雷占東，張 斌，岳 華，黃志宏，湯 承

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

一株牦牛源御成門沙門菌對小鼠的致病性

雷占東，張 斌，岳 華，黃志宏，湯 承*

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

御成門沙門菌是沙門菌中的稀少血清型，其致病性尚未見報道。以BALB/c小鼠為模型，旨在研究牦牛源御成門沙門菌swun3736菌株的致病性。采用灌胃的方法，測定swun3736菌株對小鼠的半數致死量(LD50)、細菌在小鼠體內的動態(tài)分布及各組織的病理學變化等。結果表明，御成門沙門菌swun3736菌株對小鼠的LD50為5×102CFU。以105CFU·只-1灌胃感染小鼠，24 h后最先在肺中分離到該菌，72 h從脾、肝、腎及胰腺等器官中分離到該菌，96 h從心和大腦中分離到該菌。組織病理學檢查顯示肺、脾、肝、心、腎和回腸出現變性、壞死與炎性細胞浸潤等病變。除回腸外，其他腸段未見明顯病變，提示回腸為該菌的入侵門戶。本試驗結果表明御成門沙門菌swun3736具有很強的致病力，其公共衛(wèi)生學意義值得關注。

牦牛；御成門沙門菌； LD50；動態(tài)分布；組織病理學

沙門菌引起包括人和動物在內的多種宿主感染，危害嚴重。該菌容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑傳播，主要引起兩大類疾病——自限性腸炎和全身感染性疾病[1]。目前已發(fā)現沙門菌的血清型有2 600多種，其中能引起溫血動物感染的就有1 600多種，并且每年都不斷有新的血清型出現[2]。不同血清型的沙門菌的致病特點有所差別。根據對宿主的適應性或嗜性不同，可分為3群，其中第一群具有高度適應性或專嗜性，只對人和某種動物產生特定疾病，如雞白痢雞傷寒沙門菌。第二群是在一定程度適應于特定動物的偏嗜性沙門菌，多在各自宿主中致病，如豬霍亂和都柏林沙門菌。第三群是非適應性或泛嗜性沙門菌，具有廣泛感染的宿主譜，能引起人和各種動物的沙門菌病，如腸炎和鼠傷寒沙門菌，具有重要的公共衛(wèi)生學意義[3]。

御成門沙門菌(Salmonellaonarimon)是沙門菌中的稀少血清型，該菌最早是在1940年從一個日本健康女性糞便中分離到[4]。2011年在土耳其再次從人體中分離到御成門沙門菌[5]。 本實驗室在2012年從青藏高原健康牦牛的糞便中分離到2株御成門沙門菌，并發(fā)現該菌攜帶毒性質粒[6]?？梢娫摼哂袕V泛的地域分布。目前還未見關于該血清型的致病性的報道，本試驗擬以BALB/c小鼠為動物模型，研究牦牛源御成門沙門菌swun3736菌株的致病性，為公共衛(wèi)生學提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和實驗動物

御成門沙門菌swun3736菌株由西南民族大學生命科學與技術學院動物醫(yī)學實驗室于2012年從牦牛糞便中分離，血清型經四川省動物疫病預防控制中心鑒定。

18～22 g 6～8周齡BALB/c雌性易感小鼠購于四川大學華西實驗動物中心。

1.2 LD50的測定

將40只SPF級BALB/c小鼠隨機分成8組，每組5只，飼養(yǎng)觀察2 d。挑取純化的單菌落接種于無菌液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，進行活菌計數，以無菌LB增菌液稀釋或濃縮細菌，調整細菌濃度為101～108CFU·mL-1。第3天采用灌胃的方法用稀釋過的菌液分別接種于8組小鼠，0.5 mL·只-1。灌胃后正常飼喂，觀察記錄發(fā)病死亡情況，采用Reed-Muench的方法[7]計算LD50。

1.3 細菌的組織動態(tài)分布和組織病理學

將70只SPF級BALB/c小鼠隨機分為2組，其中試驗組55只，對照組15只。飼養(yǎng)觀察2 d。第3天對試驗組小鼠灌胃接種濃度為105CFU·mL-1的御成門沙門菌swun3736，對照組灌胃同樣劑量的LB液體培養(yǎng)基，0.5 mL·只-1。分別于灌胃后24 h、48 h、72 h、96 h、5 d、6 d和7 d等不同時間點分別取3只試驗組與1只對照組小鼠實施安樂死，采取小鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、胰、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸等組織，放入4%的多聚甲醛中固定，制備組織切片，進行HE染色，觀察。在上述同一時間點分別另取3只試驗組與1只對照組小鼠實施安樂死，無菌采取小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、胰等實質器官，用無菌生理鹽水沖洗干凈，進行勻漿，然后稀釋不同梯度，均勻涂布在SS固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)12～14 h后，計錄平板菌落數量，每個時間點同一個樣本均進行3次計數，求平均值。

