謝麗基，謝芝勛，黃　莉，謝志勤，鄧顯文，劉加波，羅思思，黃嬌玲， 曾婷婷，張艷芳，王　盛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530001)

禽呼腸孤病毒蛋白質(zhì)啟動(dòng)PI3K/Akt信號通路的分析

謝麗基，謝芝勛*，黃莉，謝志勤，鄧顯文，劉加波，羅思思，黃嬌玲， 曾婷婷，張艷芳，王盛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530001)

旨在找出激活PI3K/Akt信號通路的禽呼腸孤病毒(ARV)蛋白質(zhì)。選取ARV中潛在具有激活PI3K/Akt信號通路活性的σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S蛋白作為研究對象，將這5個(gè)基因克隆到真核表達(dá)載體pcAGEN，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，采用間接免疫熒光和Western blot檢測目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot，檢測轉(zhuǎn)染后Vero細(xì)胞磷酸化Akt(P-Akt)的表達(dá)量。結(jié)果顯示，5個(gè)目的蛋白質(zhì)均得到表達(dá)。轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero細(xì)胞，P-Akt的表達(dá)量明顯升高，而使用PI3K特異性抑制劑LY294002則能抑制P-Akt的表達(dá)量明顯升高。結(jié)果表明，ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路。

禽呼腸孤病毒；PI3K/Akt信號通路；蛋白質(zhì)

真核細(xì)胞內(nèi)存在多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路在眾多信號通路中發(fā)揮十分重要的作用，可通過其下游效應(yīng)分子蛋白激酶B(Akt)來調(diào)控多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖與分化、抑制細(xì)胞凋亡等，病毒感染通常會(huì)干擾該信號通路。PI3K是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85所組成的二聚體蛋白，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性[1]。研究表明，病毒蛋白質(zhì)或細(xì)胞蛋白質(zhì)通過PXXP(P為脯氨酸，X為任意氨基酸)或YXXXM/YXXM(Y為酪氨酸，X為任意氨基酸，M為蛋氨酸)基序與p85結(jié)合，從而激活PI3K/Akt信號通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表達(dá)量升高，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-7]。

L.Labrada等[8]和W.L.Shih等[9]的研究表明，禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)引起感染細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡是發(fā)生在其感染的中后期。P.Y.Lin等[10]使用ARV感染Vero細(xì)胞后，通過Western blot檢測P-Akt的表達(dá)量，從病毒的角度證實(shí)ARV感染的早期激活PI3K/Akt信號通路，從而抑制感染細(xì)胞的凋亡，以有利于ARV完成其復(fù)制周期。ARV有10個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、μBc、μBN、σA、σB、σC)和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(μN(yùn)SC、μN(yùn)S、σNS、和P10、P17)[11-12]， ARV是通過哪一個(gè)蛋白質(zhì)來啟動(dòng)PI3K/Akt信號通路，實(shí)現(xiàn)抑制感染細(xì)胞的凋亡，目前還不清楚。

本研究對ARV 15個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行了分析，表明其中σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S共5個(gè)蛋白質(zhì)具有PXXP和YXXXM/YXXM基序(即這5個(gè)蛋白質(zhì)具有潛在激活PI3K/Akt信號通路的活性)，并且這些氨基酸序列在ARV不同毒株之間都是保守的。因此本課題選取這5個(gè)蛋白質(zhì)作為研究對象，構(gòu)建了重組質(zhì)粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，分析Vero細(xì)胞P-Akt表達(dá)量的差異，旨在找出能激活PI3K/Akt信號通路的ARV蛋白，從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度揭示ARV的分子致病機(jī)制，為尋找抗ARV藥物作用靶點(diǎn)提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞禽呼腸孤病毒S1133標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(ARV-S1133)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；真核表達(dá)載體pcAGEN由美國南達(dá)科他州大學(xué)Xiu-qing Wang教授惠贈(zèng)；Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2試劑及儀器TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ與NotⅠ)和T4連接酶購自寶生物工程(大連) 有限公司；Easy pure viral DNA/RNA kit、膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購自北京TransGen Biotech公司； Lipofectamin2000購自Invitrogen公司；Alexa fluor 488標(biāo)記的羊抗雞IgY、Alexa fluor標(biāo)記的羊抗兔IgG 、HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和Phospho-Akt 單克隆抗體購自CST公司；DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Cytofix固定/破膜試劑盒購自BD公司；PI3K特異性抑制劑LY294002購自CST公司；ARV陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。貝克曼Navios 流式細(xì)胞儀；Invitrogen IblotTM干式Western blotting轉(zhuǎn)印儀；BioRad成像系統(tǒng)。

