郭云濤，張秀秀，苗向陽

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛miR-320a的靶基因預測及生物信息學分析

郭云濤，張秀秀，苗向陽*

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

旨在對bta-miR-320a的靶基因進行生物信息學預測和分析，探索其影響牛脂肪沉積的作用機制。本試驗利用Promoter Scan、TargetScan、DAVID、Cytoscape等生物信息學軟件和miRBase、Ensembl、NCBI、miRWalk等數(shù)據(jù)庫對bta-miR-320a進行轉錄因子結合位點預測、保守性分析、靶基因預測、基因本體論富集分析和信號通路富集分析。結果表明，miR-320(a)在各物種間非常保守，bta-miR-320a啟動子區(qū)域有SP1等多個轉錄因子結合位點，獲得的84個靶基因主要參與負調(diào)控細胞分化、細胞周期、負調(diào)控生長等多個生物學過程，涉及p53、細胞周期和MAPK等信號轉導通路。由此推測，bta-miR-320a受到SP1等多種轉錄因子調(diào)控，它可能通過對MAPK、細胞周期和p53信號通路中靶基因TP53、MAPK1等的抑制作用調(diào)控牛脂肪細胞分化，進而影響了牛的脂肪沉積。

牛；bta-miR-320a；靶基因；生物信息學

microRNA(miRNA，微RNA)是真核生物中廣泛存在的一類內(nèi)源性非編碼RNA，長約21～22 nt，它可以通過特異性堿基互補的方式與靶基因mRNA的3′-UTR結合，抑制靶mRNA翻譯或誘導其降解，從而在轉錄后水平調(diào)控基因的表達[1-3]。自從第一個miRNAlin-4在線蟲中被發(fā)現(xiàn)以來[4]，越來越多的miRNA被鑒定出來，目前最權威的miRbase(http：//www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫收錄的miRNA條目已達28 645條，并且數(shù)目在逐年增長，庫中收錄了牛的808條miRNAs前體，793條成熟體。作為近年來研究的熱門，miRNA參與了各種生命過程的調(diào)控，包括細胞的增殖、分化、凋亡和新陳代謝等，在生物體生長、發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中扮演著重要角色[5]。在肉牛生產(chǎn)中，胴體中的皮下和肌內(nèi)脂肪含量是肉品質(zhì)的一個重要指標，肌內(nèi)脂肪不足和皮下脂肪過多是對牛肉品質(zhì)的最大挑戰(zhàn)，研究肉牛脂肪沉積過程的分子機制對于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉至關重要。脂肪沉積伴隨著脂肪細胞體積增大和數(shù)目增加，脂肪細胞數(shù)目增加與脂肪細胞分化密切相關。已有研究證實，miRNA參與了脂肪細胞分化調(diào)控[6]，故研究脂肪細胞分化中的miRNA對于肉牛脂肪沉積研究有重要的理論和實際意義。

miR-320a屬于miR-320家族，家族內(nèi)有許多成員，如人的miR-320有5個高度同源的種類：hsa-miR-320a/b/c/d/e，牛的miR-320(Bta-miR-320)有兩種高度同源的類型：bta-miR-320a(MIMAT0003534)和bta-miR-320b(MIMAT0011991)。目前，關于miR-320家族的研究多集中在癌癥方面，miR-320可以抑制癌細胞增殖，在結腸直腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌骨肉瘤等多種惡性腫瘤侵襲和遷移中，miR-320都出現(xiàn)了下調(diào)表達。H.Y.Ling等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-320在3T3-L1脂肪細胞中通過調(diào)控胰島素-PI3-K信號通路調(diào)控了胰島素抵抗，miR-320可能參與了脂肪組織中的生物過程調(diào)控。D.Hamam等[8]在研究人骨骼肌多功能干細胞(Human mesenchymal stem cells，hMSCs)向脂肪細胞分化時發(fā)現(xiàn)，miR-320家族發(fā)生了顯著上調(diào)，進一步試驗證實hsa-miR-320c通過靶向抑制RUNT相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)影響了脂肪細胞分化。本實驗室前期對不同脂肪沉積能力的兩個品種牛的皮下脂肪組織小RNA進行了高通量測序，在分析結果時發(fā)現(xiàn)，bta-miR-320a在脂肪沉積能力強的牛種中發(fā)生了顯著的下調(diào)表達(|log2FC|>1，P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)，且在兩個牛種中表達豐度都非常高(RPKM>500)，推測bta-miR-320a可能在脂肪沉積中發(fā)揮了重要作用。目前，最權威的miRBase數(shù)據(jù)庫中對bta-miR-320a的功能沒有注釋，miR-320a對牛脂肪細胞分化的影響機制尚不清楚，因此，本試驗旨在利用生物信息學的方法對bta-miR-320a進行轉錄因子結合位點(Transcription factor binding site，TFBS)預測、同源性和進化分析、靶基因預測、靶基因的基因本體論(Gene ontology，GO)和KEGG信號通路(KEGG Pathway)富集分析，以了解bta-miR-320a可能的轉錄因子調(diào)控位點、進化關系及其參與調(diào)控的生物過程和信號通路，進而對其在牛脂肪細胞分化中的功能進行探索，為bta-miR-320a在牛脂肪沉積中的研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 轉錄因子結合位點(TFBS)預測

