徐翊軒， 戰(zhàn)文斌， 邢 婧

(中國海洋大學教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室，山東 青島 266003)

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溫度與脂多糖對櫛孔扇貝血細胞吞噬活力的影響?

徐翊軒， 戰(zhàn)文斌， 邢 婧??

(中國海洋大學教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室，山東 青島 266003)

貝類無特異性免疫系統(tǒng)，細胞吞噬是其免疫防御的重要方式之一。在5、10、15、20和25℃養(yǎng)殖條件下，給櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)分別注射熒光微球、脂多糖和熒光微球混合液。在注射后的0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42和48h抽取血細胞，用熒光標記血細胞以觀察其對微球的吞噬狀態(tài)，用流式細胞術測定血細胞對微球的吞噬率。結果表明，在5個養(yǎng)殖溫度下，2個處理組均自6h后扇貝血細胞內(nèi)即出現(xiàn)吞噬的微球，之后吞噬率逐漸上升，直到18～24h達到最高峰，隨后逐漸下降。5、10、15、20和25℃條件下，注射熒光微球組血細胞最大吞噬率分別為8.66%±0.26%、14.00%±0.22%、16.97%±0.55%、25.62%±0.88%和8.97%±0.25%，注射脂多糖和熒光微球混合液組分別血細胞最大吞噬率為9.75%±0.48%、17.49%± 0.43%、23.13%±0.57%、34.16%±0.97%和10.42%±0.45%。20℃組的兩處理組血細胞吞噬率顯著高于其他溫度組，其次是15和10℃組，最低是5和25℃組，并且20、15℃組的最大吞噬率出現(xiàn)在18h，其他組均在24h。各養(yǎng)殖溫度組中，脂多糖和熒光微球混合液組血細胞吞噬率均高于熒光微球組。研究表明：櫛孔扇貝血細胞的吞噬活力受水溫影響顯著，脂多糖能夠顯著增強扇貝血細胞的吞噬活力。

櫛孔扇貝； 血細胞； 吞噬活力； 溫度； 脂多糖

貝類血細胞是其免疫防御的主要組成部分，血細胞通過吞噬、包囊、胞吐及活性氧產(chǎn)生等完成細胞免疫，還通過分泌和釋放各種免疫因子參與體液免疫[1-2]。血細胞的吞噬作用是細胞免疫的主要方式，吞噬過程主要包括趨化作用、識別接觸、內(nèi)化和消化4個階段[3]，最后清除異物。血細胞吞噬過程涉及多種因子與細胞類型，因此在某種程度上能夠反應出機體生理等健康狀況[4-5]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子[6-8]、外源刺激[9-10]和病源感染等[11-13]均會引起貝類血細胞吞噬活性的變化。水溫是影響貝類免疫防御的重要環(huán)境因子，研究發(fā)現(xiàn)，過高的水溫是櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)大規(guī)模死亡的主要原因之一[14-15]，水溫的驟然改變會引起貝類血細胞吞噬率、活性氧產(chǎn)量及酶活性等的變化[15-17]。脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜的組成部分，被稱為固有免疫的重要激活劑之一，具有免疫調(diào)節(jié)作用[18-19]，有研究發(fā)現(xiàn)其在激活血細胞增殖[20]、活化酶原[21]、增強細胞吞噬活性[22]等方面效果顯著。在雙殼類中, 針對血細胞的吞噬作用已開展大量研究，目前多應用顯微鏡觀察計數(shù)法、光密度法及流式細胞術研究吞噬活性[23]。直接計數(shù)法比較直觀，但測定樣品量有限，計算誤差較大；流式細胞儀方法測定血細胞數(shù)較多，但細胞本身自發(fā)熒光干擾等因素不能確定吞噬的準確性。熒光微球是高分子微球，顆粒度均一、穩(wěn)定性好，應用于細胞吞噬率的檢測具有熒光強度均一、易于觀察、誤差小等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域中示蹤目標細胞、免疫標記、藥物載體選擇等方面應用廣泛[24]，結合流式細胞術檢測細胞吞噬率具有準確、靈敏、直觀等優(yōu)點。因此，采用熒光微球吞噬、流式細胞儀測定方法能夠直觀、準確、快速的測定血細胞的吞噬率此方法是目前優(yōu)選的細胞吞噬測定方法。

