樊江峰，陳 鵬，崔 燕，余四九，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

牦牛Fas和FasL基因克隆及其在主要組織器官中的表達(dá)

樊江峰1,2，陳 鵬2，崔 燕1，余四九1，2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

為了進(jìn)一步理解Fas/FasL 系統(tǒng)，本研究擬克隆牦牛Fas和FasL基因，并對2個基因在各組織器官中的表達(dá)進(jìn)行檢測。采用RT-PCR方法克隆牦牛Fas和FasL基因，并利用相關(guān)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)合RT-PCR方法及免疫組織化學(xué)方法對2個基因在牦牛主要組織器官中的表達(dá)進(jìn)行檢測。克隆得到了2 605 bp的牦牛Fas基因 cDNA和1 572 bp 的FasL基因 cDNA序列，與黃牛的相應(yīng)序列有很高的同源性(分別為99.1%和99.4%)。除了在心中只檢測到FasmRNA外，F(xiàn)as和FasLmRNA共同表達(dá)于所有檢測的組織中，且2個基因均在肝、脾、腎、淋巴結(jié)、胸腺和睪丸中強(qiáng)表達(dá)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)FasL蛋白存在于多種體細(xì)胞的胞漿中。結(jié)果表明，除了在淋巴器官和免疫赦免位點(diǎn)外，F(xiàn)as和FasL還強(qiáng)表達(dá)于其他器官如腎和肝，表明Fas/FasL系統(tǒng)比以前所了解的要復(fù)雜。

Fas；FasL；基因克?。槐磉_(dá)；牦牛

Fas抗原，也稱CD95、APO-1或TNFRSF6，是一種Ⅰ型膜蛋白，其分子大小為45 ku,屬于腫瘤壞死因子(TNF)/神經(jīng)生長因子受體家族[1]。 Fas抗原的胞外區(qū)含有3個富含半胱氨酸的重復(fù)區(qū)，為其配體識別位點(diǎn)；胞質(zhì)區(qū)域含有一段約80個氨基酸的保守序列，稱為“死亡域”，能將胞外的凋亡信號傳到胞內(nèi)[2]。Fas基因分別位于小鼠的19號和人的10號染色體上，包含9個外顯子[3-4]。Fas抗原廣泛地表達(dá)于淋巴性及非淋巴性組織和細(xì)胞[5-6]。FasL為Fas的天然配體，是一種40 ku的Ⅱ型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子家族[7]。FasL基因位于小鼠和人的1號染色體上，包含5個外顯子；FasL蛋白表達(dá)于多種組織，如眼睛、睪丸、胸腺、胎盤、食管及子宮等[5-6,8]。

