李文良，毛 立，程素平，王秋生，黃加春，張紋紋，楊蕾蕾，江杰元*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.海安縣畜牧獸醫(yī)站，海安 226600；3.南通點(diǎn)石生物科技有限公司，南通 226000)

山羊源副流感病毒3型的分離與分子鑒定

李文良1，毛 立1，程素平2，王秋生2，黃加春3，張紋紋1，楊蕾蕾1，江杰元1*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.海安縣畜牧獸醫(yī)站，海安 226600；3.南通點(diǎn)石生物科技有限公司，南通 226000)

2013年下半年至2014年3月，江蘇多地育肥羊出現(xiàn)呼吸道癥狀為主的疾病。采集不同發(fā)病場(chǎng)鼻拭子和血清樣品，檢測(cè)呼吸道相關(guān)病原，在大部分樣品中檢測(cè)到副流感病毒3型。將陽(yáng)性病料接種于MDBK細(xì)胞，連續(xù)傳代5代，經(jīng)RT-PCR和血凝試驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)分離到病毒，命名為JS2013。擴(kuò)增完整的M基因，進(jìn)行進(jìn)化分析表明該毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有獨(dú)特的基因特征。這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道山羊源副流感病毒3型的分離鑒定。

副流感病毒3型；山羊；呼吸道疾??；M基因；進(jìn)化分析

副黏病毒是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道疾病的重要病原，副流感病毒3型(parainfluenza virus type 3，PIV3)是其中的重要成員[1]。PIV3屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬，是有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。該屬病毒包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1、HPIV3)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和仙臺(tái)病毒[2]。PIV3宿主范圍很廣，已報(bào)道在牛、綿羊、山羊、豚鼠、野牛、水牛、犀牛、駱駝等動(dòng)物存在PIV3感染[3]。BPIV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原，對(duì)世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的危害[4]。BPIV3引起的臨床表現(xiàn)差異較大，可以是無(wú)癥狀的亞臨床感染，也可以表現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道疾病。在應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)缺乏、天氣突變等因素刺激下，BPIV3感染能造成組織損傷和免疫抑制，引起支氣管肺炎和繼發(fā)感染，造成較高的發(fā)病率和死亡率[3,5]。

中國(guó)已有牛群中分離到BPIV3的報(bào)道，證實(shí)國(guó)內(nèi)存在BPIV3a和BPIV3c兩個(gè)基因型[6-7]，但尚未有羊群中PIV3感染情況及其與BPIV3關(guān)系的報(bào)道。2013年下半年起江蘇多地山羊養(yǎng)殖場(chǎng)育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，臨床表現(xiàn)等均不同以往。通過(guò)實(shí)際調(diào)查、多次采樣，對(duì)樣品中可能的相關(guān)病原進(jìn)行檢測(cè)，在多數(shù)樣品中檢出PIV3，由細(xì)胞培養(yǎng)分離到病毒，經(jīng)RT-PCR和血凝試驗(yàn)證實(shí)，進(jìn)一步對(duì)其M基因進(jìn)行測(cè)序和進(jìn)化分析，結(jié)果表明該毒株與BPIV3和HPIV3均具有顯著差異，在進(jìn)化上處于獨(dú)立的分支。這將為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Transzol UP試劑、一步法RT-PCR試劑盒、Taq酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2 臨床表現(xiàn)與病料采集

2013年下半年起，江蘇南通等地山羊養(yǎng)殖場(chǎng)育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，發(fā)病率和死亡率較高，藥物治療效果較差。病羊表現(xiàn)為精神沉郁、流漿液或膿性鼻液、逐漸消瘦，部分羊腹瀉。剖檢病羊多數(shù)可見(jiàn)肺不同程度實(shí)變、腹腔積液、胰腫大出血、網(wǎng)膜和腸系膜米粒大小白色結(jié)節(jié)。采集不同地區(qū)9個(gè)羊場(chǎng)70份鼻拭子和血清樣品(表1)，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品采集與PIV3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Table 1 Summary of the sampling，RT-PCR detection results

羊場(chǎng)編號(hào)FarmNo.地區(qū)Location采樣時(shí)間Collectiondate陽(yáng)性數(shù)/總數(shù)No.positive/Total鼻拭子Nasalswabs血清SeraA江蘇海安2013-10-1101/5B江蘇海安2013-10-1106/15C江蘇海安2013-10-1101/5D江蘇海安2013-11-42/90E江蘇海安2013-11-44/50F江蘇海安2014-01-213/130G江蘇如東2014-01-131/21/1H江蘇南京2014-02-254/64/6I江蘇南京2014-03-191/21/1合計(jì)Total25/3714/33

