張 濤，樊慶燦，張向前，張跟喜，王金玉 *，顧玉萍

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009； 3.江蘇京海集團(tuán)，南通 226103)

京海黃雞體組成性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

張 濤1，2，樊慶燦1，2，張向前1，2，張跟喜1，2，王金玉1，2 *，顧玉萍3

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009； 3.江蘇京海集團(tuán)，南通 226103)

為了獲得影響京海黃雞體組成性狀的SNPs標(biāo)記及候選基因，為京海黃雞的進(jìn)一步遺傳改良提供新的方法，本研究使用Illumina公司的雞60K SNP芯片，對(duì)京海黃雞13個(gè)體組成性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。共篩選出13個(gè)與體組成性狀達(dá)到5%Bonferroni全基因組顯著相關(guān)的SNPs(P<1.8E-6)，130個(gè)達(dá)到5%Bonferroni全基因組潛在相關(guān)的SNPs(P<3.59E-5)。13個(gè)顯著SNPs位于GRIK1、NCAPG、KCNIP4和CACNA2D2等12個(gè)基因的附近或內(nèi)部，其中6個(gè)SNPs位于4號(hào)染色體上一個(gè)1.6 Mb區(qū)域(74.3～75.9 Mb)。130個(gè)潛在顯著的SNPs中，有25個(gè)集中分布在4號(hào)染色體上的一個(gè)7.4 Mb(71.5～78.9 Mb)的區(qū)域內(nèi)。共構(gòu)建了5 650種單倍型，其中，14個(gè)與京海黃雞6個(gè)體組成性狀顯著相關(guān)，14個(gè)單倍型中，9個(gè)位于4號(hào)染色體74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域內(nèi)包括LCORL、QDPR、KCNIP4、LDB2和FAM184B在內(nèi)的多個(gè)功能基因。本研究結(jié)果表明，位于4號(hào)染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域以及該區(qū)域附近的GRIK1、NCAPG、KCNIP4、CACNA2D2、LCORL、QDPR、KCNIP4、LDB2和FAM184B基因?qū)┖｜S雞的體組成有重要影響。

京海黃雞；全基因組關(guān)聯(lián)分析；體組成；單倍型

體組成性狀是雞的重要經(jīng)濟(jì)性狀，直接影響雞的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。通過(guò)傳統(tǒng)育種對(duì)體組成進(jìn)行的遺傳改良取得了良好效果，然而，雞體組成性狀為復(fù)雜數(shù)量性狀，傳統(tǒng)育種方法已很難使體組成性狀取得較大的遺傳進(jìn)展。近些年來(lái)，隨著分子標(biāo)記輔助育種的快速發(fā)展，其已成為改良遺傳性狀的新方法，體組成和肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記方面的研究已經(jīng)取得令人矚目的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了許多影響雞體組成和肉質(zhì)性狀的候選基因和QTLs[1-5]。

以往主要采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法來(lái)鑒定與雞不同性狀相關(guān)的SNPs，但這兩種方法存在明顯的局限性，尤其是對(duì)于復(fù)雜數(shù)量性狀而言。目前，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)在篩選人類和動(dòng)物復(fù)雜性狀相關(guān)候選基因的方面得到了廣泛的應(yīng)用[6-13]。X.Gu等[6]使用Illumina公司雞的60K SNP芯片對(duì)隱性白羽肉雞和絲羽烏骨雞F2雜交群體的體重性狀和日增重性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)4號(hào)染色體上71.6～80.2 Mb是影響雞生長(zhǎng)性狀SNPs的集中分布區(qū)域。L.Xie 等[7]使用雞Illumina 60 K SNP芯片，對(duì)白洛克和杏花雞的F2代雜交群體的體重性狀和日增重進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)雞1號(hào)染色體的173.5～175.0 Mb是與雞的體重和日增重性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs集中區(qū)域，該區(qū)域存在極為明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象。W.Liu等[8]利用Illumina 60 K SNP芯片，以矮小型褐殼蛋雞和白來(lái)杭為試驗(yàn)動(dòng)物，研究雞的繁殖性狀和蛋品質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)與雞的繁殖性狀和蛋品種性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs(P<0.05)和部分潛在顯著的SNPs。除了以上研究找到的與生長(zhǎng)繁殖等性狀相關(guān)的SNPs外，雞無(wú)尾、體組成及肉品質(zhì)、抗馬立克及新城疫等性狀相關(guān)的一些位點(diǎn)也通過(guò)GWAS被找到[9-13]。