Fas與FasL或Fas抗體結(jié)合后，導(dǎo)致Fas發(fā)生寡聚反應(yīng)，隨之引起死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)的組裝，該復(fù)合體激活起始Caspase，引起一系列酶的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致Fas陽性細(xì)胞凋亡[9]。Fas/FasL凋亡通路最初在淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中被描述，認(rèn)為與免疫系統(tǒng)的幾個重要功能有關(guān)[10]。2種突變型小鼠(lpr小鼠和gld小鼠)在對Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)凋亡的研究中起了重要作用。lpr小鼠Fas基因的第2外顯子插入了1個轉(zhuǎn)座元件，導(dǎo)致不能轉(zhuǎn)錄出全長的FasmRNA，最終產(chǎn)生缺陷的Fas蛋白；gld小鼠的FasL基因發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致FasL蛋白胞外區(qū)的1個氨基酸發(fā)生改變，從而產(chǎn)生無功能的FasL蛋白。2種小鼠表現(xiàn)為以CD4-CD8-T細(xì)胞積累和自身性抗體產(chǎn)生為特點(diǎn)的淋巴組織增生和自身免疫性疾病，對這些小鼠的研究表明，F(xiàn)as/FasL凋亡通路參與了外周淋巴器官中的自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的刪除及與抗原反應(yīng)后被激活的T細(xì)胞的消除。此外，F(xiàn)as/FasL凋亡通路是細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺死靶細(xì)胞的一種機(jī)制[11-13]；FasL結(jié)構(gòu)性的表達(dá)于多種免疫赦免位點(diǎn)，如眼睛、胎盤突和睪丸等，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asL可以誘導(dǎo)侵入眼睛應(yīng)答病毒感染對Fas敏感的炎性細(xì)胞的凋亡[14]，結(jié)合其他證據(jù)表明FasL參與了眼睛免疫赦免現(xiàn)象[15]，因此研究者們懷疑Fas/FasL系統(tǒng)能夠介導(dǎo)浸入免疫赦免位點(diǎn)的淋巴細(xì)胞的凋亡，從而參與免疫赦免現(xiàn)象的維持；另外，F(xiàn)asL在多種腫瘤組織和細(xì)胞上表達(dá)，暗示Fas/FasL系統(tǒng)可能與腫瘤的免疫逃逸機(jī)制有關(guān)[16]； Fas/FasL系統(tǒng)還在病毒性疾病中被誘導(dǎo)，可能與病毒的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)程有關(guān)[17]。近年來，越來越多的證據(jù)表明活化Fas可以導(dǎo)致非凋亡結(jié)果，如細(xì)胞增殖[18]；例如，在人紅細(xì)胞生成早期，F(xiàn)as引起的caspase活化為紅細(xì)胞生成提供一個陽性刺激，而非改變細(xì)胞增殖或引起凋亡[19]。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動死亡的現(xiàn)象，是在進(jìn)化中保守的生物化學(xué)過程，對維持多細(xì)胞生物體的正常發(fā)育、組織和細(xì)胞的更新、清除自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義。盡管由Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是細(xì)胞凋亡途徑中研究的最為詳盡的凋亡通路，但現(xiàn)有的研究主要集中在人和小鼠的免疫系統(tǒng)、免疫赦免位點(diǎn)以及腫瘤細(xì)胞和組織，有關(guān)Fas/FasL系統(tǒng)在其他組織中功能的研究相對較少，且研究Fas和FasL的資料在別的動物上還很罕見，為了進(jìn)一步理解該系統(tǒng)，并為以后研究Fas/FasL系統(tǒng)提供資料依據(jù)，本研究克隆牦牛的Fas和FasL基因，并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，對2個基因在牦牛各主要組織器官中的表達(dá)進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Ficoll-PaqueTMPLUS購自Amersham Biosciences；Trizol試劑、GoldScript cDNA synthesis kit 及TA Cloning kit購自英駿公司；Ex Taq Mix 和TaKaRa LA Taq購自寶生物公司；抗體購自Abcam(rabbit polyclonal to CD95，ab82419；rabbit polyclonal to FasL，ab2440)；PV-9000 polymer detection system for immunohistological staining kit、DAB kit 及防脫片購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Gel Extraction Spin Kit購自GENOMED，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 血樣采自青海省西寧市屠宰場，頸靜脈采血，ACD抗凝，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室分離淋巴細(xì)胞。組織樣除睪丸、卵巢、子宮、黃體、輸卵管、胎盤突及泌乳乳腺采自西寧屠宰場成年牦牛外，其余的均采自大通牦牛場5月齡的屠宰小牛。動物屠宰后，用無菌剪刀迅速采集樣品，無菌生理鹽水將樣品沖洗干凈后修成約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小后，用于RT-PCR的樣品迅速投入液氮中，用于免疫組化的樣品固定于4%多聚甲醛中，帶回實(shí)驗(yàn)室后換1次新鮮的固定液，4 ℃保存。所有組織樣品均采集3份，來自不同牦牛個體。

1.2.2 總RNA提取 血樣淋巴細(xì)胞用Ficoll-PaqueTMPLUS分離。Trizol法提取血樣及組織樣總RNA， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測總RNA的質(zhì)量，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析 利用RT-PCR法克隆牦牛Fas和FasL基因?；邳S牛Fas(GenBank 登錄號：NM_174662)和FasL(GenBank 登錄號：NM_001098859)的cDNA序列，用Primer Premier 5軟件在兩個基因的編碼區(qū)側(cè)翼設(shè)計引物。得到3對引物(表1)，引物1和引物2用于Fas基因克隆，引物3克隆FasL基因。引物1產(chǎn)物的3′和引物2產(chǎn)物的5′重疊。采用β-actin為內(nèi)參基因，β-actin引物引自Ann-Sofi Bergqvist[20]。用Invitrogen公司的GoldScript cDNA synthesis kit試劑盒，以O(shè)ligo dT為引物，按說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。得到的cDNA用作隨后PCR擴(kuò)增的模板。引物1、引物2、引物3及β-actin引物的擴(kuò)增體系相同：上下游引物各0.5 μL(10 pmol·L-1)，2 μL模板cDNA，0.2 μL LATaqDNA polymerase，1 μL 10 mmol·L-1dNTP，2 μL 10 ×LA Taq buffer 和18.8 μL 無菌去離子水。引物1、引物2、引物3的擴(kuò)增條件除Tm值外均相同，如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，Tm (引物1、引物2、引物3的Tm值分別為60、53、55 ℃) 50 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。β-actin引物的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及質(zhì)量用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用凝膠回收試劑盒回收目的片段，克隆后篩選陽性克隆送交華大基因公司測序。