2 結 果

2.1 LD50的測定

采用灌胃的方法從101～108CFU·mL-1接種BALB/c小鼠。72 h后開始出現死亡。接種后第7天出現死亡高峰期。發(fā)病小鼠精神萎靡，食欲不振，弓腰擠堆。剖檢發(fā)現死亡小鼠肝出現彌漫性出血點，脾有大量白色壞死點，回腸腸壁變薄，充滿淡黃色漿液性內容物。10 d后101CFU· mL-1組小鼠全部耐過，102CFU·mL-1和103CFU·mL-1組部分小鼠耐過。其他劑量組全部死亡。根據Reed-Muench方法計算出LD50為5×102CFU。

2.2 組織病理學變化

以105CFU·mL-1灌胃感染BALB/c小鼠，24 h后最先觀察到肺部病變，個別出現肺泡壁增厚，小血管與小支氣管周圍出現較小的巨噬細胞和淋巴細胞浸潤病灶，感染后96 h，肺泡壁明顯增厚、細胞增多，小鼠肺泡腔內開始出現巨噬細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞浸潤，血管與支氣管周圍有大量淋巴細胞浸潤聚集(圖1)。

感染后5 d，脾白髓開始出現淋巴細胞脫失，出現散在的淋巴組織凝固性壞死灶，隨后壞死灶增大，周圍出血。感染后72 h，肝開始出現淋巴細胞與嗜中性粒細胞浸潤病灶，出現少量、較小的肝細胞凝固性壞死灶。隨著感染時間延長，炎性細胞浸潤病灶增多，出現較大的凝固性壞死灶及炎性細胞浸潤聚集病灶。感染后48 h，心外膜下偶見成纖維細胞、巨噬細胞和淋巴細胞增生、浸潤病灶。72 h后，心外膜下出現個別心肌細胞壞死，炎性細胞侵潤。隨后心肌細胞發(fā)生廣泛空泡變性，以后胞質空泡數量增多、增大。感染 5 d 后，腎近曲小管上皮細胞廣泛變性，胞質內開始出現細小空泡，后期上皮細胞變性加重。

感染后96 h，回腸固有層少量巨噬細胞、嗜中性粒細胞與淋巴細胞侵潤，部分絨毛上皮細胞脫落，甚至腸上皮與固有層組織發(fā)生凝固性壞死。十二指腸、空腸、盲腸、結腸和直腸無明顯病理變化。

A.感染后第5天，肺泡壁明顯增厚；B.感染后第7天，脾淋巴組織凝固性壞死；C.感染后第6天，肝凝固性壞死；D.感染后第5天，心肌細胞空泡變性；E.感染后第7天，腎近曲小管上皮細胞空泡變性；F.感染后第7天，回腸絨毛凝固性壞死A.Alveolar wall obvious thickening at 5 post infection (PI)；B.Splenic lymphoid tissue coagulation necrosis at 7 PI；C.Coagulation necrosis of the liver at 6 PI；D.Vacuolar degeneration of myocardial cells at 5 PI；E.Renal proximal tubule epithelial cell degeneration at 7 PI；F.Villi coagulation necrosis at 7 PI圖1 小鼠感染御成門沙門菌后組織器官的典型病理變化Fig.1 Tissues and organs of mice typical pathological changes after S.onarimon infection

大腦和胰腺在整個感染周期中沒有觀察到明顯變化。

2.3 細菌在組織器官中的分布

利用細菌培養(yǎng)方法，對御成門沙門菌swun3736在各個器官中的定量分布進行了研究。以105CFU·mL-1接種后24 h最先在肺中分離到細菌。但隨后細菌在肺中增殖較慢，直到第5天開始迅速增殖，感染后期達到峰值。脾、肝、腎和胰腺從感染后72 h開始分離到細菌。心和大腦在感染后96 h開始分離到該菌。感染后各時間點脾中細菌含量均最高，且隨著時間的增加，細菌量增殖最快，第7 天細菌含量高達1.3×108CFU·g-1。肝、腎和胰腺從72 h開始分離到細菌，隨后隨時間的延長不斷增加。心和大腦是最晚分離到細菌的器官。在感染后96 h開始隨時間延長而增加(表1)。

log10 CFU·g-1

3 討 論

不同血清型的沙門菌致病性可能差別較大。2012年，M.C.Swearingen 等采用口服方法直接感染BALB/c小鼠，對不同來源沙門菌的6個不同亞種包括腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌及副傷寒沙門菌在內的17個血清型共32株沙門菌進行了毒力檢驗，結果表明僅有1株甲型副傷寒菌株和1株鼠傷寒沙門菌株具有較強致病性，其LD50分別為1.6×105CFU 和4.5×105CFU，而其他菌株未使小鼠產生明顯的臨床癥狀[8]。本試驗中牦牛源御成門沙門菌swun3736對BALB/c小鼠的LD50為5×102CFU，其毒性之強在沙門菌中是罕見的。