京海黃雞是本課題組在長(zhǎng)期開(kāi)展我國(guó)地方雞種質(zhì)資源調(diào)查、評(píng)價(jià)與保護(hù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年連續(xù)攻關(guān)成功培育而成的我國(guó)目前唯一通過(guò)國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定的具有小型、優(yōu)質(zhì)、早熟和抗逆四大特點(diǎn)的新雞種，京海黃雞的育成，即采用了常規(guī)育種方法，又采用了分子輔助選擇方法，是雞育種中理論與實(shí)踐相結(jié)合的一個(gè)范例。在本研究中，為了找到與京海黃雞體組成性狀顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)及影響體組成性狀的候選基因，使用Illumina 公司的60K SNP 芯片對(duì)體組成性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。旨在發(fā)現(xiàn)與雞體組成性狀相關(guān)的候選基因和區(qū)域，為京海黃雞標(biāo)記輔助選擇工作的開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體及表型檢測(cè)

試驗(yàn)群體為212只來(lái)自同一批次19個(gè)半同胞家系的京海黃雞，同一天孵化，籠養(yǎng)，自由采食和飲水，飼料符合[NRC]國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，所有雞均健康。66周齡采集血液，并屠宰分割稱重，記錄其活重(BW)、屠體重(CW)、腳重(FW)、翅重(WW)、胸肌重(BMW)、腿肌重(LMW)、腹脂重(AW)、全凈膛重(EW)和半凈膛重(SEW)，同時(shí)計(jì)算胸肌率(BMP)、腿肌率(LMP)、腹脂率(AWP)和全凈膛率(EWP)。采用SPSS19.0軟件對(duì)體組成性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1)，數(shù)據(jù)使用Minitap(v16)軟件中的Johnson法轉(zhuǎn)換以符合正態(tài)分布。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因分型 使用上海生工生物工程(上海)股份有限公司的Dzup Genomic DNA Isolation Reagent(Blood) kit 提取基因組DNA，提取后經(jīng)分光光度法檢測(cè)濃度和質(zhì)量，于-20 ℃保存，然后送至加拿大DNA LandMarks 股份有限公司使用60K SNP 芯片進(jìn)行基因分型，具體步驟：將雞DNA 濃度統(tǒng)一稀釋為 50 ng·μL-1。保證基因組DNA在250 ng以上；加入 0.1 mol·L-1NaOH 使 DNA雙鏈變?yōu)閱捂?，加入中和劑中和，再加入全基因組擴(kuò)增試劑， 37 ℃恒溫過(guò)夜孵育；對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)程利用終點(diǎn)式(End-point)片段化方法片段化；加入異丙醇使DNA 片段沉淀，4 ℃離心；將雜交緩沖液加入沉淀后的DNA中，使DNA完全溶解在雜交緩沖液中；將雜交緩沖液中的 DNA 與雞60 K SNP芯片在雜交爐中雜交過(guò)夜；沖洗芯片以除去多余的DNA。以檢測(cè)到的片段為模板，進(jìn)行處理過(guò)的單堿基延伸反應(yīng)，加入標(biāo)簽基團(tuán)，以區(qū)分檢測(cè)到的SNP 類型；使用XC4 試劑對(duì)反應(yīng)后的芯片進(jìn)行包被，真空條件下干燥1 h。iScan 芯片掃描儀掃描芯片的標(biāo)簽基因，使用 GenomeStudio 軟件分析掃描后的圖片，獲得分型結(jié)果。