表1 試驗(yàn)中所用引物

Table 1 Primers used in this study

引物名稱Primer上游(5'-3')Upstream下游(5'-3')Downstream產(chǎn)物大小/bpProductsize引物1AGTCGGGGCTCACTACTCAC(61)TGGAATGGGGTCAACCTGTG(1506)1465引物2TGTTCATCTTCTTGCCTGTT(1378)TTAGGTAGTTCGGAGCATC(2646)1287引物3TTCCTTCTCTTGAGCAGTCA(79)CACACACACACACCCCTACA(1631)1572β-actin引物GACCCAGATCATGTTTGAGACCATCTCCTTCTGCATCCTGTCAG598Fas檢測引物TTTTGTTGTCAGCCTTGTCC(308)CATTTGGTGTTGCTCGTTGG(630)323FasL檢測引物CAGCAGCCCTTGAATTACC(195)CTCCATCAGCACCATGTCC(857)663

括號中數(shù)字表示引物在參考序列中的位置

Numbers in brackets indicate the location of primers in reference sequences

利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列組裝、同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析、基因編碼蛋白質(zhì)序列的推導(dǎo)，利用NCBI的BLAST軟件對克隆測序后的目的基因進(jìn)行比對分析，使用ORF Finder軟件進(jìn)行ORF分析(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。利用SignalP軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-2.0/)和TMHMM軟件進(jìn)行跨膜區(qū)分析(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)。用于同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析的其他物種的Fas及FasL基因序列從GenBank上下載，登錄號分別見表2和表3。

1.2.4 RT-PCR分析 對牦牛的各種組織進(jìn)行RT-PCR分析，每個組織樣品做3次平行，用于平行試驗(yàn)的同一組織樣品來自3個不同牦牛個體。檢測的組織：心、肝、脾、肺、腎、大腦、丘腦、垂體、脊髓、眼角膜、淋巴結(jié)、胸腺、骨骼肌、卵巢、子宮、輸卵管、黃體、睪丸、胎盤突、乳腺、食管、真胃和結(jié)腸。cDNA第一鏈的合成與基因克隆步驟中相同。在基因的編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計引物，目的產(chǎn)物跨越該基因不同的外顯子。得到Fas及FasL檢測引物(表1)，仍以基因克隆步驟所用β-actin引物作為內(nèi)參。Fas、FasL和β-actin引物的擴(kuò)增體系相同：上下游引物各0.5 μL (10 pmol· L-1)，2 μL cDNA 模板，12.5 μL ExTaqDNA 聚合酶，9.5 μL 無菌去離子水，總體系為25 μL。3對引物的擴(kuò)增條件除退火溫度不同外其余均相同：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，Tm (Fas、FasL和β-actin引物的Tm值分別為54、55、58 ℃) 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。DNA污染檢測在反轉(zhuǎn)錄時用去離子水代替反轉(zhuǎn)錄酶。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照，圖片用Adobe Photoshope CS軟件連接和標(biāo)記。用凝膠回收試劑盒回收目的片段，送交生物公司測序以確定是否為目的產(chǎn)物。

1.2.5 免疫組化分析 保存于4 ℃，4%多聚甲醛固定的組織按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，4 μm厚切片，37 ℃烤片24 h。二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)浸泡5 min后進(jìn)行抗原修復(fù)，具體步驟：將切片置于一含有約500 mL 0.01 mol·L-1(pH 6.0)檸檬酸鹽的塑料罐中，置于微波爐(LG，WP700)中，調(diào)至高火加熱，沸騰2 min后調(diào)至低火保持15 min，自然冷卻。0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)洗3 min×2次；0.3% H2O2室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)洗3 min×3次，滴加一抗(用 PBS 將Fas抗體稀釋80倍，F(xiàn)asL抗體稀釋120倍)，濕盒中37 ℃孵育2 h；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)洗3 min×3次，免疫反應(yīng)用PV-9000 polymer detection system for immunohistological staining kit，依據(jù)說明進(jìn)行檢測，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后中性樹脂封片，鏡檢照相。陰性對照用PBS代替一抗。