櫛孔扇貝是中國北方主要的養(yǎng)殖貝類，前期研究發(fā)現(xiàn)水溫突變對扇貝血細胞數(shù)量的變化影響顯著，甘露糖刺激能顯著激活血細胞內(nèi)6種內(nèi)源酶的活力[13]。本文在此基礎上研究櫛孔扇貝在5、10、15、20和25℃養(yǎng)殖水溫下，分別注射熒光微球、脂多糖和熒光微球混合液，觀察血細胞吞噬狀態(tài)，測定血細胞吞噬率，研究水溫和脂多糖對血細胞吞噬活力的影響，以期為櫛孔扇貝血細胞吞噬作用的研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及熒光微球和脂多糖的注射實驗

櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)(殼長(7.0±0.3)cm)采自青島八號碼頭扇貝養(yǎng)殖場，于水溫17℃下暫養(yǎng)。將暫養(yǎng)扇貝隨機分成5組，分別養(yǎng)殖于水溫為5、10、15、20和25℃的容器中。一周后，將每個水溫的扇貝隨機分成3組，每組100只。第一組于閉殼肌注射100μL濃度為109particles/mL的熒光微球(Fluorescent microparticles，F(xiàn)M，Polysciences, 美國；直徑為1μm，微球標記藻紅蛋白)磷酸鹽緩沖液(PBS，8g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4，0.2g KH2PO4，5.58g EDTA，加蒸餾水至1L，pH=7.2)；第二組注射100μL脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS，Sigma, 德國)和FM的PBS混合液，LPS和FM的終濃度分別為1.0mg/mL和109particles/mL；第三組注射100μL的PBS。分別于處理后0、6、12、18、24、30、36、42和48h，在各養(yǎng)殖溫度下的各實驗組隨機取扇貝10只，抽取血淋巴，用于觀察血細胞的吞噬狀態(tài)和測定血細胞的吞噬率。

1.2 血細胞懸液制備

以裝有預冷抗凝劑(PBSE：8g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4，0.2g KH2PO4，5.58g EDTA，加蒸餾水至1L，pH=7.2)的無菌注射器以1∶1比例從取樣扇貝閉殼肌血竇中抽取血淋巴；之后400g 4℃離心10min，以PBS重懸血細胞沉淀，再離心洗滌2次；最后用PBS重懸，調(diào)整濃度約為107cells/mL，即為血細胞懸液，用于細胞標記熒光觀察血細胞吞噬狀態(tài)和流式細胞術檢測血細胞吞噬率。

1.3 細胞熒光標記及血細胞吞噬狀態(tài)觀察

血細胞懸液1mL中加異硫氰酸熒光素(Fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC)的細胞標記溶液(Life technologies, 美國)5μL，于37℃孵育5min，將血細胞懸液滴在潔凈的載玻片上，室溫濕盒中沉降45min后，棄去懸液，以無熒光的甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察血細胞的吞噬狀態(tài)。每組樣品重復測定3次。

1.4 流式細胞術

血細胞懸液經(jīng)300目篩絹過濾，用流式細胞儀(Becton Dickinson，法國)測定血細胞的吞噬率。流式細胞儀正散射光(FS)、側(cè)散射光(SS)和熒光強度(FL)分別表明的是血細胞的大小、胞質(zhì)顆粒度和熒光強度，結果應用WinMDI 2.9軟件分析血細胞的吞噬率，以PBS組的熒光強度為血細胞吞噬率的陰性對照。血細胞吞噬率=含熒光微球的血細胞/測量血細胞的總數(shù)×100%，本實驗重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

流式細胞儀測定的數(shù)據(jù)用Origin 8.0軟件處理并作圖，用One-way ANOVA統(tǒng)計分析實驗組與對照組間的差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 細胞熒光標記及血細胞吞噬狀態(tài)觀察

熒光顯微鏡下，所有血細胞均標記上了FITC，整個血細胞呈現(xiàn)薄薄的綠色熒光，F(xiàn)M呈現(xiàn)出紅色熒光。發(fā)生吞噬的血細胞，可觀察到在綠色熒光的細胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光顆粒，有的細胞中微球顆粒較多，紅色熒光亮度較強，與綠色熒光疊加呈現(xiàn)亮黃色。相同視野下的微分干涉相差顯微鏡觀察，可見血細胞內(nèi)細胞核界限清晰，細胞質(zhì)中有的有顆粒，有的無顆粒，吞噬的微球呈現(xiàn)出不透光的顆粒(見圖1)。隨著處理時間延長，血細胞的吞噬率逐漸增加，隨后緩慢下降，直至實驗結束。PBS對照組僅觀察到標記上綠色熒光的血細胞。

(A：熒光顯微鏡觀察結果；B：相同視野下微分干涉相差顯微鏡觀察結果。箭頭指示吞噬熒光微球的血細胞。A: Fluorescence microscopic assay. B: differential interference contrast microscopic assay at the same field of view. The arrows indicate haemocytes phagocytosing fluorescent microparticles.)