1.3 病原檢測(cè)

取血清樣品和鼻拭子樣品200 μL，加入1 mL Transzol UP，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，最終溶于無(wú)RNase水中。RT-PCR擴(kuò)增采用20 μL體系，其中2×reaction buffer Mix 10 μL，E-Mix 0.5 μL，MF1(AGTGATCTAGATGATGATCCA)/ MR1(GTTATTGATCCAATTGCTGT)各0.5 μL，RNA 4 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)程序：45 ℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

DNA采用常規(guī)酚氯仿抽提法提取。其他相關(guān)病原，羊呼吸道合胞病毒(ORSV)[8]、支原體[9-10]、小反芻獸疫病毒(PPRV)[11]、瘟病毒屬病毒[12]、口蹄疫病毒(FMDV)[13]、牛呼吸道冠狀病毒[14]均采用文獻(xiàn)報(bào)道的RT-PCR或PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 病毒分離鑒定

取陽(yáng)性血清和鼻拭子樣品，加入青鏈霉素，37 ℃孵育30 min，12 000 r·min-1離心20 min，取上清接種MDBK細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)5～7 d后收獲培養(yǎng)物，繼續(xù)傳代4次。提取每一代培養(yǎng)物的RNA，用引物MF1/MR1進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)并測(cè)序。

1.5 血凝試驗(yàn)

通過(guò)血凝試驗(yàn)測(cè)定不同代次病毒的血凝價(jià)。將分離病毒在96孔血凝板上進(jìn)行2倍倍比稀釋，然后加入0.25%豚鼠紅細(xì)胞，37 ℃孵育45 min，以能使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為病毒的血凝價(jià)。

1.6M基因克隆與進(jìn)化分析

根據(jù)GenBank不同毒株基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整M基因的兼并引物：MF2： AGCATCASMARCTCYRRAATMT；MR2：CTATTGYYTRATYTTYCCGACYCCT。反應(yīng)體系同上，反應(yīng)程序：45 ℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將RT-PCR產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送南京斯普金生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用DNAStar、ClastalX1.83軟件分析測(cè)序結(jié)果，推導(dǎo)出氨基酸序列，并與GenBank上參考毒株的M基因序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 5.1軟件采用Neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析分離株與BPIV3和HPIV3的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 病原檢測(cè)

使用BPIV3M基因特異引物MF1/MR1進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性樣品可見(jiàn)329 bp的目的條帶(圖略)。如表1所示，有25/37鼻拭子和14/33血清樣品為陽(yáng)性，占全部樣品的55.7%；羊場(chǎng)陽(yáng)性率為100%。在3/70(A場(chǎng)：2，C場(chǎng)：1)樣品檢出ORSV，在7/70(D場(chǎng)：3，E場(chǎng)：2 H場(chǎng)：2)樣品檢出綿羊肺炎支原體。PPRV、FMDV、牛冠狀病毒、瘟病毒均為陰性。

將M基因RT-PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序，BLAST結(jié)果表明其與BPIV3毒株BN-CE相似性最高，但僅為82%(表略)。進(jìn)一步對(duì)不同樣品RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)完全相同，提示其為同一毒株。

2.2 病毒分離鑒定

將病料處理后接種MDBK細(xì)胞，第2代出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞融合、脫落。取每一代細(xì)胞培養(yǎng)物，用引物MF1/MR1進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，均能擴(kuò)增出相應(yīng)大小目的片段。

取第3、4、5代病毒液進(jìn)行血凝試驗(yàn)測(cè)得其血凝價(jià)分別為1∶25、1∶27和1∶28。以上結(jié)果證明成功分離到PIV3，命名為JS2013。

2.3M基因序列比對(duì)與進(jìn)化分析

使用兼并引物擴(kuò)增M基因完整閱讀框序列，測(cè)序得到1 056 bp的編碼序列，將此M基因序列(GenBank accession No.KJ850331)與GenBank上不同基因型BPIV3毒株以及HPIV3的相應(yīng)基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，其與BPIV3 SF株相似性最高，為80.2%；與HPIV3相似性最低，為77.4%。

進(jìn)化分析結(jié)果表明JS2013具有獨(dú)特的基因特征，與BPIV3的3種基因型以及HPIV3均不同，形成獨(dú)立的分支(圖1)。氨基酸序列相似性高于核酸序列，最高為89.5%(表2)。核酸序列在不同位置均有較大變異(圖略)，氨基酸序列的變異集中在N端110aa部分(圖2)。

