楊少華，許傳田，黃艷艷，張 琳，黃慶華，胡北俠，朱曼玲，張秀美

(山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100)

野生水禽源ClassⅠ新城疫病毒對SPF雞的致病性研究

楊少華，許傳田，黃艷艷，張 琳，黃慶華，胡北俠，朱曼玲，張秀美*

(山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100)

為了科學地了解新城疫病毒(NDV)的遺傳進化規(guī)律，本研究對從鷺科候鳥分離的NDV毒株 SD22/13的生物學特性和致病特性進行了研究。通過致病性指數(shù)測定和交叉血凝抑制試驗測定分離株SD22/13的毒力及與LaSota疫苗株、基因Ⅶ型NDV毒株的抗原相關性，同時設計引物對F基因進行克隆測序和遺傳進化分析，并對其在SPF雞上的致病性進行評價。生物學特性和遺傳進化分析顯示SD22/13屬于ClassⅠ分支基因3型，與LaSota疫苗株的抗原相關性為56.1%，與基因Ⅶ型強毒株的抗原相關性低于50%。致病性試驗結果表明該毒株可在雞體內較好復制，并刺激機體產生較高水平血清抗體，雞的免疫器官和腎雖均有輕微的病理損傷，但無發(fā)病死亡，對試驗雞致病性較低；SD22/13感染后30 d，再以基因Ⅶ型強毒株攻毒，在10 d觀察期內SD22/13感染組雞均健康，無發(fā)病死亡，而對照組雞至第5天時全部死亡。本研究結果表明分離株SD22/13在生物學特性、抗原性和對SPF雞致病性方面與基因Ⅶ型NDV存在明顯差異；雖然SD22/13與基因Ⅶ強毒株抗原相關性較低，不能阻止其排毒，卻能完全保護雞抵抗強毒株的攻擊。

新城疫病毒；野生水禽；致病性

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的感染多種禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的法定報告疫病，給許多國家的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失[1]。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)又稱為禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus serotype 1，APMV-1)在分類上屬于單鏈負股RNA病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)[2]。NDV都包含相同的6個開放閱讀框，基因排列方式為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼6種結構蛋白，即核衣殼蛋白、磷蛋白、基質蛋白、融合蛋白、血凝素-神經氨酸酶蛋白和大分子蛋白[3]。NDV基因組全長有3種：15 186、15 192和15 198 bp，其中前2種屬于ClassⅡ；后1種屬于ClassⅠ[4-5]。ClassⅡ中強毒株主要來源于家禽，也有少數(shù)來自野鳥，而ClassⅠ和ClassⅡ中的低致病型毒株主要來源于水禽、野鳥和活禽交易市場[6]。

野生水禽被認為是NDV的天然存儲庫[7-8]，但是目前對于它的分布情況、遺傳變異以及對雞群的潛在威脅了解的甚少。為了更好地理解ClassⅠNDV的生物學特性及對不同宿主的致病性，本研究對從野生水禽上分離的一株ClassⅠ型NDV進行了生物學和遺傳學特性鑒定，并對其在SPF雞的致病性進行了評價，研究結果將為ND的防控提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒、SPF雞胚、SPF雞

分離株SD22/13是2013年對江西九江鄱陽湖區(qū)野鳥NDV的流行病學調查中從鷺科健康野鳥采集的樣品中分離，由吉林大學畜牧獸醫(yī)學院鑒定并惠贈。SPF雞胚、30日齡SPF雞購自山東省農業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2 分子生物學試劑

Trizol、RNase Inhibitor、RTase M-MLV、rTaq、dNTP等購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購自上海生物工程有限公司。

1.3 病毒的生物學特性鑒定

按國際獸疫局(OIE)推薦的方法，測定病毒的最小致死量致死雞胚的平均時間(MDT)、雞腦內接種指數(shù)(ICPI)和雞胚半數(shù)致死量(ELD50)。