表1 體組成性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

Table 1 Descriptive statistics of body composition traits

性狀Trait最大值Max最小值Min平均值A(chǔ)verage標(biāo)準(zhǔn)差Standarddeviation最佳擬合Best?fit正態(tài)分布NormaldistributionBW66/g292512902062．9306．1-是CW/g275512101852．3285．3-是FW/g702546．38．81．25近似WW/g953562．711．80．94是BMW/g15550103．820．50．61是BMP/%21．310．216．41．90．83是LMW/g21070138．525．1-是LMP/%27．312．621．92．30．63是AW/g245597．4530．25是AWP/%15．60．57．33．2-是EW/g19507251270210-是EWP/%89．447．661．64．5-是SEW/g21901441430．9245．50．8是

1.2.2 質(zhì)量控制 使用Plink(v1.07)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制[14]，剔除最小檢出率低于90%的個(gè)體以及最小檢出頻率低于95%、最小哈代溫伯格平衡小于1.0E-6和最小等位基因頻率小于3%的SNPs。1.2.3 群體結(jié)構(gòu) 試驗(yàn)樣本的群體結(jié)構(gòu)使用Plink軟件中的多維尺度分析法(Multidimensional scaling analysis，MDS)進(jìn)行計(jì)算，具體方法是以常染色體上25個(gè)SNPs為一個(gè)SNP窗，計(jì)算內(nèi)部成對(duì)SNPs的r2值，高于0.2則剔除一個(gè)標(biāo)記，并每5個(gè)單位進(jìn)行步移檢測(cè)，最后得到12 877個(gè)獨(dú)立的SNPs標(biāo)記，利用找到的標(biāo)記，在Plink中計(jì)算所有個(gè)體間成對(duì)的IBS(Identity-by-state distances)距離，再以IBS矩陣進(jìn)行MDS分析，以第一和第二主成分作MDS圖。MDS圖使用R(2.15.1)軟件繪制[15]，使用GCTA軟件進(jìn)行主成分分析法(PCA)，主成分PCA1和PCA2作為協(xié)變量代入模型中以減小群體分層效應(yīng)[15-17]。采用Plink軟件基于46 665個(gè)SNPs進(jìn)行單倍型分析，具體方法為計(jì)算同一染色體上200 kb內(nèi)的堿基對(duì)間的R2值，若大于0.8則認(rèn)為兩個(gè)SNPs為連鎖。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究使用一般線性回歸模型(GLM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型：

Y為觀察值向量，G為遺傳效應(yīng)向量，X為包括第一、第二主成分(PCA1和PCA2)在內(nèi)的固定效應(yīng)矩陣，α和β為關(guān)聯(lián)矩陣，e為隨機(jī)殘差向量。此外，采用GLM對(duì)單倍型和體組成性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。運(yùn)用連鎖不平衡修正的Bonferroni校正，對(duì)P值進(jìn)行校正，此處獨(dú)立標(biāo)記計(jì)算r2值設(shè)為0.4[18]，得到27 824個(gè)獨(dú)立SNPs標(biāo)記，因此Bonferroni校正后全基因組顯著P值為1.80E-6(0.05/27 824)，全基因組潛在顯著P值為3.59E-5(1/27 824)。使用R(2.15.1)軟件作QQ和曼哈頓圖。

2 結(jié) 果

2.1 群體結(jié)構(gòu)分析

圖1 多維等級(jí)分析顯示的群體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Population structure identified by multidimensional scaling analysis

群體結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示(圖1)，京海黃雞19個(gè)半同胞家系的分布有一定的分層現(xiàn)象，分層現(xiàn)象是影響全基因組關(guān)聯(lián)分析準(zhǔn)確性的重要因素，若不考慮群體結(jié)構(gòu)因素的影響，那么分層效應(yīng)會(huì)被誤認(rèn)為是基因效應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此后續(xù)分析中必須使用某種方法來(lái)降低群體分層對(duì)分析結(jié)果的影響。本研究采用主成分分析法來(lái)校正群體分層，將主成分分析中的第一、第二主成分代入模型中來(lái)降低群體分層效應(yīng)。