1.2引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)ARV的σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S基因序列，設(shè)計(jì)了5對引物(表1)，斜體標(biāo)記為酶切位點(diǎn)(XhoⅠ與NotⅠ)，下劃線處為Kozak序列。

1.3核酸提取與目的基因擴(kuò)增

參照Easy pure viral DNA/RNA kit說明書，抽提ARV的RNA，使用試劑盒TaKaRa RNA LA PCR Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4與pMD18-T載體的連接及轉(zhuǎn)化

使用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。得到的陽性質(zhì)粒分別命名為σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μN(yùn)S-pMD18-T。

1.5重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pcAGEN、σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μN(yùn)S-pMD18-T。 將真核表達(dá)載體pcAGEN質(zhì)粒和含有目的基因的pMD18-T質(zhì)粒分別用XhoⅠ與NotⅠ進(jìn)行雙酶切，切膠回收，使用T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。陽性克隆分別命名為σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN。陽性重組質(zhì)粒送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

表1引物序列

Table 1Primer sequence

擴(kuò)增基因Gene引物名稱Primername引物序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)目的片段/bpTargetfragmentsizeσAσA?FσA?RGATGATCTCGAGGCCACCATGGCGCGTGCCATATACGACATCGCGGCCGCTTAGGCGGTAAAAGTGGCTAGAAC1248σNSσNS?FσNS?RGATGATCTCGAGGCCACCATGGACAACACCGTGCGTGTTATCGCGGCCGCTTACGCCATCCTAGCTGGAGAGAC1101μAμA?FμA?RGATGATCTCGAGGCCACCATGGCCTATCTAGCCACACCTATCGCGGCCGCTTAGTGCTCGCCTCCAACCGTCGA2196μBμB?FμB?RGATGATCTCGAGGCCACCATGGGAAACGCAACGTCTGTCATCGCGGCCGCTTACGATGGTTTGAACAACGTCTG2028μN(yùn)SμN(yùn)S?FμN(yùn)S?RGATGATCTCGAGGCCACCATGGCGTCAACCAAGTGGGGAATCGCGGCCGCTTACAGATCATCCACCAACTCTTC1905

1.6轉(zhuǎn)染細(xì)胞

參照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書大量提取質(zhì)粒(pcAGEN、σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000的使用說明，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染長成單層的Vero細(xì)胞(6孔板)，同時(shí)設(shè)立陰性細(xì)胞對照組。

1.7間接免疫熒光、Western blot檢測目的蛋白質(zhì)的表達(dá)

轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞2、4、6、12和24 h后，用PBST洗滌3次，用置于-20 ℃保存的冷丙酮(丙酮∶乙醇=2∶3)進(jìn)行固定，500 μL·孔-1，室溫作用10 min。用PBST洗滌3次，加入1∶100倍稀釋的ARV陽性血清200 μL·孔-1，37 ℃作用1 h。用PBST洗滌3次，加入1∶500稀釋的Alexa fluor標(biāo)記的羊抗雞IgY，200 μL·孔-1，37 ℃作用1 h。用PBST洗滌3次，加甘油緩沖液(甘油∶PBS=1∶1)100 μL·孔-1。倒置熒光顯微鏡下觀察。