2 結(jié) 果

2.1Fas及FasL基因克隆及生物信息學(xué)分析

如預(yù)期結(jié)果，用引物1和引物2分別擴(kuò)增得到1 465和1 287 bp cDNA序列，組裝后得到2 605 bp的牦牛Fas基因cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明該序列包含86 bp的5′非翻譯區(qū)，969 bp的編碼區(qū)和1 550 bp的3′非翻譯區(qū)。969 bp的編碼區(qū)編碼1段長323個氨基酸的蛋白質(zhì)序列，預(yù)計的分子量為36.22 ku，理論等電點(diǎn)為7.02。牦牛Fas蛋白在氨基端有1段長22個氨基酸殘基的信號肽序列，中間有1段20個氨基酸的跨膜區(qū)，將整個蛋白分成胞外區(qū)(148個氨基酸殘基)和胞質(zhì)區(qū)(133個氨基酸殘基)。用引物3擴(kuò)增得到1 572 bp的牦牛FasL基因cDNA序列，大小與預(yù)期結(jié)果一致。該序列包含114 bp的5′非翻譯區(qū)，831 bp的編碼區(qū)和627 bp的3′非翻譯區(qū)。牦牛FasL基因的編碼區(qū)編碼277個氨基酸序列，生物信息學(xué)分析顯示羧基端179個氨基酸殘基在胞外，氨基端75個氨基酸殘基在胞內(nèi)，跨膜區(qū)含23個氨基酸殘基，無信號肽序列?？寺〉玫降年笈as和FasL基因序列提交保存到GenBank中，收錄號分別為JN880421和JN880420。

利用DNAMAN軟件對牦牛Fas和FasL的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見表2和表3。Fas和FasL氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分別如圖1A和1B。

2.2 RT-PCR檢測Fas及FasL基因在牦牛各器官中的表達(dá)

采用RT-PCR法對Fas和FasL基因在牦牛各組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，同一組織做3次平行試驗(yàn)，樣品來自3個不同牦牛個體，結(jié)果見圖2和表4。盡管未做定量分析，但不同組織目的條帶亮度的差異可在平行試驗(yàn)中重復(fù)觀察到，說明不同組織間條帶亮度的差異是由目的基因mRNA濃度的差異而非試驗(yàn)誤差引起。FasmRNA在所有被檢測的組織中均表達(dá)，而在肝、脾、腎、淋巴結(jié)、睪丸、胎盤突、泌乳乳腺中表達(dá)量明顯高于其他組織。FasLmRNA除在心中未檢測到外，在別的器官中均能檢測到，同F(xiàn)as一樣，在脾、肝、腎、淋巴結(jié)、胸腺、睪丸和胎盤突中強(qiáng)表達(dá)，而在別的器官中弱表達(dá)。

圖1 不同物種Fas(A)和FasL(B)系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 The evolution of Fas (A) and FasL (B) amino acid sequences among different species

表2 牦牛和不同物種間Fas基因序列和氨基酸序列同源性比較

Table 2 Homologous comparisons of nucleotide and amino acid sequences of yakFasgene with other species

物種SpeciesGenBank登錄號GenBankaccessionnumber核苷酸序列同源性/%Nucleotideidentity氨基酸序列同源性/%Aminoacididentity夜猴AotustrivirgatusAF344835.170.956.6牛BostaurusNM_174662.299.198.8普通狨CallithrixjacchusEU252152.171.155.9白領(lǐng)白眉猴Cercocebustorquatusat-ysAF344843.170.858.4貓F(tuán)eliscatusAB009279.171.459人HomosapiensNM_15287157.259.1獼猴MacacamulattaAY007572.171.257.2小鼠MusmusculusM83649.155.348.3歐洲兔OryctolaguscuniculusAB021296.158.258.1綿羊OvisariesAB011671.194.791.3大鼠RattusnorvegicusNM_139194.242.947.3野豬SusscrofaNM_213839.167.267.6

表3 牦牛和不同物種間FasL基因序列和氨基酸序列同源性比較

Table 3 Homologous comparisons of nucleotide and amino acid sequences of yakFasLgene with other species