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)質(zhì)控后，最終200個(gè)樣本和46 665個(gè)SNPs可用于全基因組關(guān)聯(lián)分析，質(zhì)量控制后的SNPs分布見(jiàn)表2。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，本研究共篩選出13個(gè)與體重、腳重、翅重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、腹脂率、全凈膛重和半凈膛重達(dá)到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)(P<1.80E-6)的SNPs位點(diǎn)(表3)。其中6個(gè)SNPs位點(diǎn)位于4號(hào)染色體上74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，影響活體重、腳重、翅重、胸肌重、全凈膛重和半凈膛重6個(gè)體組成性狀。另外一個(gè)位于4號(hào)染色體34.5 Mb處，顯著影響腳重。另外3個(gè)影響腳重和翅重的SNPs 分別位于5號(hào)和7號(hào)染色體上。與胸肌重、腹脂重、腹脂率關(guān)聯(lián)的6個(gè)SNPs分別位于1、2、12和15號(hào)染色體上。未篩選出與屠體重、胸肌率、腿肌率和全凈膛率關(guān)聯(lián)顯著的位點(diǎn)，此外，還篩選出130個(gè)達(dá)到全基因組潛在顯著的SNPs，其中，大部分位點(diǎn)主要位于2、4和13號(hào)染色體上，有25個(gè)位點(diǎn)集中分布在4號(hào)染色體71.5～78.9 Mb區(qū)域內(nèi)。有顯著相關(guān)位點(diǎn)的性狀的曼哈頓圖和QQ圖見(jiàn)圖2和圖3。

2.3 與多個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)

本研究篩選出的13個(gè)顯著位點(diǎn)中，5個(gè)SNPs與多個(gè)性狀顯著相關(guān)，位于4號(hào)染色體75.5 Mb附近的rs14710787和rs16023603與7個(gè)體組成性狀顯著相關(guān)；而位于4號(hào)染色體75.3 Mb附近的rs14490981與活體重、腳重、全凈膛重和半凈膛重4個(gè)性狀顯著相關(guān)；此外，位于1號(hào)染色體上的rs15368284與胸肌重、腿肌重、全凈膛重和半凈膛重4個(gè)性狀顯著相關(guān)，位于2號(hào)染色體上的rs14210468與活體重、屠體重、全凈膛重和半凈膛重顯著相關(guān)。

2.4 單倍型關(guān)聯(lián)分析

本研究對(duì)5 650個(gè)單倍型和13個(gè)體組成性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了14個(gè)與活體重(1)、腳重(6)、翅重(2)、腹脂重(2)、腹脂率(2)和半凈膛重(1)達(dá)到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)的單倍型(表5)。14個(gè)單倍型中，有9個(gè)單倍型分布于4號(hào)染色體74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，影響活體重、腳重、翅重和半凈膛重。其他單倍型分布于13、15、21和Z染色體上，14個(gè)單倍型中，有7個(gè)單倍型是由基因組水平關(guān)聯(lián)顯著的SNPs組成。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)與體組成性狀潛在關(guān)聯(lián)的單倍型58個(gè)(未列出)。

3 討 論

全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)是以遍布于整個(gè)基因組的單核苷酸多態(tài)性為分子標(biāo)記，以發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀發(fā)生的遺傳標(biāo)記和遺傳標(biāo)記的分布特征為目的，對(duì)復(fù)雜經(jīng)濟(jì)性狀直接進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。全基因組關(guān)聯(lián)分析被認(rèn)為是一種確定影響重要經(jīng)濟(jì)性狀或?qū)е氯祟惸承┻z傳疾病分子標(biāo)記的有效方法。為了尋找影響京海黃雞體組成性狀的SNP位點(diǎn)，本研究采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法篩選與京海黃雞體組成性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記，結(jié)果共篩選出13個(gè)與活體重、腳重、翅重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、腹脂率、全凈膛重和半凈膛重達(dá)到全基因組水平顯著關(guān)聯(lián)(P<1.80E-6)的SNPs位點(diǎn)。其中，5個(gè)SNPs與多個(gè)性狀顯著相關(guān)，位于4號(hào)染色體75.5 Mb附近的rs14710787和rs16023603與7個(gè)體組成性狀顯著相關(guān)，兩個(gè)SNPs均位于NCAPG基因內(nèi)部。而位于4號(hào)染色體75.3 Mb附近的rs14490981與活體重、腳重、全凈膛重和半凈膛重4個(gè)性狀顯著相關(guān)。此外，位于1號(hào)染色體上的rs15368284與胸肌重、腿肌重、全凈膛重和半凈膛重4個(gè)性狀顯著相關(guān)，位于2號(hào)染色體上的rs14210468與活體重、屠體重、全凈膛重和半凈膛重顯著相關(guān)。這些影響多個(gè)屠宰性狀的SNPs也具有更高的研究?jī)r(jià)值，其所在基因可能為重要候選基因。