1.4F基因的序列測定與遺傳進化分析

按文獻[9]方法擴增F基因，PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢查結果，陽性PCR產物送上海生工生物技術有限公司測序。用于序列比較NDV參考株名稱和GenBank序列登陸號如下：US(DE)/A100-2093/2000(EF564815)、US(MD)/03-62(EF564827)、US(DE)/401(EF564831)、JX07(JF893453)、J17-13(AB858995)、D-SD-24-05(FJ597593)、 US(TX)/02-25/2002(EF565030.1)、US(MD)/01-418(EF564829)、US(MD)/01-523(EF564830)、 duck/U.S./119535-1(AY626266)、mallard/US(MD)/02-336(EF564825)、9a5b(AB524406)、US(AK)/176/1998(EF564813)、US(OH)/87-78(EF564833)、US(LA)/88-71(EF565076)、US(DE)/2026(EF564819)、sw/CH/LHLJ/120608(KJ499462)、ndv10-062(HQ997385)、NDV09-051(HQ398808)、NDV08-004(FJ487637)、NDV10-089(HQ997397)、 fowl/HongKong/1368.3/2005(EF027151)、HongKong/1875/2004(EF027154)。利用DNAStar Lasergene 7.1和MEGA4.1軟件進行序列比對和遺傳進化分析。

1.5 交叉血凝抑制試驗

按照常規(guī)方法將疫苗株LaSota和純化的NDV分離株SD22/13、Duck/China/SD03/2009(GenBank登陸號JN400895，簡寫為SD03)、Chichen/China/SDLY01/2010(GenBank登陸號JN400897，簡寫為SDLY01)制備疫苗，其中分離株SD03和SDLY01分別為基因Ⅶ型鴨源和雞源強毒分離株，由本室分離保存[9]。將上述4種疫苗分別免疫2月齡SPF雞，制備抗血清。將4種NDV抗原和陽性血清分別進行交叉HI試驗，HI抗原同源性的計算按免疫學方法進行：R=(r1×r2)1/2×100%，r1=異源血清效價1/同源血清效價1，r2=異源血清效價2/同源血清效價2。

1.6 NDV分離株致病性試驗

1.6.1 試驗分組與設計 50只21日齡SPF雞分成2組，第一組35只以106.0EID50的SD22/13病毒尿囊液以滴鼻、點眼方式感染雞；第二組15只為對照組，以PBS滴鼻點眼。分別于隔離罩中飼養(yǎng)，記錄試驗雞臨床癥狀和發(fā)病死亡情況。感染后7、14、21、30 d采血測血清抗體滴度，感染后3、7、14、21 d采集各組試驗雞喉頭、泄殖腔棉拭子，接種10日齡的雞胚，檢測排毒情況；感染后第48、144、240小時每組取3只雞，剖檢，取心、肺、脾、腺胃、腸等內臟器官組織，做熒光定量PCR，測定組織中病毒載量；感染后第7、14天剖檢，取腦、氣管、肺、腺胃、小腸、肝、脾、腎、法氏囊于10%甲醛中固定，按常規(guī)方法做HE染色、觀察。

1.6.2 SD22/13對基因Ⅶ型強毒攻毒保護試驗 上述一、二組試驗雞隔離飼養(yǎng)觀察至30 d，分別以106.0EID50的基因Ⅶ型強毒株SD03以滴鼻點眼的方式攻毒，攻毒后觀察10 d，第2、7天分別采集喉頭和泄殖腔棉拭子，接種10日齡雞胚，死亡雞胚收取尿囊液，進行血凝和血凝抑制試驗檢測病毒。

1.6.3 熒光定量PCR試驗 根據SD22/13F基因序列設計引物，上游序列：5′-ATGCCCAAAGACAAAGAACA-3′，下游序列：5′-GGCTACACCTAATGCGACAC-3′，β-actin為參比基因，參照文獻[10]設計，上游序列：5′-GAGAAATTGTGCGTGACATCA-3′，下游序列：5′-CCTGAACCTCTCATTGCCA-3′。制備10倍系列稀釋的標準質粒制備標準曲線。稱取0.1 g組織，于TroZol中勻漿，按常規(guī)方法提取RNA，測定濃度，用TaKaRa的M-MLV反轉錄酶將RNA翻譯成cDNA。根據Roche Lightcycler 480 SYBR Green ⅠMaster熒光定量PCR試劑盒說明書加入各體系，反應體系為20 μL，包含Marster Mix10 μL，上下游引物各1 μL，水6 μL，樣品cDNA或已知濃度的標準質粒2 μL，于Lightcycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche，Basel，Switzerland)上進行擴增。PCR反應條件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。病毒含量的定量根據標準曲線計算獲得。

