陳晶晶，陳 炯

(安徽省立醫(yī)院病理科，安徽合肥 230001)

免疫組織化學技術是用已知抗體或抗原檢測組織細胞中的未知抗原或抗體的技術，能將形態(tài)、代謝和功能密切結合起來，具有操作簡單、敏感性高、特異性強等優(yōu)點，廣泛地應用于病理診斷［1]。但常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋組織過程中會引起蛋白內和蛋白間亞甲基橋的橋連，導致許多抗原決定簇被封閉，使表達反應微弱，染色效果不佳，從而影響診斷的準確性，因此抗原修復技術是免疫組化實驗中的重要操作步驟［2]。結合實踐工作發(fā)現(xiàn)在陳舊惡性淋巴瘤標本中，一些核表達的標記物對抗原修復方式和修復溶液的選要求很嚴格，常規(guī)的熱修復結合低pH溶液很難達到預想的染色效果［3]，尤其是套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)核標記cyclinD1和淋巴母細胞淋巴瘤(lymphoblastic lymphomas，LBL)核標記TdT。這兩種核型標記物是診斷該類腫瘤的特異性標記物，所以合理的搭配抗原修復條件，盡量做到標準化對淋巴瘤的病理分型變的尤為重要。本次實驗采用高壓修復法，比較 pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和 pH 9．0 Tris/EDTA三種修復液對cyclinD1和TdT免疫組化結果產生的影響。

1 材料與方法

1．1 組織來源 收集本院病理科2005—2010年常規(guī)活檢切除的淋巴結陳舊標本104例(MCL 56例和LBL 48例)，標本固定均用10%中性緩沖福爾馬林，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，連續(xù)切片6～8張(不同檢測條件所需)，并且每張片子上放置陽性和陰性對照各一張，切片厚1～2μm，60℃烤箱，烤片過夜。

1．2 試劑及顯色試劑盒 抗體均采用北京中杉金橋生物公司，即用型 cyclinD1(EP12)和 TdT(SEN28);抗原修復溶液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA和 pH 9．0 Tris/EDTA);二抗及 DAB為北京中杉PV-6000 EnVision TM檢測試劑盒。

1．3 儀器設備 抗原修復高壓鍋(北京中杉金橋)，塑料染色架。

1．4 實驗方法和過程 按緩沖液pH值高低，將高壓鍋中各裝入不同pH值的緩沖液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和 pH 9．0 Tris/EDTA)加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片裝在耐熱高壓塑料染色架中，再放入高壓鍋中，蓋嚴鍋蓋，再加熱至噴汽繼續(xù)加熱，即達到工作壓力及溫度。計時2．5 min，停止加熱，室溫自然降溫，打開鍋蓋取出切片，蒸餾水洗凈切片后，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性8 min，PBS洗，每張切片上滴加相應的一抗。室溫下孵育2～3 h，PBS洗，二抗室溫下孵育30 min，PBS洗，DAB顯色，光鏡下控制。自來水充分沖洗，蘇木素復染、分化、藍化、脫水、透明，中性樹膠封片。每張切片都設有陽性和陰性對照。

1．5 結果判定 cyclinD1和TdT定位于細胞核，每張切片選10個高倍視野，每高倍視野記數(shù)100個正常細胞或癌細胞，用半定量積分法判斷結果先按染色強度打分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強度依背景著色進行對比;再按陽性細胞所占百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為＞75%。兩者計分之和所得總分進行結果判定。0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)［4]。

1．6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件，等級資料運用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結果

免疫組化染色結果，EDTA較檸檬酸鹽緩沖液，56例MCL中40例cyclinD1表達強度隨著pH值的升高而增強(見圖1～3)，陽性率從71%提高到82%，其中6例用pH 6．0 Citrate修復后不表達，而用pH 9．0 Tris/EDTA修復后強弱不等的表達(見表1)，按實際結果采用等級資料兩樣本配對秩和檢驗比較檸檬酸和pH 9．0 Tris/EDTA緩沖液對cyclinD1抗原修復結果，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)(見表2);另外48例LBL中42例TdT表達強度隨著pH值的升高而增強(見圖4～6)，陽性率從88%提高到95%，其中4例用pH 6．0 Citrate修復后不表達，而用高pH值EDTA修復后強弱不等的表達(見表1)，按實際結果采用等級資料兩樣本配對秩和比較檸檬酸和pH 9．0 Tris/EDTA緩沖液對TdT抗原修復結果，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)(見表3)。