在Ensemble數(shù)據(jù)庫中檢索出bta-miR-320a的兩條前體，取其上游10 kb的序列，利用Promoter Scan Version 1.7(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)、JASPAR CORE Vertebrate(http：//jaspardev.genereg.net/)和PATCH public 1.0(http：//www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)3個在線預測軟件做TFBS預測。

1.2 miR-320(a)序列保守性分析

從miRBase中檢索出牛(Bostaurus，bta)、大猩猩(Gorillagorilla，ggo)、人(Homosapiens，hsa)、獼猴(Macacamulatta，mml)、黑猩猩(Pantroglodytes，ptr)、婆羅州猩猩(Pongopygmaeus，ppy)、灰倉鼠(Cricetulusgriseus，cgr)、大鼠(Rattusnorvegicus，rno)、小鼠(Musmusculus，mmu)、山羊(Caprahircus，chi)、狗(Canisfamiliaris，cfa)的miR-320(a)序列，分析其保守性。

1.3 Bta-miR-320a的靶基因預測和后續(xù)分析靶基因的獲得

選擇TargetScan 6.2(http：//www.targetscan.org/vert_61/)、PicTar(http：//pictar.mdc-berlin.de/)和miRanda(閾值mirSVR score<-1，http：//www.microrna.org/microrna/getDownloads.do)3種計算方法預測bta-miR-320a的靶基因，取3者預測結果的交集，然后結合miRwalk(http：//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/mirnatargetpub.html)上miR-320a的已驗證靶標以及文獻中已報道m(xù)iR-320a靶基因，共同組成bta-miR-320a的靶基因集合。

1.4 靶基因的GO富集分析

將bta-miR-320a的預測靶基因集合用Gene Ontology進行富集分類，選擇所有蛋白編碼基因作為背景基因，用DAVID[9-10]工具(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)對bta-miR-320a預測的靶基因集合進行基于生物學過程(Biological process，BP)、細胞組成(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3個層面的Gene Ontology注釋層次分類及富集分析，通過Fsiher Exact Test計算P值，以P<0.05為顯著性閾值得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計意義的GO條目，并對P值進行校正，標準是Benjamini<0.05。

1.5 靶基因的KEGG Pathway富集分析

用DAVID工具對bta-miR-320a預測的靶基因集合進行基于KEGG的生物通路富集分析，通過Fsiher Exact Test計算P值，以P<0.05為顯著性閾值得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計意義的信號轉導通路，并對P進行校正，標準是Benjamini<0.05。

1.6 TF-miRNA-靶基因作用網(wǎng)絡

根據(jù)轉錄因子、靶基因和通路富集分析結果，使用Cytoscape3.2.0軟件對預測的結果進行作用關系網(wǎng)絡圖繪制。

2 結 果

2.1 TFBS預測結果

使用3種在線軟件分別對兩條bta-miR-320a前體(表1)的上游10 kb區(qū)域TFBS進行預測，發(fā)現(xiàn)它們啟動子區(qū)域有致癌基因JUN(Jun proto-oncogene，JUN或AP-1)、增強子激活結合蛋白2(Activating enhancer binding protein 2 alpha，AP-2)、轉錄因子SP1(Sp1 transcription factor，SP1)、八聚體結合蛋白(Major octamer-binding protein，OCT)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、成肌分化因子1(Myogenic differentiation 1，MYOD1)、cAMP反應元件結合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)等多個轉錄因子結合位點，其中SP1、AP-2、PPARG、MYOD1和CREB參與了脂肪細胞增殖分化和脂代謝調(diào)控。

