李 俊，王訓(xùn)翠，李慶林

(1．安徽中醫(yī)藥大學(xué);2．省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230038)

帕金森病(PD)是一種以黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失和紋狀體多巴胺含量顯著減少為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2030年，世界范圍內(nèi)50歲以上人群中，將會(huì)有930萬(wàn)人受困擾［1－2]。常用于PD動(dòng)物模型的試劑有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、魚藤酮(rotenone)、百草枯、6-羥基多巴(6-OHDA)［3]。其中MPTP在體內(nèi)代謝為1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)后，進(jìn)入線粒體，抑制氧化呼吸鏈復(fù)合體I(complex I)酶的活性，致使多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷。因此，MPP+損傷細(xì)胞建立帕金森病體外模型的實(shí)驗(yàn)方法已獲得公認(rèn)［4]。

在帕金森病患者中，特有的現(xiàn)象是SNc多巴胺能神經(jīng)元中線粒體復(fù)合酶I活性明顯下降［5]。線粒體膜電位(ΔΨm)的變化會(huì)影響線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔，改變線粒體跨膜電位和線粒體的形態(tài)，并能增加細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞能量代謝障礙。細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生90%左右來(lái)自于線粒體，文獻(xiàn)報(bào)道也證實(shí)氧化應(yīng)激與線粒體途徑的細(xì)胞死亡關(guān)系密切［6]。

伊拉地平是一種新型的二氫吡啶類鈣通道阻滯劑。有研究顯示，伊拉地平在帕金森病動(dòng)物模型中具有保護(hù)作用［7]，可延緩、甚至中止帕金森病病情。本實(shí)驗(yàn)研究探討伊拉地平對(duì)MPP+損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及作用機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 ISR(批號(hào):111213)獲贈(zèng)于安徽省新星藥物開發(fā)有限責(zé)任公司，純度99．0%;噻唑藍(lán)(MTT):Amersco進(jìn)口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司;DMEM:Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS):美國(guó)Hyclone公司;PBS:北京中杉生物技術(shù)有限公司;1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+):Sigma公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 PC12細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1．3 方法

1．3．1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 培養(yǎng)細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液配制2×108·L－1細(xì)胞懸液，100 μL每孔接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組，MPP+處理組，MPP++ISR組，每組6個(gè)復(fù)孔。置37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜后，按分組要求給與不同濃度藥物處理，培養(yǎng)24 h后，每孔加5 g·L－1的 MTT溶液10μL，37℃下繼續(xù)孵育4 h后，除去培養(yǎng)液，加入150μL DMSO，低速震蕩10 min，充分溶解藍(lán)色結(jié)晶。以酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔吸光度值。細(xì)胞活性以與正常對(duì)照組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

1．3．2 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×109·L－1接種培養(yǎng)于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組與處理同前，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，離心(1 500 r·min－1，5 min)收集各組細(xì)胞，細(xì)胞重懸于終濃度為10μmol·L－1的二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2＇，7＇-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)不含血清的培養(yǎng)液中，吹勻，避光條件下培養(yǎng)20 min，熒光強(qiáng)度使用流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)檢測(cè)。

1．3．3 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位(MMP) 收集各組細(xì)胞，加入終濃度為5 mg·L－1JC-1染液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20 min，以800 r·min－1低速離心5 min，去上清，培養(yǎng)基清洗3次，細(xì)胞重懸，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗(yàn)，并且用 SPSS 17．0軟件包進(jìn)行處理，P＜0．05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 ISR對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響 如圖1所示，隨著MPP+濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸下降，MPP+濃度為1 mmol·L－1時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，與正常對(duì)照組比較，MPP+組細(xì)胞存活率為(56．4 ±7．1)%(P ＜0．01);0．5 ～2 μmol·L－1ISR對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，并呈一定的量效依賴性。因此，以1 mmol·L－1MPP+作為最佳造模濃度，以2μmol·L－1ISR作為最佳給藥劑量，見(jiàn)圖1。