3 討 論

呼吸道疾病是危害養(yǎng)羊業(yè)，尤其是圈舍養(yǎng)殖山羊的重要疾病，但對(duì)相關(guān)致病病原的研究資料很少，已知的包括巴氏桿菌、支原體等，其他病毒性病原鮮有報(bào)道。在牛，BPIV3、呼吸道合胞病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、腺病毒、呼吸道冠狀病毒等均與呼吸道疾病發(fā)生相關(guān)。其中BPIV3是危害肉牛養(yǎng)殖的重要病原之一，在應(yīng)激等刺激條件下引起嚴(yán)重的疾病，造成巨大的損失。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有牛群中分離到BPIV3的報(bào)道。但羊群中PIV3的感染情況尚未有研究報(bào)道，國(guó)外的報(bào)道均較早[15-16]，對(duì)其中病原的基因特性及與BPIV3的關(guān)系未知。

表2 JS2013與BPIV3、HPIV3代表毒株核酸、氨基酸序列相似性

Table 2 Nucleotide and amino acid identity between JS2013 and BPIV3&HPIV3 reference strains

%

圖1 M基因序列進(jìn)化分析結(jié)果Fig.1 Phylogenetic analysis based on the entire M gene sequences

圖2 M蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of amino acid sequence of M protein

2013年下半年起江蘇多地山羊養(yǎng)殖場(chǎng)育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，臨床表現(xiàn)較以往嚴(yán)重，藥物治愈率低，提示病原的特殊性。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)不同地區(qū)羊場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)了解調(diào)查、剖檢采樣，對(duì)樣品中可能的相關(guān)病原(PIV3、ORSV、支原體、PPRV、牛冠狀病毒、FMDV)進(jìn)行檢測(cè)。在所有羊場(chǎng)多數(shù)樣品中檢出PIV3，部分羊場(chǎng)少量樣品檢出ORSV和綿羊肺炎支原體，且所有羊場(chǎng)PIV3序列100%相似，提示PIV3是疾病發(fā)生的主要原因，而各個(gè)羊場(chǎng)不同的繼發(fā)感染造成臨床癥狀的差異。我們將進(jìn)行人工感染試驗(yàn)研究其對(duì)山羊、綿羊以及牛的致病性。當(dāng)然，也可能存在其他未知的致病病原，有待進(jìn)一步鑒定。

Y.M.Zhu等提出M基因是對(duì)PIV3進(jìn)行進(jìn)化分析基因分型的最適靶基因[7]。本研究鑒定出的羊源PIV3與已報(bào)道毒株存在很大的差異，與BPIV3毒株最高僅為82%，與HPIV3最高僅為80%。為進(jìn)一步分析其進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)比對(duì)BPIV3序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整M基因的兼并引物，獲得序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該毒株與BPIV3和HPIV3均具有顯著差異，且在進(jìn)化上處于獨(dú)立的分支。因此，建議將其命名為羊副流感病毒3型。

目前病毒的全基因組序列正在測(cè)定中，有必要對(duì)羊群中PIV3以及其他病原流行分布情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究，這將為圈舍養(yǎng)殖條件下羊呼吸道疾病病原學(xué)研究奠定良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

首次報(bào)道從發(fā)病羊中鑒定PIV3，并對(duì)其M基因序列進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)RT-PCR和血凝試驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)分離到病毒，命名為JS2013。擴(kuò)增完整的M基因，進(jìn)行進(jìn)化分析表明該毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有獨(dú)特的基因特征。

致謝：感謝海安縣畜牧獸醫(yī)站孫銀華、丁永龍，南通點(diǎn)石生物科技有限公司黃加春在臨床病例資料整理、樣品采集方面提供的幫助支持。

[1] WANG L F，COLLINS P L，F(xiàn)OUCHIER R A M，et al.Family paramyxoviridae[C]//Virus taxonomy：ninth report of the international committee on taxonomy of viruses.San Diego：Elsevier Academic Press，2011:672-685.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué) [M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：521. LU C P.Veterinary microbiology [M].3rd edition.Beijing：China Agriculture Press，2001:521.(in Chinese)[3] MAIDANA S S，LOMONACO P M，COMBESSIES G，et al.Isolation and characterization of bovine parainfluenza virus type 3 from water buffaloes (Bubalusbubalis) in Argentina[J/OL].BMCVetRes，2012，8:83.[2014-12-26].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3430567/.

[4] HORWOOD P F，GRAVEL J L，MAHONY T J.Identification of two distinct bovine parainfluenza virus type 3 genotypes[J].JGenVirol，2008，89(Pt 7):1643-1648.