表2 質(zhì)控后SNPs信息統(tǒng)計(jì)

Table 2 Basic statistics of SNPs after quality control

染色體Chromosome物理圖譜/MbPhysicalmapSNPs數(shù)/個(gè)No．ofSNPsSNP密度/(kb·SNP-1)SNPdensity1200．95724427．742154．79546628．323113．62416527．28494．20339627．74562．23219228．39635．84172920．73738．30182920．94830．56135022．64924．02118720．241022．42130217．221121．87124117．621220．46140314．581318．27118615．411415．76101815．521512．93102912．56160．421137．991710．6184612．551810．8585712．66199．9083011．932013．9214849．38216．867668．95223．9030012．99236．0260110．02246．387438．58252．0216812．00265．076407．82274．8347910．07284．475607．99LGE22C19W28＿E50C230．881098．10LGE640．0236．00z74．58194238．40005890Total1026．954666522．04

表3 京海黃雞體組成性狀的顯著SNPs位點(diǎn)

Table 3 Significant SNPs for body composition traits in Jinghai Yellow chicken

性狀TraitSNP染色體Chromosome位置/bpPosition等位基因Allele最小基因頻率MAFP值Pvalue最近基因NearestgenesBWrs16023603475511560AC0．37503．19E?08NCAPGrs14710787475506561GA0．35486．24E?08NCAPGFWrs16023603475511560AC0．37506．28E?10NCAPGrs14710787475506561GA0．35486．05E?09NCAPGrs15540258434549951CT0．22476．53E?08FAM13Ars14490981475328284AG0．29671．27E?07LCORLrs14623099728298959CT0．34472．16E?07INSIG2rs14491150475878632CT0．20635．37E?07LDB2GGaluGA265809474348560TC0．43296．18E?07KCNIP4GGaluGA2714895188004AG0．20711．22E?06未知WWrs16023603475511560AC0．37506．22E?08NCAPGrs14710787475506561GA0．35481．20E?07NCAPGrs13755802524218477AG0．23369．27E?07TYRO3BMWrs153682841103569548TC0．29871．04E?06GRIK1LMWrs16023603475511560AC0．37507．33E?07NCAPGrs14710787475506561GA0．35481．33E?06NCAPGAWrs15630799121468774CT0．43063．81E?07CACNA2D2rs14162502234138769TC0．065823．98E?07CHN2AWPrs15630799121468774CT0．43063．42E?08CACNA2D2rs14162502234138769TC0．065821．19E?06CHN2rs14089935154913876AG0．31141．27E?06ATP6V0A2EWrs14710787475506561GA0．35483．15E?07NCAPGrs16023603475511560AC0．37504．43E?07NCAPGSEWrs14710787475506561GA0．35481．92E?07NCAPGrs16023603475511560AC0．37502．35E?07NCAPG

本研究篩選出與體組成性狀關(guān)聯(lián)顯著的13個(gè)位點(diǎn)主要位于4號(hào)染色體上74.3～75.5 Mb區(qū)域內(nèi)，130個(gè)潛在顯著地位點(diǎn)中有25個(gè)集中位于4號(hào)染色體71.4～78.9 Mb區(qū)域，這表明4號(hào)染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域?qū)┖｜S雞體組成具有重要的調(diào)控作用，這與之前報(bào)道的生長(zhǎng)和屠宰性狀的GWAS結(jié)果是一致的。X.Gu等[6]對(duì)烏骨雞-白洛克雞組建的F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)4號(hào)染色體 71.6～80.2 Mb區(qū)域與7～14周齡體重和日增重顯著相關(guān)。L.Xie等[7]對(duì)F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些與生長(zhǎng)性狀潛在顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，而R.Liu等[11]對(duì)北京油雞的屠宰性狀進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)78.4～79.5 Mb區(qū)域與屠體重和全凈膛重關(guān)聯(lián)顯著。這也說(shuō)明該區(qū)域?qū)﹄u生長(zhǎng)和屠宰都具有重要的調(diào)節(jié)作用。