同時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后的Vero細(xì)胞，參照Z.Xie等[13]的方法，對目的蛋白質(zhì)σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S進(jìn)行Western blot檢測。

1.8流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測P-Akt的表達(dá)

由于ARV激活P-Akt是發(fā)生在ARV感染的早期，并且根據(jù)1.7的檢測結(jié)果，選擇轉(zhuǎn)染4、6和12 h后的Vero細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和Western blot的檢測。收集的Vero細(xì)胞，用Cytofix固定/破膜試劑盒固定細(xì)胞20 min，F(xiàn)ACS洗滌2次，加入1∶100稀釋的Phospho-Akt 單克隆抗體作用30 min，F(xiàn)ACS洗滌2次，加入1∶500稀釋的Alexa fluor標(biāo)記的羊抗兔IgG 作用30 min，F(xiàn)ACS洗滌1次，加入300 μL FACS重懸浮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測P-Akt的表達(dá)量，記錄分析數(shù)據(jù)。

同時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后的Vero細(xì)胞，參照X.Wang等[14]的方法，對Vero細(xì)胞中的P-Akt進(jìn)行Western blot檢測。重復(fù)整個(gè)試驗(yàn)3次。

1.9依賴于PI3K途徑的檢測

按照1.6的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)立σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、LY294002+σA-pcAGEN、LY294002+σNS-pcAGEN、pcAGEN和空白細(xì)胞對照組。轉(zhuǎn)染前1 h，LY294002+σA-pcAGEN和LY294002+σNS-pcAGEN組，加入PI3K特異性抑制劑LY294002，并使終濃度為20 μmol·L-1。然后按照1.8的步驟檢測P-Akt的表達(dá)。分析檢測轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN后，細(xì)胞P-Akt表達(dá)的升高是否依賴于PI3K的激活。

2　結(jié)　果

2.1目的基因的擴(kuò)增

擴(kuò)增的σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S編碼基因片段大小與預(yù)期相符(圖1)。

2.2重組質(zhì)粒的體外瞬時(shí)表達(dá)

間接免疫熒光和Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染6 h后，目的蛋白質(zhì)σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S均得到了較好的表達(dá)，而空載體pcAGEN組和陰性細(xì)胞對照組均為陰性。其中，轉(zhuǎn)染6 h的間接免疫熒光檢測結(jié)果見圖2，Western blot檢測結(jié)果見圖3。

M.DL2500 bp ladder DNA marker；1.σA；2.σNS；3.μA；4.μB；5.μN(yùn)S圖1　σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S編碼基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1　PCR amplified products of σA，σNS，μA，μB and μN(yùn)S encoding gene

2.3流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測P-Akt的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN在轉(zhuǎn)染細(xì)胞4、6和12 h后，陽性率均高于陰性對照組和pcAGEN空載體組(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN的Vero細(xì)胞P-Akt的表達(dá)量，明顯高于陰性對照組和pcAGEN空載體組(表2)。而μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，陽性率與陰性對照組和pcAGEN空載體組差異不大(P>0.05)，表明P-Akt的表達(dá)量未產(chǎn)生明顯變化。在σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN轉(zhuǎn)染的不同時(shí)間里(4、6和12 h)，Vero細(xì)胞P-Akt的表達(dá)量差異不大。轉(zhuǎn)染6 h的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖4，Western blot檢測結(jié)果見圖5。

A.陰性對照；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μN(yùn)S-pcAGENA.Negative control；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μN(yùn)S-pcAGEN圖2　重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后的瞬時(shí)表達(dá)(6 h)Fig.2　Expression of recombined plasmid on the transfected Vero cells (6 h)

1.陰性對照；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μN(yùn)S-pcAGEN1.Negative control；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μN(yùn)S-pcAGEN圖3　Western blot 檢測目的蛋白質(zhì)的表達(dá) (6 h)Fig.3　Western blot analysis of the expression of the proteins(6 h)