物種SpeciesGenBank登錄號GenBankaccessionnumber核苷酸序列同源性/%Nucleotideidentity氨基酸序列同源性/%Aminoacididentity牛BosTaurusNM_001098859.199.499.3狼CanislupusXM_848916.189.088.1貓F(tuán)eliscatusNM_001009352.187.889.5原雞GallusgallusNM_001031559.158.156.1人HomosapiensNM_000639.183.388.4獼猴MacacamulattaNM_001032838.186.787.3小鼠MusmusculusBC052866.167.776.4黑猩猩PantroglodytesXM_524967.283.488.4大鼠RattusnorvegicusNM_012908.168.674.9野豬SusscrofaAY033634.190.089.5

2.3 免疫組化檢測Fas和FasL在牦牛各器官中的表達(dá)

試驗(yàn)中所用Fas和FasL抗體均為兔抗鼠多克隆抗體(rabbit polyclonal to CD95，ab82419；rabbit polyclonal to FasL，ab2440)。Fas在所有組織中均未檢測到陽性反應(yīng)，可能由抗原之間的種屬差異性造成。而FasL在腎、肝、垂體、真胃、子宮、結(jié)腸、胎盤突和黃體中檢測到了陽性反應(yīng)，如圖3。在腎的近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、腎小球和集合管中均有陽性反應(yīng)，但在近曲小管中反應(yīng)較強(qiáng)(圖3a)；肝中在肝細(xì)胞的胞質(zhì)中有斑點(diǎn)狀的陽性反應(yīng)(圖3b)；腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部的部分細(xì)胞呈陽性(圖3c)；真胃的部分壁細(xì)胞和主細(xì)胞呈陽性(圖3d)；子宮和結(jié)腸腺體細(xì)胞呈陽性(圖3e和圖3f)；在胎盤突中，部分滋養(yǎng)層巨細(xì)胞(包括單核和雙核)呈陽性(圖3g)；黃體中多數(shù)顆粒性黃體細(xì)胞呈陽性(圖3h)。陰性對照均呈陰性(資料未顯示)。RT-PCR結(jié)果及免疫組化結(jié)果見表4。

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.大腦；7.丘腦；8.垂體；9.脊髓；10.眼角膜；11.淋巴結(jié)；12.胸腺；13骨骼??；14.卵巢；15.子宮；16.輸卵管；17.黃體；18.睪丸；19.胎盤突；20.乳腺；21.食管；22.真胃；23.結(jié)腸1.Heart；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Brain；7.Thalamus；8.Pituitary gland；9.Spinal cord；10.Cornea；11.Lymph node；12.Thymus；13.Skeletal muscle；14.Ovary；15.Uterus；16.Oviduct；17.Corpus luteum；18.Testis；19.Placentome；20.Breast；21.Esophagus；22.Abomasums；23.Colon圖2 Fas和FasL 在牦牛各組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of Fas and FasL in yak tissues

3 討 論

本試驗(yàn)克隆得到了包含完整編碼區(qū)的牦牛Fas和FasL基因cDNA序列。人、小鼠和牛的Fas抗原分別由335、327和323個氨基酸組成，均在氨基末端有一信號肽序列。成熟的Fas抗原可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)；胞外區(qū)富含半胱氨酸，可分為3個亞區(qū)域，是TNFR家族共同的特征，為各自配體提供識別位點(diǎn)；Fas抗原的胞質(zhì)區(qū)域含有一段保守序列，稱為“死亡域”，在TNFR家族中高度保守，其作用為將胞外的凋亡信號轉(zhuǎn)到到胞內(nèi)[4,21-22]。分析發(fā)現(xiàn)，牦牛Fas抗原由323個氨基酸殘基組成，同人、小鼠和牛的一樣，氨基端含有長22個氨基酸殘基的信號序列，中間有1段20個氨基酸的跨膜區(qū)，將整個蛋白分成胞外區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞外區(qū)富含半胱氨酸，可分為3個亞區(qū)域，胞質(zhì)區(qū)含有 “死亡域”。人、小鼠和牛的FasL分別由281、279 和278個氨基酸組成，末端無信號肽序列，中間有一段疏水序列，提示其為Ⅱ型膜蛋白；FasL的羧基末端在胞外，富含脯氨酸的氨基末端在胞內(nèi)[7,23-24]。如結(jié)果所述，牦牛的FasL由277個氨基酸殘基組成，胞外區(qū)含179個氨基酸殘基，胞質(zhì)區(qū)含75個氨基酸殘基，跨膜區(qū)含23個氨基酸殘基。同源性分析發(fā)現(xiàn)兩個基因均與其他物種的相應(yīng)序列有較高的同源性，與黃牛的同源性均在99%以上(表2和表3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)as和FasL在不同物種間同源性的高低與動物學(xué)分類結(jié)果一致，這種同源性不僅在一定程度上代表著物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，同時也反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對其功能的重要性。此外，F(xiàn)asL在進(jìn)化過程中似乎比Fas較為保守(圖1)。