圖1 養(yǎng)殖水溫為15℃下注射脂多糖和熒光微球
混合液18h后扇貝血細胞吞噬狀態(tài)的熒光觀察結果
Fig.1 Flurescence microscope observation of fluorescent microparticles phagocytosed by haemocytes at 15 ℃

2.2 流式細胞術

養(yǎng)殖水溫為5℃時，兩處理組扇貝血細胞吞噬率均呈現(xiàn)出首先快速上升，至24h達到最高，之后逐漸下降，至實驗結束(見圖2)，其中，LPS和FM混合液組血細胞的吞噬率自12h(3.58% ± 0.33%)開始顯著高于FM組(3.12% ± 0.28%)(P<0.05)(見圖2A)，直至24h到達最高(9.75% ± 0.48%)，仍顯著高于FM組(8.66% ± 0.26%)(P<0.05)(見圖2B)，整個實驗過程中，注射LPS和FM混合液組在12、18、24、36和42h的血細胞吞噬率均顯著高于FM組(P<0.05)。PBS組的陰性對照值一直變化不顯著，平均為0.43% ± 0.11%。

養(yǎng)殖水溫為10℃時，2處理組扇貝血細胞吞噬率也呈現(xiàn)出首先快速上升，至24h達到最高，之后逐漸下降，至實驗結束(見圖3)，其中，注射LPS和FM混合液組血細胞的吞噬率自6h(5.68% ± 0.33%)顯著高于FM組(3.42% ± 0.20%)(P<0.05)(見圖3A)，至24h

(A：扇貝血細胞吞噬率的變化圖。B：注射24h后血細胞吞噬率的流式細胞術檢測結果圖。小寫字母(a, b, c, d, e, f, g, h, i)表示同一處理下不同時間點之間的顯著性差異(P<0.05)。“*”表示LPS+FM組與FM組間差異顯著(P<0.05)。A. Variation of haemocyte phagocytosis activity; B. Histogram plot of flow cytometry for phagocytosis activity haemocyte at 24 h. Values with different lower-case superscripts (a, b, c, d, e, f, g, h, i) indicate significant differences (P<0.05) among different time point within the same treatment. Asterisks “*” indicate significant difference (P<0.05) between the LPS+FM group and FM group at the same time.)

圖2 流式細胞術檢測養(yǎng)殖水溫為5℃時注射熒光微球(FM)、注射脂多糖和熒光微球混合液(LPS+FM)后扇貝血細胞吞噬率的變化

Fig.2 Variation of haemocyte phagocytosis activity after mixture of Lipopolysaccharide (LPS) and fluorescent microparticles (FM) or FM injection in scallopsChlamysfarreriat 5 ℃ detection by Flow cytometry

(A：扇貝血細胞吞噬率的變化圖；B：注射24h后血細胞吞噬率的流式細胞術檢測結果圖。小寫字母(a, b, c, d, e, f, g, h, i)表示同一處理下不同時間點之間的顯著性差異(P<0.05)?！?”表示LPS+FM組與FM組間差異顯著(P<0.05)。A. Variation of haemocyte phagocytosis activity; B. Histogram plot of flow cytometry for phagocytosis activity haemocyte at 24 h. Values with different lower-case superscripts (a, b, c, d, e, f, g, h, i) indicate significant differences (P<0.05) among different time point within the same treatment. Asterisks “*” indicate significant difference (P<0.05) between the LPS+FM group and FM group at the same time.)

圖3 流式細胞術檢測養(yǎng)殖水溫為10℃時注射熒光微球(FM)、注射脂多糖和熒光微球混合液(LPS+FM)后扇貝血細胞吞噬率的變化

Fig.3 Variation of haemocyte phagocytosis activity after mixture of Lipopolysaccharide (LPS) and fluorescent microparticles (FM) or FM injection in scallopsChlamysfarreriat 10 ℃ detection by Flow cytometry

達到最高，為(17.49% ± 0.48%)，仍顯著高于FM組(14.00% ± 0.22%)(P<0.05)(見圖3B)，整個實驗過程中，注射LPS和FM混合液組在 6、18、24、30和48h的血細胞吞噬率均顯著高于FM組(P<0.05)。PBS組的陰性對照值一直變化不顯著，平均為0.23% ± 0.07%。