表1 bta-miR-320a的兩條前體信息

Table 1 Information of 2 bta-miR-320a precursors

名稱NameEnsembl登錄號EnsemblaccessionNo．染色體Chromosome位置/bpLocation長度/bpLengthbta?mir?320a?1ENSBTAG00000029761870060384～7006046582bta?mir?320a?2ENSBTAG000000297602015213924～1521400582

2.2 保守性分析

從牛、大猩猩、人等11個物種的miR-320(a)序列(表2)可以看出，miR-320a在進化中非常保守，成熟體序列完全一致。

表2 不同物種的miR-320a序列

Table 2 Sequences of miR-320a from different species

名稱Name登錄號AccessionNo．序列(5′?3′)Sequencebta?miR?320aMIMAT0003534AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAggo?miR?320aMIMAT0024080AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAhsa?miR?320aMIMAT0000510AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAmml?miR?320aMIMAT0006263AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAptr?miR?320aMIMAT0008093AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAppy?miR?320aMIMAT0015821AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAcgr?miR?320aMIMAT0023906AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGArno?miR?320?3pMIMAT0000903AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAmmu?miR?320?3pMIMAT0000666AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAchi?miR?320?3pMIMAT0036132AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAcfa?miR?320MIMAT0006658AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA

2.3 靶基因預測

選擇TargetScan、PicTar和miRanda 3種計算方法預測bta-miR-320a的靶基因，取3者的交集共得40個基因，合并已經(jīng)證實為miR-320a的 30個來自miRwalk數(shù)據(jù)庫的靶基因和已發(fā)表研究證實的19個靶基因，除去5個重復，獲得共計84個靶基因作為后續(xù)GO和KEGG pathway分析的靶基因集合(圖1，表3)。

2.4 GO富集分析

通過對靶基因集合進行GO富集分析(表4～表6)可知bta-miR-320a的靶基因集富集在負調(diào)控細胞分化、細胞周期、負調(diào)控生長、細胞發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和細胞凋亡等多個生物學過程中，作用的位置主要在細胞核內(nèi)和細胞器內(nèi)腔中，發(fā)揮轉錄調(diào)控活動和酶結合的分子作用。其中生物學過程中的細胞周期、細胞增殖和分化條目下的基因可能會對脂肪細胞的增殖、分化產(chǎn)生影響。

圖1 3種靶基因預測軟件對bta-miR-320a的靶基因預測情況Fig.1 The prediction results of bta-miR-320a target genes using 3 kinds of bioinformatics tools

表3 bta-miR-320a的靶基因統(tǒng)計

Table 3 Statistics of target genes of bta-miR-320a

來源Source數(shù)目Number靶基因列表ListoftargetgenesPicTar(P)345TargetScan(T)669miRanda(M)396Research(R)19miRWalk(W)30P∩T∩M40(P∩T∩M)∪R∪W84ARF1，ARL8B，BANP，C14orf147，CDH20，CDK13，COPS2，DAZAP1，DBN1，DHX15，DNER，ELL2，F(xiàn)AM49B，F(xiàn)LRT3，GABPB1，GPBP1，KCNS3，KLHL36，LMO3，LPPR1，MLLT3，MN1，MSI2，PBX3，PCDHA1，PCDHA4，PLXNC1，PPP2R2C，RAI2，RAP1A，RASA1，SLITRK3，SPOPL，STAG2，TMEM108，TPM3，XPO1，YWHAZ，ZIC3，ZNF281，IL1A，BBC3，BRCA1，TAC1，MCL1，COX8A，TFRC，TP53，AQP1，TP73，AQP4，EZH2，ITCH，ETV6，EIF2C1，RCOR1，DICER1，LIN9，BCL2，BIRC5，POLR3D，REST，RUNX1，HSPB6，E2F1，HNF4A，PIK3R1，GNAI1，TFRC，RAC1，MAPK1，ITGB3，HSP20，F(xiàn)AS，ARPP19，RUNX2，NRP1，ETS2，CDKN1C，CDKN1A，MIB1，PAX6，YWHAH，ZWILCH，HSC70

P∩T∩M表示3種不同靶基因預測軟件PicTar、TargetScan和miRanda預測結果的交集，(P∩T∩M)∪R∪W表示將3個預測軟件獲得的交集與已發(fā)表文獻和miRWalk已驗證靶標取并集作為后續(xù)分析的靶基因集合

P∩T∩M means the results of prediction using 3 different kinds of target gene prediction sofwares，(P∩T∩M)∪R∪W means the group of target genes used for the following analysis which come from the intersection of 3 target gene prediction softwares，target genes in papers published and those verified in miRWalk database