X軸1～28表示1～28號(hào)染色體，29、30和31分別代表LGE22、LGE64染色體片段和Z染色體；圖中上線代表潛在顯著的閾值(3.59E-5)，下線代表全基因組顯著的閾值(1.80E-06)1-28 on the x-axis indicate chromosomes 1-28，and 29，30 and 31 indicate LGE22，LGE64 and chromosome Z，respectively.The upper line in each figure shows the potential significant threshold：-log10(3.59E-5)，and the lower one shows the genome-wide significant threshold：-log10(1.80E-06)圖2 體組成性狀全基因組顯著位點(diǎn)的曼哈頓圖Fig.2 Manhttan plots for the body composition triats with genome-wide significant SNPs

和半凈膛重顯著相關(guān)。這些影響多個(gè)屠宰性狀的SNPs也具有更高的研究?jī)r(jià)值，其所在基因可能為重要候選基因。

本研究篩選出與體組成性狀關(guān)聯(lián)顯著的13個(gè)位點(diǎn)主要位于4號(hào)染色體上74.3～75.5 Mb區(qū)域內(nèi)，130個(gè)潛在顯著地位點(diǎn)中有25個(gè)集中位于4號(hào)染色體71.4～78.9 Mb區(qū)域，這表明4號(hào)染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域?qū)┖｜S雞體組成具有重要的調(diào)控作用，這與之前報(bào)道的生長(zhǎng)和屠宰性狀的GWAS的結(jié)果是一致的。X.Gu等[6]對(duì)烏骨雞-白洛克雞組建的F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)4號(hào)染色體 71.6～80.2 Mb區(qū)域與7～14周齡體重和日增重顯著相關(guān)。L.Xie等[7]對(duì)F2代資源群進(jìn)行GWAS分析，在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些與生長(zhǎng)性狀潛在顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，而R.Liu[11]對(duì)北京油雞的屠宰性狀進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)78.4～79.5 Mb區(qū)域與屠體重和全凈膛重關(guān)聯(lián)顯著。這也說(shuō)明該區(qū)域?qū)﹄u生長(zhǎng)和屠宰都具有重要的調(diào)節(jié)作用。

從NCBI和Ensembl獲取每個(gè)顯著SNP周圍1 Mb區(qū)域內(nèi)的最近基因作為影響體組成性狀的可能候選基因。最終，共找到13個(gè)可能的候選功能基因，這些基因中，NCAPG基因?qū)钪?、腳重、翅重、腿肌重、全凈膛重和半凈膛重6個(gè)性狀有顯著影響，說(shuō)明NCAPG基因可能為影響京海黃雞體組成的重要候選基因。同時(shí)，GRIK1基因內(nèi)的SNP對(duì)胸肌重有顯著影響，CACNA2D2基因內(nèi)的SNP對(duì)腹脂重和腹脂率有顯著影響。以上結(jié)果表明，NCAPG、GRIK1和CACNA2D2基因可能為影響京海黃雞體組成的重要候選基因。

NCAPG基因是編碼凝縮蛋白復(fù)合體的一個(gè)亞基，該復(fù)合體在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中，調(diào)節(jié)染色體的穩(wěn)定和壓縮。有報(bào)道顯示，牛的NCAPG基因是影響牛體型和屠宰性狀的一個(gè)新的候選基因，該基因內(nèi)部的SNPs能夠影響不同品種牛不同時(shí)期的體重、體型以及屠宰性狀[19-24]，目前該基因的研究在雞上尚未見(jiàn)報(bào)道。GRIK1同時(shí)被稱為GluR5，是哺乳動(dòng)物主要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，參與多種日常神經(jīng)的生理過(guò)程。GluR5和家族成員GluR6、GluR7的蛋白形成同聚體時(shí)可形成功能性的離子通道[25]，該基因被認(rèn)為是抗癲癇的重要候選基因[26-28]。CACNA2D2基因表達(dá)的蛋白屬于L型鈣離子通道復(fù)合體蛋白。L型鈣離子通道復(fù)合體由α1、α2δ、β和γ亞基以1∶1∶1∶1比例組成。該復(fù)合體通過(guò)調(diào)節(jié)Ca離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而進(jìn)行細(xì)胞調(diào)節(jié)[29-30]。CACNA2D2編碼α2δ亞基，是α2δ蛋白的一個(gè)亞型，該基因被認(rèn)為是多種腫瘤的抑制基因，此外，一些研究人員發(fā)現(xiàn)，另外一個(gè)亞型編碼基因CACNA2D1是牛屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀的重要候選基因[31-33]。