養(yǎng)殖水溫為15℃時，兩處理組扇貝血細胞吞噬率也呈現(xiàn)出首先快速上升，至18h達到最高，之后逐漸下降，至實驗結束(見圖4)，其中，注射LPS和FM混合液組血細胞的吞噬率自6h(6.54 %± 0.21%)顯著高于FM組(4.47% ± 0.29%)(P<0.05)(見圖4A)，18h達到最高，為23.13%±0.57%，仍顯著高于FM組(16.97%±0.55%)(P<0.05)(見圖4B)，整個實驗過程中，注射LPS和FM混合液組血細胞的吞噬率在6～24h均顯著高于FM組(P<0.05)。PBS組的陰性對照值一直變化不顯著，平均為0.19 %± 0.08%。

(A：扇貝血細胞吞噬率的變化圖；B：注射18h后血細胞吞噬率的流式細胞術檢測結果圖。小寫字母(a, b, c, d, e, f, g, h, i)表示同一處理下不同時間點之間的顯著性差異(P<0.05)。“*”表示LPS+FM組與FM組間差異顯著(P<0.05)。A. Variation of haemocyte phagocytosis activity; B. Histogram plot of flow cytometry for phagocytosis activity haemocyte at 18 h. Values with different lower-case superscripts (a, b, c, d, e, f, g, h, i) indicate significant differences (P<0.05) among different time point within the same treatment. Asterisks “*” indicate significant difference (P<0.05) between the LPS+FM group and FM group at the same time.)

圖4 流式細胞術檢測養(yǎng)殖水溫為15℃時注射熒光微球(FM)、注射脂多糖和熒光微球混合液(LPS+FM)后扇貝血細胞吞噬率的變化
Fig.4 Variation of haemocyte phagocytosis activity after mixture of Lipopolysaccharide (LPS) and fluorescent microparticles (FM)
or FM injection in scallopsChlamysfarreriat 15 ℃ detection by Flow cytometry

養(yǎng)殖水溫為20℃時，2處理組扇貝血細胞吞噬率也呈現(xiàn)出首先快速上升，至18h達到最高，之后逐漸下降，至實驗結束(見圖5)，其中，注射LPS和FM混合液組血細胞的吞噬率自6h(12.58% ± 0.26%)顯著高于FM組(11.41%±0.34%)(P<0.05)(見圖5A)，18h達到最高，為34.16%±0.97%，仍顯著高于FM組(25.06%±0.97%)(P<0.05)(見圖5B)，整個實驗過程中，注射LPS和FM混合液組血細胞吞噬率在6～48h的均顯著高于FM組(P<0.05)。PBS組的陰性對照值一直變化不顯著，平均為0.13% ± 0.06%。

養(yǎng)殖水溫為25℃時，2處理組扇貝血細胞吞噬率也呈現(xiàn)出首先快速上升，至24h達到最高，之后逐漸下降，至實驗結束(見圖6)，其中，注射LPS和FM混合液組血細胞的吞噬率自18h(6.65% ± 0.42%)顯著高于FM組(5.57% ± 0.40%)(P<0.05)(見圖6A)，至24h達到最高為10.42%±0.45%，仍顯著高于FM組(8.97%±0.45%)(P<0.05)(見圖6B)，整個實驗過程中，注射LPS和FM混合液組血細胞吞噬率僅在18、24和42h顯著高于FM組(P<0.05)。PBS組的陰性對照值一直變化不顯著，平均為0.44% ± 0.11%。

各養(yǎng)殖溫度組血細胞吞噬率的結果表明，20℃組血細胞吞噬率顯著高于其他溫度組，其次是15℃組、10℃組，5和25℃組血細胞吞噬率最低，這兩溫度組血細胞吞噬率差異不顯著(P<0.05)，并且15、20℃溫度組吞噬率最大值出現(xiàn)時間為18h，其他組均為24h。此外，各溫度組中，LPS和FM混合液組血細胞最大吞噬率均顯著高于FM組(P<0.05)(見表1)。

(A：扇貝血細胞吞噬率的變化圖；B：注射18h后血細胞吞噬率的流式細胞術檢測結果圖。小寫字母(a, b, c, d, e, f, g, h, i)表示同一處理下不同時間點之間的顯著性差異(P<0.05)。“*”表示LPS+FM組與FM組間差異顯著(P<0.05)。A. Variation of haemocyte phagocytosis activity; B. Histogram plot of flow cytometry for phagocytosis activity haemocyte at 18 h. Values with different lower-case superscripts (a, b, c, d, e, f, g, h, i) indicate significant differences (P<0.05) among different time point within the same treatment. Asterisks “*” indicate significant difference (P<0.05) between the LPS+FM group and FM group at the same time.)