2.5 KEGG Pathway富集分析

為了獲取更多關于miR-320a在功能方面的信息，本試驗在GO 注釋分類的基礎上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)對基因集合中的84個基因進行生物通路富集分析。結果顯示，在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中bta-miR-320a預測靶基因集合顯著富集于神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞周期、p53信號通路、細胞凋亡、蛋白激酶(MAPK)5個信號轉導通路和10個疾病相關信號通路(圖2)，其中與生長發(fā)育關系密切的MAPK信號通路也發(fā)生了顯著性富集(P<0.05，Benjamini=0.062)，可能具有假陽性。

表5 bta-miR-320a靶基因集在細胞組分(CC)層面富集結果

Table 5 Function enrichment of bta-miR-320a predicted target genes in CC

GO條目GOterm數(shù)目CountsP值P?value誤判率Benjamini基因列表ListofgenesNuclearlumen190．00010．0110E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等Nucleoplasm140．00020．0140E2F1，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BRCA1，POLR3D，ELL2，MAPK1等Intracellularorganellelumen190．00080．0490E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等Organellelumen190．00100．0480E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等Membrane?enclosedlumen190．00130．0480E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等

表6 bta-miR-320a靶基因集在分子功能(MF)層面富集結果

Table 6 Function enrichment of bta-miR-320a predicted target genes in MF

GO條目GOterm數(shù)目CountsP值P?value誤判率Benjamini基因列表ListofgenesTranscriptionregulatoractivity200．00010．0230E2F1，ZNF281，COPS2，EZH2，TP53，PAX6，REST，BRCA1，TP73，ELL2，CDKN1C等Enzymebinding110．00030．0280MAPK1，YWHAH，BCL2，RAC1，TP53，RAP1A，BIRC5，F(xiàn)AS，RASA1，BRCA1，PIK3R1

Y軸為-log2P-value，X軸為富集到的信號通路條目，Y越大，富集越顯著(P<0.05，Benjamini<0.05)The Y-axis means -log2P-value，X-axis means the pathway terms enriched(P<0.05，Benjamini<0.05)圖2 bta-miR-320a靶基因的KEGG 通路分析結果Fig.2 KEGG enrichment result of bta-miR-320a predicted target genes

2.6 轉錄因子-miRNA-靶基因作用網(wǎng)絡

轉錄因子SP1、AP-2、PPARG、MYOD1和CREB調(diào)控了bta-miR-320a基因的轉錄，bta-miR-320a通過TP53、MAPK1等靶基因參與了MAPK、p53和細胞周期信號通路(圖3)。

三角代表轉錄因子，圓形代表bta-miR-320a，方塊表示靶基因The triangles represent transcription factors，the center is bta-miR-320a，the squares means target genes圖3 轉錄因子-miRNA-靶基因作用關系圖Fig.3 TF-miRNA-target gene network

3 討 論

在生物體內(nèi)，1個miRNA可能作用于多個靶基因，也可能是多個miRNA調(diào)控1個靶基因，這種作用構成一個調(diào)控網(wǎng)絡，在某些信號的刺激下，從整體上調(diào)控有機體的生命活動。 因此，miRNA的作用是通過其復雜的靶基因協(xié)同調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，僅僅靠試驗手段來研究miRNA已變得相當困難。靶基因數(shù)量和種類較多，生物信息學在miRNA的研究中扮演的角色越來越重要。生物信息學方法可以對海量和復雜信息進行分析和處理，為下一步試驗提供指導，包括編碼miRNA基因上游的TFBS預測、miRNA的靶基因預測及靶基因的GO分析、信號通路分析等。miRanda、TargetScan和PicTar是目前較流行的3種miRNA靶基因預測計算方法。miRanda是最早的一種預測算法，有較好的檢出率，預測的靶基因數(shù)量較多，但假陽性率也較高；TargetScan和PicTar作為第二代預測算法，其預測靶基因的數(shù)量相對減少，但同時也增加了預測的精確度，降低了假陽性率。雖然這3種不同的軟件預測的結果不一樣，但同時采用這3種預測算法進行預測，然后取其交集部分，就能提高預測結果的可靠性，減少假陽性率。本試驗在利用miRanda對bta-miR-320a的靶基因進行預測時將閾值設定為mirSVR score<-1，減少了假陽性率，然后采用上述3種靶基因預測軟件預測結果的交集部分，使靶基因的預測更加準確。在進行后續(xù)功能分析之前，綜合了miRWalk數(shù)據(jù)庫(2011)和近幾年來關于miR-320家族的研究中所確定的靶標作為后續(xù)分析的靶基因集合，靶基因預測是進行miRNA功能研究的基礎，采用上述策略鑒定出的靶基因保證了后續(xù)功能分析的全面和可靠性。