沙門菌屬于腸桿菌屬，主要在動物腸腔中生長繁殖，可通過腸黏膜上皮細胞進入體內，并隨血液循環(huán)侵入各組織器官，導致全身性感染和菌血癥，引起腹瀉、發(fā)熱及腸道炎癥[9-10]。研究顯示腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌在腸道中主要在人和動物的結腸、盲腸等大腸中增殖，引起結腸炎、盲腸炎及其他腸道炎癥[1，11-13]，隨后侵入微皺褶細胞(M細胞)，然后在集合淋巴結和腸系膜淋巴結內增殖，侵入深層組織，從而突破腸壁屏障引起全身性感染[14-15]。本試驗中組織病理學檢測僅觀察到回腸部分絨毛上皮脫落，嚴重者上皮與固有層組織凝固性壞死，而其他腸段無明顯病變，這就提示了御成門沙門菌腸道的入侵門戶主要為回腸。

脾和肝是腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌在宿主中的主要增殖器官[12，16-18]。本試驗結果表明從72 h開始御成門沙門菌swun3736在肝和脾中持續(xù)性大量增殖，同時組織病理學觀察發(fā)現脾和肝出現凝固性壞死與炎癥細胞浸潤。表明御成門沙門菌在脾和肝的增殖與腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌相似。然而，沙門菌感染肺的病例較為罕見，除非是有免疫缺陷的個體[19]。據報道小鼠采用尾靜脈注射感染鼠傷寒沙門菌時，中性粒細胞的減少能夠明顯促進鼠傷寒沙門菌在小鼠肺和腎中的增殖[20]。本試驗采用口服灌胃的方法感染小鼠，感染24 h后在小鼠肺中最先分離到swun3736，并隨感染時間的延長而進一步增殖，病理變化也很明顯，這就顯示肺也是該菌的主要增殖器官。

據報道沙門菌采用口服感染途徑接種小鼠也能在心臟中增殖[16]。但目前關于沙門菌引起心臟病理變化的描述較少。本研究病理學觀察顯示感染后第48小時心外膜下出現成纖維細胞、巨噬細胞和淋巴細胞增生、浸潤病灶。第72小時心外膜下出現個別心肌壞死，炎性細胞侵潤。從感染后第96小時開始心肌細胞廣泛出現空泡變性。因此，swun3736菌株對心臟的損傷程度也是嚴重的。

御成門沙門菌的強致病力也可能與毒力基因有關。前期研究表明御成門沙門菌攜帶2個毒性質粒及其他多個毒力基因[21]。毒性質粒與致病性直接相關，在全身性感染中發(fā)揮重要作用[22]。這就進一步從分子水平解釋了該菌具有極強毒力的原因。

4 結 論

牦牛源御成門沙門菌swun3736對BALB/c小鼠具有很強的致病力，能引起小鼠的全身性感染。在小鼠實質器官中最先在肺分離到細菌，細菌主要增殖器官為脾、肝和肺。病理學顯示除回腸外其他腸段均無明顯病變，提示御成門沙門菌入侵門戶主要為回腸。

[1] BARTHEL M，HAPFELMEIER S，QUINTANILLA-MARTNEZ L，et al.Pretreatment of mice with streptomycin provides aSalmonellaentericaserovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host[J].InfectImmun，2003，71(5)：2839-2858.

[2] RANIERI M L，SHI C，SWITT A I M，et al.Salmonellaserovar prediction：Comparison of typing methods with a new procedure based on sequence characterization[J].JClinMicrobiol，2013，51(6):1786-1797.[3] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].4版.北京：中國農業(yè)出版社，2007. LU C P.Veterinary microbiology [M].4th edition.Beijing：China Agriculture Press，2007.(in Chinese)

[4] KISIDA S.A NewSalmonellatype(Salmonellaonarimon)[J].KitasatoArchExplMed，1940，17：1-7.

[7] REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].AmJEpidemiol，1938，27(3)：493-497.

[8] SWEARINGEN M C，PORWOLLIK S，DESAI P T，et al.Virulence of 32Salmonellastrains in mice[J].PLoSOne，2012，7(4)：e36043.

[9] RAGHUNATHAN A，REED J，SHIN S，et al.Constraint-based analysis of metabolic capacity ofSalmonellatyphimuriumduring host-pathogen interaction[J].BMCSystBiol，2009，3：38.