圖3 京海黃雞體組成性狀的QQ圖Fig.3 QQ-plot of body composition traits of Jinghai Yellow chicken

表4 與超過(guò)兩個(gè)體組成性狀相關(guān)的SNPs

Table 4 SNPs associated with more than 2 body composition traits

名稱SNPID染色體Chromosome位置/bpPosition最近基因Nearestgenes性狀TraitP值Pvaluers153682841107693816GRIK1BMW1．04E?06LMW2．29E?06SEW3．71E?06EW5．12E?06rs14210468283654288LOC101750191CW2．20E?06EW9．81E?06SEW1．10E?05BW663．40E?05rs14490981478563545LOC101750905FW1．27E?07SEW9．59E?06EW2．05E?05BW662．07E?05rs14710787478797460FAM184BFW6．05E?09BW666．24E?08WW1．20E?07SEW1．92E?07EW3．15E?07LMW1．33E?06CW3．34E?05rs16023603478802461FAM184BFW6．28E?10BW663．19E?08WW6．22E?08SEW2．35E?07EW4．43E?07LMW7．33E?07CW1．74E?05BMW2．26E?05

本研究中，單倍型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了14個(gè)與6個(gè)屠宰性狀關(guān)聯(lián)顯著的單倍型，這些顯著的單倍型中，有7個(gè)單倍型由顯著的SNPs構(gòu)建而成。其他6個(gè)關(guān)聯(lián)顯著的單倍型并不含有顯著SNPs，這一方面證明了關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，另一方面還說(shuō)明，單倍型分析綜合考慮多個(gè)等位基因，能夠發(fā)現(xiàn)SNP關(guān)聯(lián)分析所不能發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)的14個(gè)單倍型中，有9個(gè)單倍型位于4號(hào)染色體74.3～75.9 Mb區(qū)域內(nèi)，影響活體重、腳重、翅重和半凈膛重。說(shuō)明4號(hào)染色體74.3～75.9 Mb是影響京海黃雞體組成性狀的一個(gè)重要區(qū)域。該區(qū)域內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)與體組成性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs，這進(jìn)一步說(shuō)明了該區(qū)域?qū)﹄u體組成性狀的重要性。這一區(qū)域單倍型涉及到的基因有LDB2、LCORL、QDPR、KCNIP4和FAM184B。LDB2基因通過(guò)與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與血管形成和腦的發(fā)育過(guò)程[34-35]。X.Gu等[6，36]對(duì)雞生長(zhǎng)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究均報(bào)道了該基因。LCORL基因能夠影響精子發(fā)生，該基因內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)與成年人骨骼尺寸及身高關(guān)聯(lián)顯著[37]。吳丹[36]對(duì)雞生長(zhǎng)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析中報(bào)道了該基因。QDPR基因編碼二氫喋啶還原酶，該基因功能的報(bào)道較少。KCNIP4編碼蛋白是一種K離子通道互作蛋白，K離子通道具有廣泛的生理調(diào)節(jié)作用，包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放、平滑肌收縮、心率調(diào)節(jié)和胰島素分泌等[38-39]。FAM184B的研究較少，有研究表明，該基因與牛的采食、日增重和屠體重顯著相關(guān)[40]。

表5 與京海黃雞體組成性狀顯著相關(guān)的單倍型

Table 5 Significant haplotypes associated with body composition traits in Jinghai Yellow chicken