關于miR-320家族的功能研究多集中在癌癥方面。C.Shang等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-320a通過靶向抑制整合素β3(Integrin，beta 3，ITGB3)介導了膀胱癌的侵襲；miR-320a/c/d可靶向抑制G蛋白α抑制性多肽1(G protein alpha inhibiting activity polypeptide 1，GNAI1)表達，進而抑制肝癌細胞的遷移和遷徙[12]；miR-320a亦可通過靶向抑制Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)影響結腸直腸癌的發(fā)展[13]；在重癥肌無力病人中miR-320a下調(diào)表達，通過靶作用于絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)調(diào)節(jié)炎性細胞因子產(chǎn)生[14]；在血紅素介導的紅細胞分化研究[15]中，miR-320a通過抑制其靶基因BTG3相關核蛋白(BTG3 associated nuclear protein，BANP)發(fā)揮了調(diào)控作用。由這些研究可以得知miR-320a是癌細胞和紅細胞分化中的抑制因子，推測它在牛脂肪細胞分化中可能也起到了抑制作用。

Bta-miR-320a靶基因集的GO注釋富集在負調(diào)控細胞分化、細胞周期等多個生物學過程條目中，由此推測,bta-miR-320a對牛脂肪細胞分化產(chǎn)生了負調(diào)控作用，從而抑制脂肪沉積。脂肪沉積能力強的牛種中bta-miR-320a下調(diào)表達，減弱了這種抑制作用，這與人們的預期相符。bta-miR-320a對牛脂肪細胞分化的負調(diào)控作用是通過對其靶基因如抑癌基因53(Tumor suppressor53，TP53或p53)、MAPK1等的抑制作用實現(xiàn)的。TP53編碼了一種具有轉錄激活、DNA結合功能的腫瘤抑制蛋白，介導了細胞周期停滯、細胞凋亡、衰老、DNA損傷修復等生物過程，參與了MAPK、細胞周期和p53等多個信號通路的信號轉導。MAPK1屬于蛋白激酶家族，是MAPK信號通路中的重要成員，參與了細胞的增殖分化、轉錄調(diào)控和發(fā)育等廣泛的生物學過程。牛脂肪細胞由前體脂肪細胞增殖分化而來，前體脂肪細胞經(jīng)歷有絲分裂克隆增殖、生長停滯和終末分化形成成熟的脂肪細胞，在這一過程中pRB-E2F、MAPK、SMAD/TGFβ、Wnt等信號通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本試驗中，bta-miR-320a的靶基因富集在細胞周期、p53信號通路、MAPK等信號轉導通路和10個疾病相關信號通路，其中細胞周期、p53信號通路在真核生物有絲分裂細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要功能，MAPK級聯(lián)信號通路在真核生物中是一個高度保守的通路，它調(diào)控了包括細胞增殖、分化和遷移等各種功能，MAPK作為上游的通路也會對細胞周期產(chǎn)生作用。靶基因之一的TP53參與了上述3條通路，在信號傳導中占據(jù)著樞紐位置，它在G1、S和 G2時相轉換中發(fā)揮調(diào)控作用。Q.Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠3T3L1前體脂肪細胞分化的有絲分裂克隆增殖階段，miR-17-92簇上調(diào)表達，激素誘導的miR-17-92過表達加速了3T3L1前體脂肪細胞分化，增加了甘油三脂積聚。針對這些現(xiàn)象，他們提出了一個模型：在激素誘導后3T3L1前體脂肪細胞中，miR-17-92表達量升高，抑制了其靶基因成視網(wǎng)膜細胞瘤樣2(Retinoblastoma-like 2，RB2/P130)表達，導致沒有足夠的RB2/P130與轉錄因子E2F(E2F transcription factor，E2F)形成二聚體來抑制E2F，活化狀態(tài)的E2F4和E2F5增加，激活了成視網(wǎng)膜瘤蛋白pRB-E2F信號通路，啟動細胞進入下一個周期。因此，miR-17-92簇在克隆增殖階段的上調(diào)表達促進了前體脂肪細胞分化。L.Chen等[17]用芯片技術研究大鼠脂肪組織來源基質(zhì)細胞(Adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs)向成熟脂肪細胞分化時miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-363發(fā)生了最顯著的下調(diào)，ADSCs中過表達miR-363會引起克隆增殖和終末分化抑制，進而確定miR-363是脂肪生成中的一個負調(diào)控者，可以靶向抑制E2F3的轉錄后翻譯水平，通過激活pRB-E2F抑制周期蛋白E(Cyclin E，CYCE)的表達，從而抑制細胞從G1向S期的轉變也就抑制了前體脂肪細胞克隆增殖，從而抑制了細胞終末分化。C.Esau和L.Chen等[6，18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143能通過對其在MAPK信號通路中靶基因絲裂原活化蛋白激酶5(Mitogen-activated protein kinase 5，MAPK5)的抑制作用調(diào)控脂肪細胞的分化。miR-17-92、miR-363和miR-143等通過pRB-E2F和MAPK信號通路調(diào)節(jié)了脂肪細胞分化，而pRB-E2F信號通路中的RB、E2F也是細胞周期通路的作用元件，因此推測，在牛脂肪細胞分化中，miR-320a通過對細胞周期和p53信號通路中相關靶基因如TP53的靶向抑制，影響了這些通路信號的傳遞，進而導致前體脂肪細胞有絲分裂克隆擴增中G1-S-G2相位轉變的時序發(fā)生變化，從而影響了前體脂肪細胞分化。同時，它也對MAPK級聯(lián)信號通路中相關的分子組件進行靶向抑制，對MAPK下游信號通路產(chǎn)生影響，調(diào)控脂肪細胞分化。bta-miR-320a基因啟動子區(qū)域具有SP1、PPARG和MYOD1等轉錄因子結合位點，這些轉錄因子與脂肪細胞增殖分化、脂代謝關系密切，可能會對miR-320a調(diào)控牛脂肪細胞分化產(chǎn)生影響。