2 結 果

2.1 分離株SD22/13的生物學特性

生物特性鑒定結果顯示SD22/13的MDT>120 h，ICPI<0.2，根據國際獸疫局(OIE)推薦的毒力判定標準，SD22/13為低毒力株。

2.2 交叉血凝抑制試驗

SD22/13與不同毒株間交叉HI結果表明，分離株SD22/13與疫苗株LaSota的抗原同源性為56.1%，與鴨源基因Ⅶ型毒株SD03的抗原同源性為43.7%，與雞源基因Ⅶ型毒株SDLY01的抗原同源性為49.2% (表1)。

表1 SD22/13與不同NDV毒株間的HI同源性

Table 1 Correlations rate of HI among different NDV strains

病毒株VirusstrainSD22/13SD03SDLY01LaSotaSD22/13/43．7%49．2%56．1%SD0343．7%/94．9%82．5%SDLY0149．2%94．9%/89．4%LaSota56．1%82．5%89．4%/

2.3 病毒F基因序列與遺傳進化分析

分離株SD22/13F基因長1 662 bp (GenBank登錄號：KM669996)，編碼553個氨基酸，其F蛋白裂解位點的氨基酸序列為112E-R-Q-E-R-L117，符合弱毒株的序列特征。經分析F蛋白含有 6個潛在的糖基化位點(85—87、191—193、366—368、447—449、471—473和541—543 位)和12個半胱氨酸殘基(76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523)。用MEGA4.1軟件繪制F基因高變區(qū)(47—420 nt)核苷酸序列遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)SD22/13與J72-13(AB858995)等毒株同屬于ClassⅠ基因3型(圖1)。將F基因編碼區(qū)的核苷酸序列與其他參考毒株進行比較，顯示SD22/13與2013年從南昌斑嘴鴨上分離的毒株J72-13的相似性最高，為99.2%，其次為2012年的野天鵝分離株SW/CH/LHCJ/120608，相似性為98.9%，與香港分離株Hong Kong/1875/2004的相似性為93.9%。

2.4 試驗雞感染SD22/13后臨床癥狀及病理變化

試驗組雞與對照組相比精神、采食量正常，無顯著臨床癥狀，在觀察期內無發(fā)病死亡。試驗組和對照組的雞剖檢，內臟組織器官均未發(fā)現(xiàn)眼觀明顯病變。通過對攻毒后第7和14天內臟組織器官的病理組織觀察發(fā)現(xiàn)：攻毒后第7天內臟組織未發(fā)現(xiàn)明顯病變；攻毒后第14天可見法氏囊淋巴細胞輕微減少，脾淋巴細胞明顯減少，腎出血，有炎性細胞浸潤(圖2)。

圖1 SD22/13 F基因可變區(qū)(47—420 bp)的系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic relationship of the nucleotide sequence of SD22/13 based on a variable portion (47-420 bp) of the F gene

A.法氏囊淋巴細胞輕微減少；B.脾淋巴細胞明顯減少；C.腎出血，有炎性細胞浸潤A.Lymphocyte slightly deceased in bursa at 14 dpi；B.Lymphocyte significantly deceased in spleen at 14 dpi；C.Kidney bleeding and inflammatory cells infiltration at 14 dpi圖2 攻毒后SPF雞內臟組織病理變化(HE染色，400×)Fig.2 Histopathological changes detected by HE staining in different organ of chicken experimentally infected with SD22/13 (HE staining，400×)

2.5 試驗雞感染后喉頭和泄殖腔病毒檢測

對各組試驗雞于感染后第3、7、14、21天采集喉頭、泄殖腔棉拭子處理后接種9～10日齡雞胚進行病毒分離，結果見表2。試驗組雞自攻毒后第7天從喉頭和泄殖腔中可檢出病毒，檢測陽性率均為50%，至第21天從喉頭和泄殖腔中仍可檢測到病毒，但檢測陽性率下降至16.7%，而對照組試驗雞喉頭、泄殖腔均未檢出病毒。