性狀Trait染色體ChromosomeSNPⅠ位置Ⅰ/bpPositionⅠSNPⅡ位置Ⅱ/bpPositionⅡBW664GGaluGA26596975407174rs1602360375511560FW4rs1449115075878632rs13663919758885934GGaluGA00155875575851GGaluGA001559755758554GGaluGA00155875575851GGaluGA001559755758554GGaluGA26580674347058GGaluGA265809743485604GGaluGA26595775317389rs14490981753282844GGaluGA26596975407174rs1602360375511560WW4GGaluGA26596975407174rs160236037551156013rs1406017011175823rs1569980511184629AW21rs161793112725645rs142833102726966Zrs1373401723821902rs1610496124024728AWP15rs150200284911528rs140899354913876Zrs1373401723821902rs1610496124024728SEW4GGaluGA26596975407174rs1602360375511560性狀Trait染色體Chromosome單倍型Haplotype頻率FrequencyP值PvalueBW664CATTGA0．3462．10E?07FW4CC0．2061．53E?074AG0．3331．10E?074GA0．6671．10E?074CT0．4333．36E?074AA0．292．03E?084CATTGA0．3462．34E?09WW4CATTGA0．3462．63E?0713CC0．5582．55E?07AW21CA0．5211．69E?06ZGATACATC0．3661．59E?07AWP15CA0．3111．64E?06ZGATACATC0．3662．97E?08SEW4CATTGA0．3461．18E?06

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)京海黃雞體組成性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，共篩選出13個(gè)與體組成性狀達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)的SNPs，130個(gè)達(dá)到全基因組潛在顯著地SNPs。位于4號(hào)染色體的71.5～78.9 Mb區(qū)域內(nèi)有多個(gè)SNPs與多個(gè)屠宰性狀關(guān)聯(lián)顯著，表明該區(qū)域可能為影響京海黃雞體組成的重要候選區(qū)域，同時(shí)，在顯著SNPs附近篩選出12個(gè)可能的候選基因。

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(編輯 郭云雁)

A Genome-wide Association Study on Body Composition of Jinghai Yellow Chicken

ZHANG Tao1，2，F(xiàn)AN Qing-can1，2，ZHANG Xiang-qian1，2，ZHANG Gen-xi1，2， WANG Jin-yu1，2*，GU Yu-ping3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，Yangzhou225009，China；3.JiangsuJinghaiPoultryGroupCo.，Ltd.，Nantong226103，China)

To scan SNPs and candidate genes affecting body composition traits and provide new methods for further genetic improvement of Jinghai Yellow chicken，a genome-wide association study on 13 body composition traits was carried out using the Illumina chicken 60K SNP Beadchip in Jinghai Yellow chicken in the present study.The result showed that a total of 13 SNPs reached 5% Bonferroni genome-wide significant level(P<1.8E-6) and 130 SNPs reached “suggestive” genome-wide significant level(P<3.59E-5) with body composition traits.The 13 significant SNPs were located nearby or in 12 candidate genes includingGRIK1，NCAPG，KCNIP4，CACNA2D2，and so on，among which 6 SNPs were located in a region approximately 1.6 Mb in length on chicken chromosome 4(74.3-75.9 Mb).Among the 130 “suggestive” significant SNPs，25 SNPs were located in a region 7.4 Mb(71.5-78.9 Mb) in length on chicken chromosome 4.5 650 haplotpyes were established and 14 of them were found to be associated with 6 body composition traits.Nine out of 14 haplotypes were located in the region of 74.3-75.9 Mb on chicken chromosome 4.Five candidate genes ofLCORL，QDPR，KCNIP4，LDB2 andFAM184Bwere located in this region.The present study suggested that genes located in the region of 71.5-78.9 Mb on chicken chromosome 4 andGRIK1，NCAPG，KCNIP4，CACNA2D2，LCORL，QDPR，KCNIP4，LDB2，F(xiàn)AM184Bgenes might play important role in regulation of body composition of Jinghai Yellow chicken.

Jinghai Yellow chicken；GWAS；body composition；haplotype

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.004

2014-10-13

國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-42-G1-05)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程；江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

張 濤(1990-)，男，山東臨沂人，博士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：zt991279320@126.com

*通信作者：王金玉，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：jywang@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)09-1502-13