a.腎，近曲小管呈強(qiáng)陽性(如箭頭所示)，遠(yuǎn)曲小管(帶尾箭頭)和腎小球(星號)呈較強(qiáng)陽性；b.肝，肝細(xì)胞胞質(zhì)中呈斑點(diǎn)狀著色；c.垂體，腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部部分細(xì)胞呈強(qiáng)陽性；d.真胃，壁細(xì)胞(箭頭)和部分主細(xì)胞(帶尾箭頭)呈陽性；e.子宮，腺體細(xì)胞呈陽性；f.結(jié)腸，腺體細(xì)胞呈陽性；g.胎盤突，部分單核(帶尾箭頭)和雙核(箭頭)滋養(yǎng)層巨細(xì)胞呈強(qiáng)陽性；h.黃體，顆粒性黃體細(xì)胞呈陽性(箭頭)a.Kidney，strongly reaction are found in proximal convoluted tubules (arrowhead) and moderately stained are found in distal convoluted tubules (arrow)，glomerulus (stellate)；b.Liver，positive stains are found in cytoplasm of liver cells；c.Pituitary gland，positive reaction is found in cytoplasm of partial adenohypophysis cells；d.Abomasums，positive stains are found in cytoplasm of parietal cells (arrowhead) and some chief cells (arrow)；e.Uterus，positive reaction is only found in gland；f.Colon，positive stains are only found in gland；g.Placentome，positive stains could be found in cytoplasm of both mononuclear (arrow) and binuclear (arrowhead) trophoblast giant cells；h.Corpus luteum，positive reaction is found in cytoplasm of granular lutein cell (arrowhead)圖3 FasL蛋白在牦牛各器官中的定位Fig.3 Immunolocalization of FasL in yak tissues

表4Fas和FasL基因mRNA和FasL蛋白在牦牛各組織中的表達(dá)

Table 4 Expression ofFas，F(xiàn)asLmRNA and FasL in yak tissues

組織TissueRT-PCR檢測RT-PCRpositivityFasFasLFasL免疫組化反應(yīng)ImmunohitochemistrypositivityofFasL心Heart0.7620.000NF肝Liver1.8960.850####脾Spleen1.8842.107NF肺Lung1.4580.735NF腎Kidney3.0421.258####大腦Brain1.3960.280NF丘腦Thalamus1.4510.109NF垂體Pituitary1.250.559###脊髓Spinalcord1.770.609NF眼角膜Cornea0.8220.064NF淋巴結(jié)Lymphnode2.8581.312NF胸腺Thymus0.9470.740NF骨骼肌Skeletalmuscle1.0070.472NF卵巢Ovary0.9570.647NF子宮Uterus0.8930.122##輸卵管Oviduct0.5040.973NF黃體Corpusluteum0.5170.516###睪丸Testis1.5352.669NF胎盤突Placentome0.5490.511####泌乳期乳腺Breast1.7370.826NF食管Esophagus1.0850.483NF真胃Abomasums1.0740.693###結(jié)腸Colon0.9780.085#

RT-PCR法及免疫組化法分析Fas及FasL在牦牛各器官中的表達(dá)。數(shù)值代表目的基因瓊脂糖凝膠電泳條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。免疫反應(yīng)強(qiáng)度：####、###、##、#分別代表強(qiáng)、中度、弱和很弱陽性，NF代表在該組織中未檢測到陽性反應(yīng)

RT-PCR and immunohistochemistry methods were carried out to analyze the expression of Fas and FasL in yak.Numerical values represent the gray value ratio of the bands of target gene to the internal reference gene.The immunoreaction intensity of FasL in analyzed tissues：####，###，##，# represent strong reaction，moderate reaction，weak reaction and very weak reaction，respectively，all the positive reactions are found in the cytoplasm of the positive cells.NF indicate no immunoreactions are found in analyzed tissues