圖5 流式細胞術檢測養(yǎng)殖水溫為20℃時注射熒光微球(FM)、注射脂多糖和熒光微球混合液(LPS+FM)后扇貝血細胞吞噬率的變化
Fig.5 Variation of haemocyte phagocytosis activity after mixture of Lipopolysaccharide (LPS) and fluorescent microparticles (FM) or FM injection in scallopsChlamysfarreriat 20 ℃ detection by Flow cytometry

(A：扇貝血細胞吞噬率的變化圖；B：注射24h后血細胞吞噬率的流式細胞術檢測結果圖。小寫字母(a, b, c, d, e, f, g, h, i)表示同一處理下不同時間點之間的顯著性差異(P<0.05)?！?”表示LPS+FM組與FM組間差異顯著(P<0.05)。A. Variation of haemocyte phagocytosis activity; B. Histogram plot of flow cytometry for phagocytosis activity haemocyte at 18 h. Values with different lower-case superscripts (a, b, c, d, e, f, g, h, i) indicate significant differences (P<0.05) among different time point within the same treatment. Asterisks “*” indicate significant difference (P<0.05) between the LPS+FM group and FM group at the same time.)

圖6 流式細胞術檢測養(yǎng)殖水溫為25℃時注射熒光微球(FM)、注射脂多糖和熒光微球混合液(LPS+FM)后扇貝血細胞吞噬率的變化Fig.6 Variation of haemocyte phagocytosis activity after mixture of Lipopolysaccharide (LPS) and fluorescent microparticles(FM) or FM injection in scallops Chlamys farreri at 25 ℃ detection by Flow cytometry

注：AD：激活持續(xù)時間；TPE：峰值出現(xiàn)時間；AE：激活幅度= 峰值-對照平均值；FM：熒光微球；LPS：脂多糖。表中大寫字母(A，B，C，D，E)表示同一處理不同溫度間的差異顯著性(P<0.05)；小寫字母(a，b)表示同一溫度峰值間的差異顯著性(P<0.05)。

Note：AD: Activation Duration; TPE: Time of Peak Emergence; AE:Activation Extent= Peak value-control value；FM:Flurenscent Microparticle; LPS:Lipopolysaccharide.Values with different capitalised superscripts (A, B, C, D, E) indicate significant differences (P<0.05) between the two temperatures within the same treatment; Values with different lower-case superscripts (a, b) indicate significant differences (P<0.05) among the two treatments within the same temperature.

3 討論

論文在觀察血細胞吞噬時應用含F(xiàn)ITC的細胞標記液標記血細胞，F(xiàn)ITC呈綠色熒光，藻紅蛋白熒光素呈紅色熒光，2種熒光染料的最大吸收波長均在495nm左右，在熒光顯微鏡下能夠同時觀察到綠色熒光和紅色熒光，再加上同一視野下微分相差的觀察，能夠清楚的觀察到血細胞的形態(tài)以及血細胞對熒光微球的吞噬狀況。另外，由于血細胞本身有自發(fā)熒光現(xiàn)象，在吞噬率較低的時候有可能血細胞自發(fā)熒光值會高于吞噬的熒光微球的熒光值，因此，以PBS注射組為對照，將其設為吞噬率的陰性值，能夠保證血細胞吞噬熒光微球的吞噬率更加準確。吞噬作用是貝類清除侵入機體的外源異物主要方式，包括趨化、接觸、內(nèi)吞和消化4個步驟。微生物入侵后, 血細胞通過與體液因子的共同作用移動到微生物入侵處, 之后血細胞通過細胞質(zhì)的變形包裹入侵微生物, 將其形成吞噬體隨之進入細胞內(nèi)部。細胞完成對入侵物的內(nèi)吞, 通過2種方式清除異物, 一是溶解, 通過溶酶體中的溶酶體酶等降解并消化，另一種方式是利用吞噬作用中產(chǎn)生的大量活性氧, 殺傷入侵的微生物[25]。本研究中注射的熒光微球是乳膠顆粒，血細胞在識別及吞噬后不能通過酶類水解或者活性氧自由基的方式消化微球，其可能的途徑可能有2種，一種血細胞在識別微球并進行包裹內(nèi)吞之后，細胞內(nèi)的酶類對微球無法分解和消化，隨著微球越來越多血細胞吞噬率的增加，微球在血細胞內(nèi)的不斷堆積，血細胞未能及時消化影響了血細胞酶源酶類的正常功能，導致血細胞溶解[3]，所以血細胞吞噬率在某些檢測階段有些下降也可能是有部分血細胞數(shù)量減少的原因；另一種少量的微球被識別吞噬后，血細胞無法識別和消化，血細胞內(nèi)某些因子的參與排異，最終排出細胞外，詳細的機制還需深入開展。從熒光顯微鏡觀察的結果發(fā)現(xiàn)，吞噬熒光微球的血細胞有顆粒細胞也有透明細胞，有的研究認為透明細胞是吞噬能力很強的細胞，這類細胞能夠活化酚氧化酶原系統(tǒng)組分并激活的吞噬能力[4]。還有的認為顆粒細胞通過釋放顆粒中的溶酶體酶參與吞噬并消除異物[2]，也是吞噬作用的積極參與細胞。本實驗的研究結果發(fā)現(xiàn)二種類型的血細胞均有不同程度的吞噬，也可能是因為二者通過不同途徑進行吞噬的結果。

