(xué)曲線整體平行性較好，曲線拐點(diǎn)清晰，基線平而無(wú)明顯上揚(yáng)趨勢(shì)。由圖2可見(jiàn)，熔解曲線圖顯示梯度模板熔解曲線集中。熔解曲線上只有一個(gè)明顯的峰，表明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，熒光強(qiáng)度均來(lái)自于特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，目的基因及內(nèi)參基因沒(méi)有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，引物特異性好。

2.2MyoDI基因在關(guān)嶺牛不同組織中的qRT-PCR分析

結(jié)果顯示，MyoDImRNA在所檢測(cè)的6個(gè)組織樣中均有表達(dá)，且以小腸為對(duì)照，背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，小腸中表達(dá)量最低(圖3)。

圖1 β-actin和MyoD I基因的擴(kuò)增曲線Fig.1 The amplification curve of β-actin and MyoD I genes

圖2 β-actin和MyoD I基因的熔解曲線Fig.2 The melting curve of β-actin and MyoD I genes

1.小腸；2.脂肪；3.肝；4.大腿肌；5.心；6.背最長(zhǎng)肌1.Small intestine；2.Fat；3.Liver；4.Muscle of thigh；5.Heart；6.Longissimus dorsi圖3 MyoD I mRNA 在關(guān)嶺牛不同組織中的表達(dá)Fig.3 The expressing level of MyoD I gene in different tissues in Guanling cattle

2.3MyoDI基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增

以提取的血液DNA為模板，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，分別在2 452、993、437和125 bp處出現(xiàn)條帶，與目的條帶大小一致(圖4)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4.P1、P2、P3、P4 PCR產(chǎn)物M.Marker 15000；1，2，3，4.The PCR products of P1，P2，P3，P4圖4 不同長(zhǎng)度MyoD I啟動(dòng)子片段PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR product of MyoD I promoters with different length

2.4 擴(kuò)增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段

以搖菌提質(zhì)粒獲得的pEGFP-N3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得不含啟動(dòng)子區(qū)的pEGFP-N3載體片段，獲得的凝膠條帶與目的條帶一致(圖5)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.pEGFP-N3載體目的條帶M.Marker15000；1，2.The target fragments of pEGFP-N3圖5 不含啟動(dòng)子區(qū)的pEGFP-N3載體片段PCR產(chǎn)物Fig.5 PCR product of pEGFP-N3 vector without promoter region

2.5 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI的PCR鑒定

選取陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增出2 452、993、437和125 bp片段與陽(yáng)性對(duì)照獲得的P1、P2、P3、P4片段一致，而陰性對(duì)照則沒(méi)有目的片段出現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果(圖6)和預(yù)期的一致。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4.P1～P4重組質(zhì)粒PCR鑒定M.Marker5000；1，2，3，4.PCR identification of P1-P4 reconstructed plasmid圖6 重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.6 Identification of PCR product of reconstructed plasmid

2.6 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI酶切和測(cè)序鑒定

目的片段和質(zhì)粒片段是平末端連接，酶切可以驗(yàn)證目的片段插入的順序。重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P1和pEGFP-N3-P2分別在目的片段和質(zhì)粒片段上有兩個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P1經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切，可以獲得大小約1.4 和5.3 kb的條帶(圖7)；重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P2經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切可以獲得大小約776 bp和4.3 kb的條帶。重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P3、pEGFP-N3-P4只在質(zhì)粒片段有一個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P3、pEGFP-N3-P4經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切可分別得到大小約4.6和4.2 kb的條帶。結(jié)果證明，P1、P2片段已經(jīng)以正確的順序成功替換真核表達(dá)載體pEGFP-N3的CMV區(qū)；P3、P4片段成功替換真核表達(dá)載體pEGFP-N3的CMV區(qū)(圖8)，但插入順序還需要通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。將英駿公司測(cè)序結(jié)果與NCBI中的序列進(jìn)行比對(duì)，吻合度達(dá)到99%以上，表明4個(gè)不同的重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI構(gòu)建成功。

M.Marker5000；1.pEGFP-N3-P1；2.pEGFP-N3-P2；3.pEGFP-N3-P3；4.pEGFP-N3-P4圖7 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.7 Identification of restriction analysis of reconstructed plasmid

2.7 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI在小鼠C2C12細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI和質(zhì)粒pEGFP-N3轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞30 h后熒光達(dá)到最大值，用熒光倒置顯微鏡觀察重組質(zhì)粒在小鼠C2C12細(xì)胞中的表達(dá)情況?？梢?jiàn)重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI和質(zhì)粒pEGFP-N3轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞，細(xì)胞熒光的表達(dá)量為pEGFP-N3>pEGFP-N3-P3>pEGFP-N3-P2>pEGFP-N3-P4>pEGFP-N3-P1，且綠色熒光蛋白在部分小鼠C2C12細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，表現(xiàn)為強(qiáng)綠色熒光(圖9)，推測(cè)P3可能為MyoDI基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。

3 討 論

生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族是控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。生肌分化因子(MyoDⅠ)是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的正調(diào)控基因，在肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著決定性的作用[28]。

本試驗(yàn)采用qRT-PCR方法對(duì)MyoDI基因在關(guān)嶺牛大腿肌、背最長(zhǎng)肌、小腸、心、肝、脂肪6個(gè)組織中mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定。研究結(jié)果表明，MyoDI基因在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，在心中表達(dá)量其次，在小腸中表達(dá)量最低。MyoDI基因在肌肉中表達(dá)量相對(duì)較高，與李飛等[24]證實(shí)的MyoDI基因?yàn)榧∪饨M織特異性基因的結(jié)論相一致。本研究選取了小鼠的成肌細(xì)胞(C2C12)為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證MyoDI基因啟動(dòng)子的功能和活性，為后續(xù)在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證啟動(dòng)子的功能和活性提供基礎(chǔ)。