E.Lars等[5]對Fas和FasL在小鼠各種組織器官中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)2個基因共同表達(dá)于小鼠的多種組織中，F(xiàn)asmRNA在所有檢測的組織中都表達(dá)，而FasLmRNA除在心、肝以及胰腺中未檢測到外，在別的組織中也都表達(dá)；隨后X.Luc等[6]對2個基因在人各種組織器官中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)Fas廣泛表達(dá)于人的各種組織中，而FasL只在胎盤、睪丸、肺、食管和子宮等少數(shù)組織中表達(dá)。Fas/FasL通過激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(AICD)作用參與外周淋巴器官中的自身反應(yīng)性T細(xì)胞及活性T細(xì)胞克隆的消除，從而在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；FasL在睪丸和胎盤突等免疫赦免位點(diǎn)可能通過誘導(dǎo)浸入的Fas陽性淋巴細(xì)胞的凋亡而使它們免受免疫反應(yīng)的破壞；Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡可能參與了子宮、食管等上皮組織正常的細(xì)胞更替[5-6]。本研究中，RT-PCR結(jié)果表明，F(xiàn)as和FasL共同表達(dá)于牦牛除心之外的各種器官中，同在小鼠和人上所發(fā)現(xiàn)的一樣，F(xiàn)asL不只是在淋巴性組織中表達(dá)，它與Fas還共同表達(dá)于免疫赦免位點(diǎn)(如睪丸和胎盤突)以及其他組織(如肝和腎)，進(jìn)一步說明Fas/FasL系統(tǒng)不只在免疫系統(tǒng)中起重要作用，還可能參與免疫赦免的維持以及上皮組織中正常的細(xì)胞更替。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as和FasLmRNA的濃度在脾、淋巴結(jié)和胸腺等淋巴性組織中較高；對于典型的免疫赦免位點(diǎn)，睪丸和胎盤突中Fas和FasLmRNA濃度都較高，而眼睛和大腦中FasL的濃度都很低；在既非淋巴性組織也非免疫赦免位點(diǎn)的肝和腎中，F(xiàn)as和FasLmRNA濃度也較高，而在別的組織中都相對較低，這種表達(dá)量的差異是否說明Fas/FasL系統(tǒng)在不同組織中有不同的功能還不清楚，需要進(jìn)一步研究。另外，在小鼠和人的肝中均未檢測到FasL，小鼠肝細(xì)胞組成型地表達(dá)Fas抗原，對FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相當(dāng)敏感，給小鼠施以FasL或Fas抗體則會引起肝炎和肝損傷而致命[10]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在牦牛的肝中Fas和FasL共同表達(dá)，似乎與在小鼠上的發(fā)現(xiàn)相矛盾，需要進(jìn)一步深入研究。