本結果發(fā)現(xiàn)，注射LPS后，扇貝血細胞吞噬活力顯著增強。LPS是位于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的一種由類脂和多糖鏈組成的物質(zhì)，具有與相應細胞結合以及免疫活性。在免疫活性方面，LPS能夠通過感染后誘導巨噬細胞激活、產(chǎn)生大量細胞因子并激活細胞因子的活性[26]。添加LPS可促進血細胞變形并增強活動能力, 同時增強吞噬活力或溶菌酶的活力[27]，以及增強巨噬細胞吞噬功能和活性氧的產(chǎn)生[28-29]。脂多糖本身具有很強的抗原性和毒性，有些研究表明，注射脂多糖能夠引起血細胞大量減少[19-20]，可能是因為較高濃度的脂多糖引起的毒性作用導致的，因此適當?shù)臐舛仁茄芯棵庖哒{(diào)節(jié)作用的關鍵。本研究的預實驗發(fā)現(xiàn)，當LPS濃度≥3.0 mg/mL 時，各溫度組的部分扇貝開始出現(xiàn)一些抑制生長等癥狀，并有的出現(xiàn)死亡；當其濃度≤2.0mg/mL 時，各溫度組的扇貝均無異常反應。因此，選擇1.0 mg/mL這個濃度被選作為合適濃度做為增強血細胞吞噬率的研究。關于高濃度的LPS反而產(chǎn)生免疫抑制的原因可能是濃度過高容易短時間內(nèi)過度刺激免疫系統(tǒng)，導致機體免疫細胞及因子無防御反應和能力[30-31]。因此本文雖得出LPS提高了扇貝血細胞的吞噬率，并且激活的時間多在12～42h之間，建議在生產(chǎn)實踐添加多糖時應該注意選擇適當?shù)膭┝亢屯段箷r段。

本研究結果表明，水溫影響扇貝血細胞的吞噬率顯著，15或20℃養(yǎng)殖溫度處理組血細胞吞噬活性的激活程度、激活持續(xù)時間、吞噬率最大值出現(xiàn)時間均高于、長于并早于其他溫度養(yǎng)殖組。這個結果的原因可能是與相對較高或較低的養(yǎng)殖水溫相比，在其條件下，血細胞的運動能力、細胞膜的通透性等都有不同程度的下降，從而使其與相應結合蛋白結合的能力下降，引起與LPS的結合能力并激活細胞免疫活力的能力隨之下降。據(jù)報道LPS的激活機理主要與存在于血細胞膜上的LPS結合蛋白有關[32-33]。LPS結合蛋白是一種模式識別蛋白，可以特異性識別LPS。一旦識別LPS后，結合的復合物就會激活血細胞的免疫防御系統(tǒng)，進而引發(fā)吞噬、包囊、凝集和消化降解等，最終使血細胞內(nèi)產(chǎn)生和釋放大量免疫活性物質(zhì)增強細胞免疫功能[34]。這一解釋在2種螯蝦得到了驗證：在22℃時，螯蝦中的結合蛋白-mRNA表達量要顯著低于12和16℃[35]。本研究結果說明較高的溫度能顯著影響櫛孔扇貝的細胞的吞噬率，可能增加了被病原感染的機會，這也可能是櫛孔扇貝大規(guī)模死亡病在夏季水溫較高時期發(fā)病的原因。

[1] Roche P. Defense mechanisms and disease prevention in farmed marine invertebrates [J]. Aquaculture, 1999, 172(1-2): 125-145.

[2] Hine P M. The inter-relationships of bivalve haemocytes [J]. Fish and Shellfish Immunology, 1999, 9(5): 367-385.

[3] Bayne C J. Phagocytosis and non-self recognition in invertebrates. Phagocytosis appears to be an ancient line of defence [J]. Bioscience, 1990, 40: 723-731.

[4] Aladaileh S, Nair S V, Birch D, et al. Sydney rock oyster (Saccostreaglomerata) hemocytes: morphology and function [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2007, 96(1): 48-63.