圖8 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoD I(B)與pEGFP-N3載體(A)Fig.8 pEGFP-N3-MyoD I recombinant plasmid(B) and pEGFP-N3 vectors(A)

A.pEGFP-N3-P1重組載體；B.pEGFP-N3-P2重組載體；C.pEGFP-N3-P3重組載體；D.pEGFP-N3-P4重組載體；E.pEGFP-N3載體；F.未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組A.pEGFP-N3-P1 reconstruction vector；B.pEGFP-N3-P2 reconstruction vector；C.pEGFP-N3-P3 reconstruction vector；D.pEGFP-N3-P4 reconstruction vector；E.pEGFP-N3 vector；F.Plasmid untransfected圖9 重組表達(dá)載體pEGFP-N3-MyoD I轉(zhuǎn)染30 h后小鼠C2C12細(xì)胞綠色熒光情況 200×Fig.9 The green fluorescence of pEGFP-N3-MyoD transfected into C2C12 cell 200×

由于在擴(kuò)增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段時(shí)對(duì)克隆位置要求精確，因此本研究采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，與P1、P2、P3、P4片段進(jìn)行平末端連接，通過(guò)采用加磷的引物可以增加平末端連接的機(jī)率。試驗(yàn)通過(guò)菌液PCR、酶切、測(cè)序的方法驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子，結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的雙酶切方法相比，本方法具有不受酶切位點(diǎn)限制的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也避免引入新的酶切位點(diǎn)，克服了目的片段上有雙酶切位點(diǎn)而導(dǎo)致在內(nèi)切酶選擇上的困難。通過(guò)此種方法可以實(shí)現(xiàn)在載體的任意位置連接需要的目的片段而無(wú)需考慮酶切位點(diǎn)。

真核生物啟動(dòng)子屬于mRNA基因啟動(dòng)子，位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，主要包括TATA-box、起始子、CAAT-box和GC-box等。TATA-box和起始子被稱為核心啟動(dòng)子[29-30]，其中TATA-box是轉(zhuǎn)錄因子TFIID的TBP亞基的結(jié)合位點(diǎn)。本研究通過(guò)替換pEGFP-N3載體的CMV區(qū)，觀察轉(zhuǎn)染前后C2C12細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，判定目的啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。結(jié)果顯示，MyoDI片段的P2、P3、P4片段均可啟動(dòng)pEGFP-N3載體的EGFP熒光蛋白表達(dá)區(qū)，啟動(dòng)活性為P3>P2>P4>P1。因此，推測(cè)P3可能為MyoDI基因核心啟動(dòng)子區(qū)，P1和P2片段啟動(dòng)活性較低可能由于含有抑制啟動(dòng)子活性的區(qū)域，P4片段由于長(zhǎng)度較短可能缺失具有啟動(dòng)活性的核心區(qū)域，影響表達(dá)量。通過(guò)構(gòu)建啟動(dòng)子pEGFP-N3-MyoDI真核表達(dá)載體，可為后續(xù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型提供分子學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步驗(yàn)證MyoDI基因啟動(dòng)子活性與功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究分析了關(guān)嶺牛MyoDI基因在大腿肌、背最長(zhǎng)肌、肝、脂肪、心、小腸6個(gè)組織中的表達(dá)量，克隆了4個(gè)關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動(dòng)子區(qū)，精確替換pEGFP-N3的CMV區(qū)，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEGFP-N3-MyoDI，轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞。結(jié)果顯示，MyoDI基因在關(guān)嶺牛肌肉組織中表達(dá)量較高，推測(cè)出P3片段為MyoDI基因核心啟動(dòng)子區(qū)。

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(編輯 郭云雁)

Construction ofMyoDIPromoter Eukaryotic Expression Vector in Guanling Cattle and Its Expression in Mouse C2C12 Cells

HUAN Cong-cong1，2，XU Hou-qiang2*，CHEN Wei1，2，CHEN Xiang2，ZHAO Jia-fu2，ZHANG Wen2，ZHOU Di2，XIA Dan2

(1.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity/GuizhouKeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，Guiyang550025，China)

The aim of this study was to analyze promoter activity of 4 different lengthsMyoDIpromoters in Guanling cattle and determine preliminarily the position of the core gene promoter.The relative expression quantity was detected in different tissues of Guanling cattle by real-time quantitative PCR.The DNA extracted from Guanling cattle blood was as a template and the phosphorylated 5'end PCR primers was designed to amplify 4 different lengthsMyoDIpromoters in Guanling cattle，ultimately accurately replaced the CMV region of pEGFP-N3 vector and got eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoDI.Then the recombinant plasmid was transiently transfected into mouse C2C12 cells by liposome method.The aim was to verify promoter activity ofMyoDIpromoter by Luminous intensity of mouse C2C12 cells.The expression level ofMyoDIgene was the highest in muscle，the fragment was inserted into an expression vector，the recombinant plasmid could be successfully expressed in mouse C2C12 cells with green fluorescence under the excitation light.In this study,eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoDIis successfully constructed，4 promoters constructed show promoter activity，expression quantity of P3promoter is the highest，so P3promoter is regarded as the core promoter ofMyoDIgene.

MyoDI；eukaryotic expression vector；C2C12 cell；promoter；relative expression quantity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.006

2014-07-28

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng) (2013ZX08009-004)；黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)(字[2013]6008號(hào))；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY字[2012]3008號(hào))；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(研農(nóng)2014021)

桓聰聰(1989-)，女，河南許昌人，碩士生，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究，E-mail: huancongcong@126.com

*通信作者：許厚強(qiáng)，博士，教授，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究，E-mail：houqiang0524@yahoo.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)05-0719-09