FasL蛋白以膜結(jié)合(mFasL)和可溶性(sFasL)2種形式存在，sFasL是由金屬蛋白酶裂解結(jié)合在細(xì)胞膜上的FasL得到的[25]，A.Lorraine等通過構(gòu)建2種基因工程小鼠研究得出，mFasL是Fas/FasL 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必須的[26]，mFasL和sFasL之間的平衡可能是調(diào)節(jié)Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[27]。mFasL除了在細(xì)胞膜上存在外，還可以以囊泡的形式存在于胞質(zhì)中，這種結(jié)合FasL的囊泡可分泌到胞外并能有效激活由Fas介導(dǎo)的培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡[28]。通過一些來自人胎盤的研究資料可以對存在于胞質(zhì)中的FasL功能進(jìn)行推測。胎盤是一個典型的免疫赦免位點(diǎn)，因?yàn)槟赣H的免疫系統(tǒng)能夠接受而非排斥帶有一半異己抗原的胎兒[29]。表達(dá)FasL的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是母親對胎兒產(chǎn)生免疫耐受的機(jī)制[30]。人胎盤FasL由合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成，以膜結(jié)合的形式結(jié)合在囊泡上后儲存在胞質(zhì)中，并可分泌到胞外。L.Frangsmyr[31]等對以囊泡形式存在于胞質(zhì)中的FasL的功能進(jìn)行了推測：首先，F(xiàn)asL以囊泡的形式存在可以保留其膜結(jié)合的形式，而mFasL是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵；其次，F(xiàn)asL以囊泡的形式存在能比只結(jié)合到細(xì)胞膜上產(chǎn)生更大的表面積；再次，囊泡形式的FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以不依賴細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸及重新合成FasL蛋白質(zhì)；另外，囊泡形式的FasL較可溶性的FasL有較低的移動性，從而能夠增加FasL的局部濃度，提高其起始凋亡的能力；還有，F(xiàn)asL以囊泡的形式分泌到細(xì)胞間隙內(nèi)能夠避免與靶細(xì)胞直接接觸給胎盤帶來的損毀，因?yàn)橛性囼?yàn)證明膜結(jié)合的FasL可以引發(fā)炎性反應(yīng)。在本試驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果表明，F(xiàn)asL存在于牦牛腎、肝、垂體、真胃、子宮、結(jié)腸、胎盤突和黃體等幾個器官的多種細(xì)胞的胞質(zhì)中，而像脾、淋巴結(jié)、胸腺和睪丸等強(qiáng)烈表達(dá)FasLmRNA的器官中未檢測到陽性信號，推測可能的原因是本試驗(yàn)中所用的FasL抗體只能與存在于胞質(zhì)中的FasL而非結(jié)合到細(xì)胞膜上的FasL結(jié)合，說明有可能FasL在腎、肝、垂體、真胃、子宮、結(jié)腸、胎盤突和黃體等組織的細(xì)胞中以囊泡的形式存在于胞質(zhì)中，通過分泌到胞外而發(fā)揮作用，而在淋巴性細(xì)胞中以及其余的組織中FasL合成后直接結(jié)合到細(xì)胞膜上，通過細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸而發(fā)揮作用。

Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在免疫系統(tǒng)中的重要作用無可爭議，然而還沒有絕對的證據(jù)說明Fas/FasL系統(tǒng)是否真的參與免疫赦免現(xiàn)象的維持以及在上皮組織細(xì)胞的更替中起重要作用，因?yàn)樵趌pr和gld小鼠中這些組織未發(fā)現(xiàn)異常。在本文引言中提到，越來越多的證據(jù)表明Fas/FasL系統(tǒng)具有非凋亡的功能，所以很有必要揭示Fas/FasL系統(tǒng)在非淋巴性組織器官中起誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還是行使非凋亡的功能。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到了牦牛Fas和FasL基因部分cDNA序列，均包含完整的開放閱讀框，GenBank登錄號分別為JN880421和JN880420；2個基因都與牛的相應(yīng)序列有很高的同源性，分別為99.1%和99.4%；Fas和FasL基因共同表達(dá)于牦牛除心之外的各種器官中；FasL存在于牦牛多種體細(xì)胞的胞質(zhì)中。

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(編輯 郭云雁)

Cloning，Expression，and Localization ofFasandFasLGenes in Yaks

FAN Jiang-feng1,2，CHEN Peng2，CUI Yan1，YU Si-jiu1,2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China； 2.TechnologyandResearchCenterofGansuProvinceforEmbryonicEngineeringofBovineandSheep&Goat，Lanzhou730070，China)

To further understand the function of Fas/ FasL system，theFasandFasLgenes of yak were cloned by RT-PCR method and their expressions were analyzed by combination of RT-PCR and immunohistochemistry.A complete cDNA sequences in 2 605 bp ofFasgene and 1 572 bp ofFasLgene of yak was obtained.These sequences were highly homology with cattle.FasandFasLmRNAs were co-expressed in all analyzed tissues except heart which expressedFasmRNA alone.The two genes strongly co-expressed in liver，spleen，kidney，lymphonodus，thymus and testis.A cytoplasmic form of FasL protein was detected in several cell types of various organs.Fas and FasL were strongly co-expressed in lymphoid organs and immune privilege sites，they were also strongly co-expressed in other tissues like kidney and liver.The results suggested that Fas/FasL system was more complicated.

Fas；FasL；gene cloning；expression；yak

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.008

2012-02-09

甘肅省科技支撐計劃項(xiàng)目(1204NKCA075)；甘肅省青年科技基金計劃項(xiàng)目(1208RJYA081)

樊江峰(1980-)，男，甘肅靜寧人，副教授，主要從事動物生殖生理方面的研究，E-mail：fanjf@gsau.edu.cn

*通信作者：余四九，教授，E-mail：sjyu@163.com

S823.8+5.2

A

0366-6964(2015)02-0228-11