[10] OHL M E，MILLER S I.Salmonella：a model for bacterial pathogenesis[J].AnnuRevMed，2001，52：259-274.

[11] HOHMANN A W，SCHMIDT G，ROWLEY D.Intestinal colonization and virulence ofSalmonellain mice[J].InfectImmun，1978，22(3)：763-770.

[12] CARTER P B，COLLINS F M.The route of enteric infection in normal mice[J].JExpMed，1974，139(5)：1189-1203.

[13] DAY D W，MANDAL B K，MORSON B C.The rectal biopsy appearances inSalmonellacolitis[J].Histopathology，1978，2(2)：117-131.

[14] CLARK M A，HIRST B H，JEPSON M A.Inoculum composition andSalmonellapathogenicity island 1 regulate M-cell invasion and epithelial destruction bySalmonellatyphimurium[J].InfectImmun，1998，66(2)：724-731.

[15] CLARK M A，JEPSON M A，SIMMONS N L，et al.Preferential interaction ofSalmonellatyphimuriumwith mouse Peyer's patch M cells[J].ResMicrobiol，1994，145(7)：543-552.

[16] DENG S X，CHENG A C，WANG M S，et al.Quantitative studies of the regular distribution pattern forSalmonellaenteritidisin the internal organs of mice after oral challenge by a specific real-time polymerase chain reaction[J].WorldJGastroenterol，2008，14(5)：782-789.

[17] WATSON K G，HOLDEN D W.Dynamics of growth and dissemination ofSalmonellainvivo[J].CellMicrobiol，2010，12(10)：1389-1397.

[18] SHEPPARD M，WEBB C，HEATH F，et al.Dynamics of bacterial growth and distribution within the liver duringSalmonellainfection[J].CellMicrobiol，2003，5(9)：593-600.

[19] CASADO J L，NAVAS E，FRUTOS B，et al.Salmonellalung involvement in patients with HIV infection[J].Chest，1997，112(5)：1197-1201.

[20] CONLAN J W.Critical roles of neutrophils in host defense against experimental systemic infections of mice byListeriamonocytogenes，Salmonellatyphimurium，andYersiniaenterocolitica[J].InfectImmun，1997，65(2)：630-635.

[21] 張 斌，朱曉霞，岳 華，等.青藏高原部分地區(qū)牦牛源沙門菌血清型及毒力基因的調查[J].畜牧獸醫(yī)學報，2013，44(7)：1167-1172. ZHANG B，ZHU X X，YUE H，et al.The survey study on the serovar and virulent gene of yakSalmonellafrom some areas of Qinghai-Tibetan plateau[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(7)：1167-1172.(in Chinese)

[22] GULIG P A，DANBARA H，GUINEY D G，et al.Molecular analysis of spy virulence genes of theSalmonellavirulence plasmids[J].MolMicrobiol，1993，7(6)：825-830.

(編輯 白永平)

The Study on Pathogenicity of a YakSalmonellaonarimonIsolates in Mice

LEI Zhan-dong，ZHANG Bin，YUE Hua，HUANG Zhi-hong，TANG Cheng*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Salmonellaonarimonis a rare serotypes inSalmonella，and its pathogenicity has not been reported.The aim of this experiment was to study the pathogenicity ofS.onarimonstrain swun3736 isolated from yak in BALB/c mice.Using oral method，we studied its pathogenicity by the median lethal dose (LD50)，the dynamic distribution and histopathological changes in tissues of mice.The results showed that the LD50was 5 × 102CFU.When infected with 105CFU per mice，bacteria were first isolated from lungs at 24 h PI，and spleen，liver，kidneys and pancreas at 72 h post infection (PI)，while brain and heart at 96 h PI.In histopathological examination，it appeared the degeneration，necrosis，inflammatory cell infiltration and other serious damage in the lung，spleen，liver，heart，kidney and ileum.While excepting for ileum，other intestinal bowels exhibited no obvious lesions，suggesting that the ileum was the invasion portal of swun3736.These results demonstrated thatS.onarimonswun3736 has strongly virulence，which indicated that public hygienics significance was worth concerned.

yak；Salmonellaonarimon；LD50；dynamic distribution；histopathology

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.023

2014-06-03

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD13B06)；四川省教育廳創(chuàng)新團隊項目(13TD0057)；西南民族大學中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目(2014NZYQN42；2014ZYXS57)；西南民族大學研究生學位點建設項目(2014XWD-S0906)

雷占東(1987-)，男，河南開封人，碩士生，主要從事獸醫(yī)臨床微生物研究，E-mail：leizhandong2008@163.com

*通信作者：湯 承，E-mail:tangcheng101@163.com

S852.612

A

0366-6964(2015)02-0339-05