使用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法，檢測轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN后，細(xì)胞P-Akt表達(dá)的升高是否依賴于PI3K的激活。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LY294002+σA-pcAGEN和LY294002+σNS-pcAGEN的細(xì)胞，P-Akt的表達(dá)量明顯少于轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN的細(xì)胞(P<0.05)，而與pcAGEN和空白細(xì)胞對照組差異不大(P>0.05)，說明細(xì)胞P-Akt表達(dá)的升高，依賴于σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN對PI3K激活。Western blot的檢測結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致。

Table 2　FCM analysis of the P-Akt expression levels (±s) %

同一行中相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，不同字母代表差異極顯著(P<0.01)

Different letters in the same row means extremely significant difference between the treatments (P<0.01)，same letters in the same row means no significant difference between treatments (P>0.05)

A.陰性對照；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μN(yùn)S-pcAGENA.Negative control；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μN(yùn)S-pcAGEN圖4　流式細(xì)胞術(shù)檢測P-Akt的表達(dá)Fig.4　FCM analysis of the P-Akt expression levels

1.陰性對照；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μN(yùn)S-pcAGEN1.Negative control；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μN(yùn)S-pcAGEN圖5　Western blot 檢測P-Akt的表達(dá)Fig.5　Western blot analysis of the P-Akt expression levels

3　討　論

大量的研究資料表明，當(dāng)病毒侵入宿主細(xì)胞后，被感染的細(xì)胞能被宿主的免疫系統(tǒng)識別，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而對感染了病毒的細(xì)胞加以清除，從而限制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及傳播[15-17]。但是在選擇壓力的作用下，許多病毒已經(jīng)進(jìn)化出某些可以逃避細(xì)胞凋亡的機(jī)制，使得病毒在宿主細(xì)胞死亡之前能完成其復(fù)制周期，這些對抗措施通常是由病毒蛋白質(zhì)來介導(dǎo)的[6，15-17]。許多病毒通過自身的某些蛋白質(zhì)與PI3K的 P85調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)P-Akt的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。P-Akt 表達(dá)量的升高，可磷酸化許多信號蛋白，并通過這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)與細(xì)胞生存、增殖、遷移、分化和凋亡有關(guān)的多條下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如通過抑制促凋亡蛋白質(zhì)的活性，從而抑制凋亡刺激信號誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，還可通過控制凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡[2-7，18-19]。

目前，還未見有相關(guān)研究報(bào)道指出，ARV是通過哪一個(gè)病毒蛋白質(zhì)來激活PI3K/Akt信號通路的。本研究選取ARV中潛在具有激活PI3K/Akt信號通路的σA、σNS、μA、μB和μN(yùn)S蛋白作為研究對象，將這5個(gè)ARV蛋白質(zhì)的編碼基因克隆到真核表達(dá)載pcAGEN，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN。將構(gòu)建的5種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot，檢測轉(zhuǎn)染后Vero細(xì)胞P-Akt的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero 細(xì)胞，P-Akt 的表達(dá)量明顯升高。而轉(zhuǎn)染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN前在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PI3K特異性抑制劑LY294002，結(jié)果顯示檢測到的P-Akt并沒有升高，說明Akt磷酸化依賴于PI3K的激活，首次證實(shí)了ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt信號通路。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可抑制宿主細(xì)胞的凋亡，以有利于病毒的復(fù)制[2-7，14，18-19]。與許多病毒相似，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與ARV的復(fù)制有密切關(guān)系[10]，因此，有望通過控制ARV σA蛋白和σNS蛋白的表達(dá)，來調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而抑制ARV的復(fù)制，從而發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)，為ARV的治療提供新的方向和思路。同時(shí)，本研究從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度，揭示了ARV的分子致病機(jī)制，也為進(jìn)一步探索針對ARV的有效防治措施提供理論依據(jù)。