[5] Chu F-LE. Defence mechanisms in marine bivalves [M].//Fingerman M, Nagabhushanam R. Recent Advances in Marine Biotechnology. Immunobiology and Pathology vol. 5. Plymouth, UK:Science Publishers, Enfield, NH, 2000: 1-42.

[6] 許友卿， 吳衛(wèi)君， 蔣偉明， 等. 溫度對貝類免疫系統(tǒng)的影響及其機理研究進展 [J]. 水產(chǎn)科學， 2012, 31(3): 176-180.

[7] Hegaret H, Wikfors G H, Soundant P. Flow cytometric analysis of haemocytes from eastern oysters,Crassostreavirginica, subjected to a sudden temperature elevation- II. Haemocyte functions: aggregation, viability, phagocytosis, and respiratory burst[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2003: 293： 249-265.

[8] Gagnaire B, Frouin H, Moreau K, et al. Effects of temperature and salinity on haemocyte activities of the pacific oyster,Crassostreagigas(Thunberg) [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2006, 20(4): 536-547.

[9] Boyd J N, Burnett L E. Reactive oxygen intermediate production by oyster hemocytes exposed to hypoxia [J]. The Journal of Experimental Biology, 1999, 202: 3135-3143.

[10] Matozzo V, Monari M, Foschi J, et al. Exposure to anoxia of the clamChameleagallina. I: Effects on immune responses [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2005, 325(2): 163-174.

[11] Liu J, Pan L Q, Zhang L, et al. Immune responses, ROS generation and the haemocyte damage of scallopChlamysfarreriexposed to Aroclor 1254 [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2009, 26(3): 422-428.

[12] Ciacci C， Citterio B, Betti M, et al. Functional differential immune responses ofMytilusgalloprovincialisto bacterial challenge [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2009, 153(4): 365-371.

[13] Xing J, Lin T, Zhan W. Variations of enzyme activities in the haemocytes of scallopChlamysfarreriafter infection with the acute virus necrobiotic virus (AVNV) [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2008, 25(6): 847-852.

[14] Huan P, Wang H, Liu B. Comparative proteomic analysis of challenged Zhikong scallop (Chlamysfarreri): a new insight into the anti-Vibrio immune response of marine bivalves [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 31(6): 1186-1192.

[15] Jie Xiaoa, Susan E Fordb, Hongsheng Yang, et al. Studies on mass summer mortality of cultured zhikong scallops (ChlamysfarreriJones et Preston) in China [J]. Aquaculture, 2005, 250 (3-4): 602-615.

[16] Yu J H, Song J H, Choi M C, et al. Effects of water temperature change on immune function in surf clams,Mactraveneriformis(Bivalvia: Mactridae) [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2009, 102(1): 30-35.

[17] Cheng W, Hsiao I S, Hsu C H, et al. Change in water temperature on the immune response of Taiwan abaloneHaliotisdiversicolorsupertextaand its susceptibility toVibrioparahaemolyticus[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2004, 17(3): 235-243.

[18] Yang J L， Qiu L M, Wang L L, et al. CfLGBP a pattern recognition receptor inChlamysfarreriinvolved in the immune response against various bacteria [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2010, 29: 825-831.

[19] Rungrassamee W, Maibunkaew S, Karoonuthaisiri N, et al. Application of bacterial lipopolysaccharide to improve survival of the black tiger shrimp afterVibrioharveyiexposure [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2013, 41(2): 257-262.

[20] Amparyup P, Sutthangkul J, Charoensapsri W, et al. Pattern recognition protein binds to lipopolysaccharide and β-1, 3-glucan and activates shrimp prophenoloxidase system [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(13): 10060-10069.

[21] Felix S. Pro-PO Based Immunomodulatory Effect of Glucan and LPS on Tiger Shrimp,Penaeusmonodon(Fabricius) [J]. Diseases in Asian Aquaculture V, 2005(3): 477-482.

[22] Takeshi Kadowaki, Yasumasa Yasui, Osamu Nishimiya, et al. Orally administered LPS enhances head kidney macrophage activation with down-regulation of IL-6 in common carp (Cyprinuscarpio) [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 34(6): 1569-1575.

[23] Carballal M J, López C, Azevedo C, et al. Invitrostudy of phagocytic ability ofMytilusgalloprovincialisLmk haemocytes [J]. Fish Shellfish Immunol, 1997, 7: 403-416.

[24] 于淼， 鄒明強， 何昭陽. 高分子熒光微球在生物醫(yī)學領域中的某些應用 [J]. 分析測試學報, 2006， 25(3): 33-35.