本試驗篩選出的靶基因還需要進一步的試驗驗證。另外，在進行靶基因預測和功能分析時使用的條件比較嚴格，可以有效減少假陽性率，提高預測準確度，但同時會有一些漏篩率，還需找到更加準確全面的方法對bta-miR-320a進行后續(xù)分析。總之，本試驗對miR-320a在牛脂肪沉積中的功能進行了探索，挖掘出了SP1等多種轉錄因子、TP53和MAPK1等關鍵靶基因以及p53等重要信號通路，為后續(xù)的試驗驗證提供參考。

4 結 論

Bta-miR-320a受到SP1等多種轉錄因子調(diào)控，它可能通過對MAPK、細胞周期和p53信號通路中靶基因TP53、MAPK1等的抑制調(diào)控了牛脂肪細胞分化，進而影響了牛的脂肪沉積。

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(編輯 郭云雁)

Target Gene Prediction and Bioinformatics Analysis of bta-miR-320a

GUO Yun-tao，ZHANG Xiu-xiu，MIAO Xiang-yang*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The prediction and analysis of bta-miR-320a target genes by bioinformatics were performed to explore its effect on the fat deposition in bovine.In this study，bioinformatics tools such as Promoter Scan，TargetScan，DAVID，Cytoscape and databases for example miRBase，Ensemble，NCBI，miRWalk，et al were used to perform the prediction of the transcription factor binding site and the analysis of its target genes，involved Gene ontology and KEGG pathway.As a result，miR-320(a) was very conservative among various species.There were many different transcription factor binding sites in the bta-miR-320a promoter area.Eighty-four target genes were obtained in total which involved in multiple biological processes such as negative regulation of cell differentiation，regulation of cell cycle and negative regulation of growth and participated in p53，cell cycle and MAPK signal pathways.We assumed that bta-miR-320a is regulated by different transcription factors，and it can also regulate the adipocyte differentiation and fat deposition in bovine by post transcriptional inhibiting of its target genes involved in p53，cell cycle and MAPK signal pathways.

bovine；bta-miR-320a；target gene；bioinformatics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.006

2014-12-24

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2013ywf-yb-5；2013ywf-zd-2)；中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(ASTIP-IAS05)；轉基因生物新品種培育科技重大專項(2009ZX08008-004B；2008ZX08008-003)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z140)；國家自然科學基金項目(30571339)；中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新基金項目(2004-院-1)

郭云濤(1988-)，男，河南南陽人，碩士，主要從事轉基因與細胞工程研究，E-mail：yuntao008@126.com

*通信作者：苗向陽，研究員，博士，博士生導師，主要從事基因工程與功能基因組學及轉基因動物研究，E-mail：mxy32@sohu.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)11-1952-09