表2 試驗雞攻毒后不同時間喉頭和泄殖腔棉拭子排毒檢測結果

Table 2 Results of virus isolation from laryngeal and cloacal swabs of chickens on different day post inoculation

組別Group喉頭棉拭子Laryngealswab泄殖腔棉拭子Cloacalswab第3天Day3第7天Day7第14天Day14第21天Day21第3天Day3第7天Day7第14天Day14第21天Day21試驗組Experimentgroup0/63/63/61/60/63/62/61/6對照組Controlgroup0/60/60/60/60/60/60/60/6

2.6 感染后不同時間內臟器官病毒含量檢測

對感染后第48、144、240小時試驗組和對照組的雞內臟組織病毒載量進行熒光定量PCR檢測，結果見圖3。從結果可知在感染后所檢測各臟器均檢出病毒，脾、肺、腸、腺胃的病毒含量在攻毒后第48小時時達最高值，之后呈逐漸下降的趨勢；心、氣管的病毒量在攻毒后緩慢上升，至第240小時時達到最高；在各臟器中腸的病毒載量最高，之后依次是脾、肺、腦、腺胃、氣管，心的含毒量最低。

圖3 感染后不同時間組織器官病毒載量變化Fig.3 Viral load change of organs in different time after infection

2.7 試驗雞感染后NDV抗體檢測

各組試驗雞于感染后第7、14、21、30天每組隨機取5只采血，進行NDV抗體檢測，結果見圖4。攻毒后第7天試驗組抗體平均值為7.83 log2，至第14天時抗體滴度達到峰值，為8.67 log2，至第30天時試驗組雞抗體平均值為7.4 log2，而對照組血清抗體為0。

圖4 試驗雞NDV HI抗體效價Fig.4 Antibody titre of chickens in Hemagglutination inhibition (HI) test

2.8 SD22/13對基因Ⅶ型強毒攻毒保護試驗

30 d觀察期結束后，試驗組剩余的26只雞和對照組的6只雞均健康，用SD03強毒株以106.0EID50的劑量對其進行攻毒，于隔離罩中隔離飼養(yǎng)觀察。SD22/13感染組雞在10 d的觀察期內精神、食欲正常，無發(fā)病死亡，而對照組雞在攻毒后第2天死亡1只，第3天時5只全部死亡，SD22/13感染組雞第7天的喉頭拭子和泄殖腔拭子均檢出病毒。

3 討 論

野鳥和野生水禽被認為是 NDV的天然儲庫，從野鳥和野生水禽分離到的NDV多為ClassⅠ弱毒株[6,11-12]，從家養(yǎng)水禽中也有分離到ClassⅠNDV弱毒株的報道。劉秀梵(X.Liu)等于2002—2005 年間我國東部活禽交易市場家鴨中分離201株 NDV，其中14.9% 為ClassⅠ毒株[11]。L.M.Kim等在香港活禽市場健康活禽泄殖腔拭子中分離到NDV，其中ClassⅠ毒株占 91.3%[8]。本室曾于2007—2008年間從山東肉鴨場健康鴨泄殖腔拭子中分離到了 30株NDV，其中有4株為ClassⅠ[13]。可見ClassⅠNDV在我國健康禽群的帶毒率很高[14]。

本研究所用毒株SD22/13是從江西野生鷺科水鳥分離，屬于ClassⅠ分支基因3型，與近年來我國南方地區(qū)、香港活禽交易市場分離到的毒株遺傳關系較近。SD22/13為弱毒株，對雞無明顯致病性，但SPF 雞在感染后的第7天開始排毒，至第21天時仍可檢測到，而內臟組織在第2天即檢測出病毒；血清抗體水平在感染1周后達到8.67log2，至第30天時抗體滴度為7.4log2。表明SD22/13可于雞體內以較高的滴度復制，并可刺激機體產生較強的體液免疫反應，這與趙晨辰的研究結果一致[14]。