[25] 孫敬鋒， 吳信忠. 貝類血細胞及其免疫功能進展 [J]. 水生生物學報， 2006, 30(5): 601-606.

[26] 張洪淵, 劉克武, 姜云, 等. 圓背角無齒蚌堿性硫酸酶的功能基團研究 [J]. 水生生物學報, 1997, 21(4): 348-352.

[27] 孫虎山， 李光友. 脂多糖對櫛孔扇貝血清和血細胞中7種酶活力的影響 [J]. 海洋科學， 1999(4)： 54-57.

[28] 羅海波， 朱平， 李蘭娟. 細菌毒素與臨床 [M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1999： 1-9.

[29] 葉劍敏， 簡紀常， 吳后波， 等. 溶藻弧菌脂多糖的化學成分分析及其對石斑魚的毒性 [J]. 水生生物學報， 2004, 28(5): 574-576.

[30] Ai Q H, Mai K S, Zhang L, et al. Effects of dietary β-1, 3-glucan on innate immune response of large yellow croaker,Pseudosciaenacrocea[J]. Fish Shellfish Immunol, 2007, 22: 394-402.

[31] Chandra Kanta Misra, Basanta Kumar Das, Subhas Chandra Mukherjee, et al. Effect of long term administration of dietary β-glucan on immunity, growth and survival ofLabeorohitafingerlings [J]. Aquaculture， 2006, 255(1-4): 82-94.

[32] 趙虎， 周庭銀， 孔憲濤. LPS結合蛋白的結構和功能 [J]. 細胞與分子免疫學雜志， 2000， 16(1)： 91-92.

[33] Liu F S, Li F H, Dong B, et al. Molecular cloning and characterization of a pattern recognition protein, lipopolysaccharide and β-1, 3-glucan binding protein(LGBP) from Chinese shrimpFenneropenaeuschinensis[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36: 471-477.

[34] Jiravanichpaisal P, Lee B L, S?derh?ll K. Cell-mediated immunity in arthropods: Hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization [J]. Immunobiology, 2006, 211: 213-236.

[35] Jiravanichpaisal P, S?derh?ll K, S?derh?ll I. Effect of water temperature on the immune response and infectivity pattern of white spot syndrome virus (WSSV) in freshwater crayfish [J]. Fish Shellfish Immunol, 2004, 7: 265-275.

責任編輯 朱寶象

Effect of Water Temperature on Phagocytic Activitiy of the Haemocytes of Scallop (Chlamysfarreri) After Stimulated by Lipopolysaccharide

XU Yi-Xuan, ZHAN Wen-Bin, XING Jing

(The Key Laboratory of Mariculture， Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Phagocytosis of haemocytes is the primary innate immune defense of scallop (Chlamysfarreri). In this study, the scallop was accustomed at 5,10, 15, 20 and 25 ℃, respectively, then injected with either phycoerythrin labeled fluorescent microparticles (FM), lipopolysaccharide (LPS) plus FM or PBS. After that, haemocytes were collected at 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 and 48 hours post injection, respectively, and their phagocytic activity was measured with fluorescence microscope and flow cytometry (FCM). The results showed that haemocytes engulfed the FM at 6h, and the engulfing rate rose in the first 18-24 hours, reaching the maximum and then gradually declined. At 5℃, the maximum of haemocyte engulfing rate in the two treatment were 8.66% ± 0.26% and 9.75% ± 0.48%, respective; at 10 ℃ they were 14.00% ± 0.22% and 17.49% ± 0.43%; at 15 ℃, they were 16.97% ± 0.55% and 23.13%±0.57%; at 20 ℃ were 25.62% ± 0.88% and 34.16% ± 0.97%; at 25 ℃, they were 8.97 % ± 0.25% and 10.42% ± 0.45%. Engulfing rate in LPS-treated group was significantly higher than that in FM group. Moreover, at 20 ℃, engulfing rate was significantly higher than that of other groups, followed by 15 and 10 ℃ groups, and finally 5 and 25 ℃ groups, No significant difference between groups at 15 and 20 ℃. The results suggested that water temperature affected the engulfing rate significantly and LPS significantly enhanced the phagocytic activity of scallop haemocytes.

Chlamysfarreri; haemocyte; phagocytic activity; temperature; lipopolysaccharide

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(2012CB114405)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD17B02)；新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-10-0763)；教育部留學回國人員科研啟動基金項目(教外司留[2011]1139)資助

2014-02-20；

2014-05-05

徐翊軒(1977-)，男，碩士生，主要從事貝類免疫學研究。

?? 通訊作者： E-mail：xingjing@ouc.edu.cn

Q959.215

A

1672-5174(2015)06-031-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20140039