表1 兩種抗體在三種不同抗原修復液中的免疫組化染色結果比較/%

表2 檸檬酸鹽和EDTA(pH9．0)緩沖液對cyclin D1抗原修復的比較

表3 檸檬酸鹽和EDTA(pH9．0)緩沖液對Td T抗原修復的比較

3 討論

免疫組化技術中保證實驗操作流程的標準化是個非常重要的問題。很多因素都會影響免疫組化染色結果的好壞，其中抗原修復是非常關鍵的步驟，修復方法是否得當，直接影響抗體的表達，影響病理診斷的準確性和患者治療方案的選擇的［5]。當活檢組織經(jīng)過福爾馬林和石蠟包埋后，許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得抗原決定簇被封閉。同時，甲醛的聚合作用使蛋白質分子間相互交聯(lián)形成了大分子網(wǎng)絡，也使抗原決定簇被掩蓋，使抗原與抗體的結合點減少，從而令抗原的陽性檢測率及著色強度相對減弱的［6]，必須進行抗原修復，以最大限度地暴露其被遮蓋的抗原，所以高壓修復配上合理的修復液可以改善難以檢測的細胞核陽性抗原的染色結果。cyclinD1是一種重要的細胞周期調節(jié)因子，在控制細胞從G1期進入S期起重要作用，它可以和CD4構成復合物，并與 Rb基因(retinoblastoma gene)產物結合，同時將后者磷酸化，繼而釋放轉錄因子E2F，最終刺激細胞的生長并導致細胞周期異常［7]。68% ～82%的 MCL患者染色體(11;14)(q13;q32)易位，導致細胞周期蛋白D1的PARAD(parathyroid adenomatosis)基因過度表達，促進cyclinD1蛋白的合成和過度表達，在其他形態(tài)相近的淋巴瘤均不具有此特點的［8]，是MCL最特異的免疫標記，因此cyclinD1主要用于MCL的診斷及鑒別診斷［9]。末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一種 DNA聚合酶．它可以不需要模板的存在而催化游離脫氧核苷酸隨機地插入到 DNA鏈3＇羥基末端［10]。該酶參與淋巴細胞發(fā)育過程中的免疫球蛋白和T細胞受體基因重排，在淋巴前體細胞中高表達，包括T和B(前期)淋巴細胞和淋巴母細胞，其表達有助于LBL的明確診斷，但也存在少數(shù)陰性的［11]。我們在診斷惡性淋巴瘤的過程中，這兩種特異性免疫指標非常的重要，但我們發(fā)現(xiàn)在蠟塊組織中染色陽性率達不到文獻報道的陽性率(MCL中cyclinD1陽性率68% ～82%;LBL中TdT陽性率96%)［12－13]。按我們實驗室常規(guī)標記的抗原修復方法和修復溶液，結果有時會有爭議，出現(xiàn)弱表達或不表達。分析原因可能是免疫組化組織前期處理和操作過程不當所致，包括標本活檢后沒有及時固定，固定的時間和量未達到要求;脫水不徹底;免疫組化操作中出差錯等，很多原因都會導致假陰性。我們通過反復實驗排除以上諸多因素，調節(jié)免疫組化操作中的可變因素發(fā)現(xiàn)惡性淋巴瘤的cyclinD1和TdT抗原在高壓修復方法、不同的修復液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和pH 9．0 Tris/EDTA)的條件下，核表達的強度隨著修復液pH值的升高而升高，甚至用酸性修復液抗原表達是陰性，再用EDTA修復抗原表達陽性。這說明高pH值的抗原修復液更容易暴露核的抗原決定簇，可能蛋白質是兩性物質，不同pH值的抗原修復液對裂解醛—氨基之間的交聯(lián)或蛋白質之間的交聯(lián)的作用不同，抗原決定簇暴露的程度也不同，使標記效果不同;其次用EDTA作抗原修復液，EDTA可與Ca2+形成螯合雙價金屬離子鹽(螯合劑)，螯合劑具有穩(wěn)定性，可消除Ca2+與蛋白質形成牢固的復合物，消除許多羥基(－OH)、羧酸根(－COOH)、磷酸根 PO43－的影響，即消除福爾馬林固定產生的不利因素;但具體的機制有待進一步的研究。因此，對于惡性淋巴瘤核表達標記物cyclinD1和TdT染色最好選用以EDTA為抗體修復液，進行高壓修復，以獲得最佳的效果，提高cyclinD1和TdT陽性檢出率，為臨床病理診斷良、惡性淋巴瘤提供確切的證據(jù)。

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