交叉血凝抑制試驗顯示，SD22/13與疫苗株LaSota的抗原相關性為56.1%，與ClassⅡ分支中基因Ⅶ型毒株的抗原相關性低于50%。雖然SD22/13與ClassⅡ分支中毒株的抗原相關性較低，但SD22/13攻毒后30 d再以基因Ⅶ型強毒株攻毒，攻毒雞無發(fā)病死亡，精神食欲正常，對照組雞全部死亡，表明ClassⅠ弱毒株SD22/13對雞起到了完全的保護，但喉頭和泄殖腔棉拭子仍能檢測出排毒。孟春春(C.C.Meng)等對ClassⅠ弱毒株JS10的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)注射JS10的SPF雞35 d后再以基因Ⅶ型強毒株ZJ1攻毒，雞無發(fā)病死亡，與注射LaSota的對照組相比，排毒時間減少，排毒量降低[15]。

目前ClassⅡ的基因Ⅶ型NDV仍是我國禽群中的主要流行毒株，但ClassⅠNDV在禽群中的高帶毒率也應引起重視。雖然ClassⅠNDV對家禽無明顯的致病性，在家禽中的帶毒狀態(tài)在一定程度上有利于提高家禽對ND的保護，但另一方面NDV毒株間的相互影響和作用增加了病毒變異的可能。目前雖然尚不清楚 ClassⅠ毒株在 NDV 演化過程中的作用，但在實驗室條件下ClassⅠ型NDV可在體外傳代過程中逐漸演變?yōu)閺姸局闧16]，ClassⅠ NDV毒株在野鳥和雞群中循環(huán)，存在演變成強毒株的風險，因此，加強對NDV的分子流行病學監(jiān)測，研究ClassⅠNDV的毒力演化局勢及對禽群的影響對于預防和控制ND具有重要的意義。

4 結 論

SD22/13屬于ClassⅠ基因3型弱毒株，能在雞體內以較高的滴度復制，并能刺激機體產生高水平抗體。雖然與疫苗株LaSota和基因Ⅶ型NDV的抗原相關性較低，但SD22/13毒株能完全保護試驗雞抵抗基因Ⅶ型強毒株的攻擊，但不能抑制其排毒。

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(編輯 白永平)

Research on Pathogenicity of SPF Chicken Infected with a Class Ⅰ NDV Isolated from Waterfowl

YANG Shao-hua，XU Chuan-tian，HUANG Yan-yan，ZHANG Lin，HUANG Qing-hua， HU Bei-xia，ZHU Man-ling，ZHANG Xiu-mei*

(ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding，InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100,China)

A lentogenic Newcastle disease virus (NDV)，SD22/13，was isolated from heron.The biology and pathogenicity were characterized in order to understand the evolution of NDV better.Fgene of SD22/13 was sequenced and compared with that of reference strains.The antigenicity of the virus was compared with that of LaSota and other genotype Ⅶ virulent NDV strains via cross hemagglutination inhibition (HI).The pathogenicity of SD22/13 to SPF chicken was also conducted.The results indicated that SD22/13 was classified as a class Ⅰ genotype 3 NDV based on a partial sequence of theFgene.The antigenicity correlation between SD22/13 and LaSota was 56.1%，and the correlation of which with genotype Ⅶ NDV strains was less than 50%.Experiments on animals demonstrate that the isolate SD22/13 can replicate well in SPF chicken and induce a high immune antibody and had slight pathogenic to immune organ and kidney.Chickens inoculated with SD22/13 were challenged with genotype Ⅶ virulence NDV strain on 30dpi，and there had no death in chickens infected with SD22/13.The results demonstrated that SD22/13 stain had significant differences with genotypeⅦ NDV in biological characterization and pathogenic to chickens.Although the antigenic correlation was low between SD22/13 and genotype Ⅶ NDV，class I viruses can provide 100% protection rate，but it cannot block virus shedding upon challenge with genotypeⅦ virulent NDV.

Newcastle disease virus；wild waterfowl；pathogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.016

2014-12-06

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201003012；201303033)；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-42-Z12)

楊少華(1978-)，女，山東煙臺人，碩士，助理研究員，主要從事禽病綜合防控技術研究，Tel:0531-88622611，E-mail：ysh7865@163.com

*通信作者：張秀美(1956-)，女，江蘇徐州人，研究員，主要從事禽病綜合防控技術研究，E-mail：zxm820410@163.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)09-1606-07