Y.Shin等[6]對甲型流感病NS1蛋白的研究表明，NS1蛋白同時(shí)通過PXXP和YXXXM位點(diǎn)與p85結(jié)合，從而激活了PI3K/Akt信號途徑。人乳頭瘤病毒則通過YXXM位點(diǎn)來激活PI3K/Akt信號途徑[7]。ARV的σA和σNS蛋白是否與這些病毒一樣，是通過PXXP或YXXXM/YXXM基序與P85結(jié)合，從而激活PI3K/Akt信號通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表達(dá)量升高，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的，還有待進(jìn)一步的研究。

本研究將構(gòu)建的μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μN(yùn)S-pcAGEN重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，采用間接免疫熒光和Western blot檢測，證實(shí)μA、μB和μN(yùn)S這3個(gè)目的蛋白質(zhì)，與σA和σNS一樣均得到了很好的表達(dá)，但在轉(zhuǎn)染后的檢測中卻發(fā)現(xiàn)，其轉(zhuǎn)染的細(xì)胞P-Akt的表達(dá)量并沒有明顯改變，推測這3個(gè)蛋白質(zhì)與PI3K/Akt信號通路之間并沒有直接的激活作用。μA、μB和μN(yùn)S這3個(gè)蛋白質(zhì)以及ARV的其他蛋白質(zhì)是否有增強(qiáng)或抑制σA和σNS激活PI3K/Akt信號通路的作用，目前還不清楚。W.L.Shih等[9]構(gòu)建表達(dá)ARVσC蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒σC-pcDNA3.1，σC-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，σC蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。σC蛋白的功能，與ARV σA和σNS蛋白的功能(抑制細(xì)胞凋亡)相反，σC蛋白的表達(dá)是否會(huì)抑制σA和σNS蛋白激活PI3K/Akt信號通路，目前也還不清楚。這些問題還有待進(jìn)一步的研究。

4　結(jié)　論

ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活PI3K/Akt信號通路，使細(xì)胞P-Akt的表達(dá)量增高。

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(編輯白永平)

The Study of the Activation of PI3K/Akt Pathway by the Protein of Avian Reovirus

XIE Li-ji，XIE Zhi-xun*，HUANG Li，XIE Zhi-qin，DENG Xian-wen，LIU Jia-bo，LUO Si-si， HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting，ZHANG Yan-fang，WANG Sheng

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandDiagnostics，Nanning530001，China)

This study was conducted to find out the avian reovirus (ARV) proteins which can activate the phosphatidylinositol 3-Kinase-dependent Akt(PI3K/Akt) pathway.According to the analysis of amino acid sequence of ARV proteins，the σA，σNS，μA，μB and μN(yùn)S were selected as the putative proteins which mediated the activation of PI3K/Akt pathway.Reconbinant plasmids，σA-pcAGEN，σNS-pcAGEN，μA-pcAGEN，μB-pcAGEN and μN(yùn)S-pcAGEN were constructed and transfected into Vero cells，and the expression of the target genes were identified by immunofluorescence test and Western blot.The phosphorylated Akt (P-Akt) profile of transfected cells were examined by flow cytometry and Western blot.The results showed that σA，σNS，μA，μB and μN(yùn)S genes were expressed in the Vero cells，and the expression of P-Akt of σA-pcAGEN and σNS-pcAGEN groups increased markedly.The PI3K inhibitor LY294002 could inhibit the expression of the P-Akt of σA-pcAGEN and σNS-pcAGEN groups.The results indicate that σA and σNS protein could activate the PI3K/Akt pathway.

ARV；PI3K/Akt pathway； protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.017

2014-12-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160512)；廣西特聘專家專項(xiàng)(2011B020)；廣西科技重大專項(xiàng)(1222003-2-4)

謝麗基(1981-)，女，廣西靈山人，副研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究, Tel:0771-3120371, E-mail: xie3120371@126.com

*通信作者：謝芝勛， E-mail: xiezhixun@126.com

S852.659.4

A

0366-6964(2015)09-1613-07