[5] HAANES E J，GUIMOND P，WARDLEY R.The bovine parainfluenza virus type-3 (BPIV-3) hemagglutinin/neuraminidase glycoprotein expressed in baculovirus protects calves against experimental BPIV-3 challenge[J].Vaccine，1997，15(6-7):730-738.

[6] 師新川，溫永俊，王鳳雪，等.牛副流感病毒3型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44(11)：1-4. SHI X C，WEN Y J，WANG F X，et al.Eukaryotic expression of nucleocapsid protein gene from bovine parainfluenza virus type 3[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2012，44(11):1-4.(in Chinese)

[7] ZHU Y M，SHI H F，GAO Y R，et al.Isolation and genetic characterization of bovine parainfluenza virus type 3 from cattle in China[J].VetMicrobiol，2011，149(3-4):446-451.

[8] ELERAKY N Z，KANIA S A，POTGIETER L N.The ovine respiratory syncytial virus F gene sequence and its diagnostic application[J].JVetDiagnInvest，2001，13(6):455-461.

[10] MCAULIFFE L，HATCHELL F M，AYLING R D，et al.Detection ofMycoplasmaovipneumoniaein Pasteurella-vaccinated sheep flocks with respiratory disease in England[J].VetRec，2003，153(22):687-688.[11] 毛 立，竇永喜，翟軍軍，等.小反芻獸疫病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2010，40(6):593-597. MAO L，DOU Y X，ZHAI J J，et al.Development of RT-PCR for detection of peste des petits ruminants virus[J].ChineseVeterinaryScience，2010，40(6):593-597.(in Chinese)

[12] VILCEK S，HERRING A J，HERRING J A，et al.Pestiviruses isolated from pigs，cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis[J].ArchVirol，1994，136(3-4):309-323.

[13] XU L，HURTLE W，ROWLAND J M，et al.Development of a universal RT-PCR for amplifying and sequencing the leader and capsid-coding region of foot-and-mouth disease virus[J].JVirolMethods，2013，189(1):70-76.

[14] AMER H M，ABD EL WAHED A，SHALABY M A，et al.A new approach for diagnosis of bovine coronavirus using a reverse transcription recombinase polymerase amplification assay[J].JVirolMethods，2013，193(2):337-340.

[15] TAYLOR W P，MOMOH M，OKEKE A N.Antibodies to parainfluenza 3 virus in cattle，sheep and goats from northern Nigeria[J].VetRec，1975，97(10):183.[16] ELAZHARY M A，SILIM A，DEA S.Prevalence of antibodies to bovine respiratory syncytial virus，bovine viral diarrhea virus，bovine herpesvirus-1，and bovine parainfluenza-3 virus in sheep and goats in Quebec[J].AmJVetRes，1984，45(8):1660-1662.

(編輯 白永平)

Isolation and Identification of Caprine Derived Parainfluenza Virus Type 3

LI Wen-liang1，MAO Li1，CHENG Su-ping2，WANG Qiu-sheng2，HUANG Jia-chun3， ZHANG Wen-wen1，YANG Lei-lei1，JIANG Jie-yuan1*

(1.KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China；2.Hai’ananimalhusbandryandveterinarystation，Hai’an226600，China；3.DianshibiologicaltechnologyCo.，Ltd.，Nantong226000，China)

From Aug 2013 to Mar 2014，fattened goat herds of many farms in Jiangsu province suffered severe respiratory disease.Serum and nasal swab samples were collected and subjected to pathogen detection.Parainfluenza virus type 3 (PIV3) was detected in most of the samples.Positive samples were inoculated onto Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells and passaged 5 times for virus isolation.A novel strain，named JS2013，was successfully isolated as identified by RT-PCR and hemagglutination test.Entire M coding region was amplified and sequenced.Phylogenetic analysis and comparison to other reference sequences available in GenBank indicated JS2013 was clearly distinct from other HPIV3 and BPIV3 strains.This is the first isolation and partial genetic identification of PIV3 from diseased goats.

parainfluenza virus type 3；goat；respiratory disease；Mgene；phylogenetic analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.024

2014-06-18

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(14)2090)

李文良(1984-)，男，河南開(kāi)封人，副研究員，博士，主要從事動(dòng)物傳染病防治和診斷技術(shù)研究，E-mail：kfliwenliang@163.com

*通信作者：江杰元，研究員，博士，Tel：025-84391135，E-mail：jieyuanj57@gmail.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)02-0344-05