2．2 伊拉地平對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS的影響 與正常對(duì)照組比較，1 mmol·L－1MPP+處理PC12細(xì)胞24 h后，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，提示細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯升高，2μmol·L－1伊拉地平處理組熒光強(qiáng)度明顯低于MPP+組，結(jié)果表明伊拉地平能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的ROS生成。見(jiàn)圖2。

2．3 伊拉地平對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 mmol·L－1MPP+處理PC12細(xì)胞24 h后，線粒體膜電位顯著降低，2 μmol·L－1伊拉地平預(yù)處理后，線粒體膜電位升高。結(jié)果提示伊拉地平可能通過(guò)阻止線粒體膜電位的下降而抑制線粒體損傷的發(fā)生。見(jiàn)圖3。

3 討論

帕金森病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)之一是線粒體功能障礙。線粒體膜電位是反應(yīng)線粒體內(nèi)膜通透性的主要標(biāo)志［8]，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transit pore，MPTP)的開放將導(dǎo)致線粒體膜電位降低。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組線粒體膜電位顯著降低，伊拉地平預(yù)處理后線粒體膜電位顯著升高。此研究結(jié)果提示神經(jīng)毒物MPP+引起線粒體MPTP開放，降低線粒體膜電位，伊拉地平能夠阻止這一損傷的發(fā)生。

氧化應(yīng)激是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后繼發(fā)性損害的主要機(jī)制。腦缺血缺氧，ROS生成增多，氧化系統(tǒng)與氧化應(yīng)激失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9]。正常情況下，神經(jīng)組織內(nèi)ROS的消除和生成處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài);在病理狀態(tài)及環(huán)境因素刺激下，ROS生成過(guò)多或干擾抗氧化防御系統(tǒng)功能，破壞這種動(dòng)態(tài)平衡，觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒性導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡［10]。因此，在神經(jīng)退行性疾病防治中清除氧化應(yīng)激因子或抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，MPP+引起細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，ISR能抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，表明ISR對(duì)受損細(xì)胞的保護(hù)作用可能與改善線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)。

［1] Xu J，Gong D，Man C，et al．Parkinson’s disease and risk of mortality:meta-analysis and systematic review［J]．Acta Neurol Scand，2014，129(2):71－79．

［2] Arasalingam A，Clarke C．Reasons for Parkinson＇s disease admissions in a large inner city hospital［J]．Parkinsonism Relat Disord，2014，20(2):237 －238．

［3] Huot P，Johnston T，Koprich J，et al．L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson’s disease［J]．Neuropharmacology，2012，63(5):829 －836．

［4] Jiang G，Hu Y，Liu L，et al．Gastrodin protects against MPP+-induced oxidative stress by up regulates heme oxygenase-1 expression through p38 MAPK/Nrf2 pathway in human dopaminergic cells［J]．Neurochem Int，2014，75:79 － 88．

［5] Park S，Kim D，Kang J，et al．Involvement of the Nrf2/ARE pathway in protection against 6-OHDA-induced SH-SY5Y cell death by α-iso-cubebenol［J]．Neurotoxicology，2014，44c:160 －168．

［6] 楊 靜，陳賽貞，王 婷．氧化應(yīng)激致PC12細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展［J]．中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2011，25，(1):102－105．

［7] 胡 明，陳國(guó)華，劉昌勤．鈣阻斷劑伊拉地平在帕金森病大鼠模型中的神經(jīng)保護(hù)作用［J]．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41(5):581－584．

［8] 賴桂華，王訓(xùn)翠，李慶林．丹皮酚通過(guò)抑制線粒體氧化應(yīng)激防止1-甲基-4-苯基吡啶離子損傷SH-SY5Y細(xì)胞［J]．安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，32(4):61 －65．

［9] Cheng B，Guo Y，Li C，et al．Edaravone protected PC12 cells against MPP(+)-cytoxicity via inhibiting oxidative stress and up-regulating heme oxygenase-1 expression ［J]．Neurol Sci，2014，343(1/2):115 －119．

［10] Li Z，Motherwell M．The impact of reactive oxygen species and genetic mitochondrial mutations in Parkinson’s disease［J]．Gene，2013，532(1):18 －23．