宋 佳，宋慧娟，李 丹，劉婷婷，葉麗平

遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 1210011病理生理學(xué)教研室；2科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78對(duì)人舌癌細(xì)胞侵襲的影響及其機(jī)制

宋 佳1，宋慧娟2，李 丹2，劉婷婷2，葉麗平1

遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 1210011病理生理學(xué)教研室；2科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

目的探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，Grp78)對(duì)人舌癌細(xì)胞系Tca-8113侵襲的影響及其分子機(jī)制。方法應(yīng)用pcDNA3.1(+)-Grp78重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染舌癌細(xì)胞系Tca-8113篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Grp78的克隆(78C6)，再應(yīng)用siRNAGrp78轉(zhuǎn)染78C6敲除Grp78表達(dá)，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)分析其侵襲能力，免疫熒光和細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞骨架排列和細(xì)胞伸展情況，GST-pulldown技術(shù)對(duì)Rac1和RhoA活性進(jìn)行分析，Western blot檢測(cè)Rac1、RhoA、MMP-9和MMP-2的表達(dá)。結(jié)果Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，特異性上調(diào)Grp78表達(dá)明顯促進(jìn)舌癌細(xì)胞的侵襲，并且這種促進(jìn)作用可以被siRNA-Grp78轉(zhuǎn)染抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Grp78高表達(dá)可以促進(jìn)舌癌細(xì)胞Tca-8113的伸展和極性形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞骨架染色結(jié)果表明特異性上調(diào)Grp78后，細(xì)胞骨架微絲主要分布于細(xì)胞邊緣，而這種作用可以被siRNA-Grp78轉(zhuǎn)染抑制，導(dǎo)致細(xì)胞皮質(zhì)部位出現(xiàn)明顯的應(yīng)力纖維。GST-pulldown結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Grp78高表達(dá)使Rac1的活性水平增高，RhoA活性降低，而siRNA-Grp78轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Rac1活性降低，RhoA活性升高。Western blot研究顯示，與對(duì)照組相比，Tca-8113/Grp78細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)增高(P＜0.05)，siRNA-Grp78轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)降低(P＜0.05)，而RhoA和Rac1的表達(dá)前后無(wú)變化。結(jié)論Grp78通過(guò)激活Rac1抑制RhoA活性及上調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)來(lái)促進(jìn)舌癌Tca-8113細(xì)胞的侵襲。

葡糖糖調(diào)節(jié)蛋白78；Tca-8113；侵襲

舌癌是口腔頜面部腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其死亡率和復(fù)發(fā)率極高，在臨床中舌癌常發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，這是影響舌癌治療效果的重要原因[1]，因此，抑制舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移成為治療舌癌的關(guān)鍵所在。Grp78(glucose regulated protein 78，Grp78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的一種多功能蛋白質(zhì)，屬于熱休克蛋白70家族。現(xiàn)已知Grp78參與許多重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞分化、細(xì)胞生存、血管形成、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、抗腫瘤免疫、腫瘤化療的耐藥性等[2-4]。近年來(lái)有報(bào)道指出，Grp78與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，在胃癌中Grp78的表達(dá)水平與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)[5-6]，在乳腺癌中Grp78可以作為預(yù)測(cè)乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的標(biāo)記物[7]，在胰腺癌和肝癌中Grp78特異性的高表達(dá)對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[8-9]。這些提示我們Grp78可能參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，而Grp78是否影響舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，目前國(guó)內(nèi)還少見(jiàn)報(bào)道。本研究中，我們通過(guò)特異性上調(diào)和下調(diào)舌癌細(xì)胞中Grp78的表達(dá)，觀察Grp78對(duì)舌癌細(xì)胞侵襲能力的影響，并對(duì)可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材料和方法

1材料 人舌癌細(xì)胞系Tca-8113由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)發(fā)育生物學(xué)教研室惠贈(zèng)；重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Grp78由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；人siRNA-Grp78由上?；鶆P公司合成，對(duì)照siRNA購(gòu)于Cell Signal公司；Rac1和RhoA活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于Pierce公司。轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購(gòu)于Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)于Costar Corning公司；TRITC標(biāo)記的毒傘素購(gòu)于Sigma公司.

2細(xì)胞培養(yǎng) 人舌癌細(xì)胞系Tca-8113培養(yǎng)于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，每2 ～3 d更換新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面的70% ～ 80%時(shí)，用含0.25%胰蛋白酶消化傳代。

3轉(zhuǎn)染及克隆篩選 pcDNA3.1(+)-Grp78、pcDNA 3.1(+)和siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行。具體方法：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至六孔板底面的70% ～ 80%時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒至2 μg/100 μl，加入7μl轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫作用30 min加入含1 ml新鮮培養(yǎng)液的六孔板中，siRNA轉(zhuǎn)染后72 h用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，PBS漂洗，進(jìn)行免疫印跡分析檢測(cè)Grp78表達(dá)水平以確定轉(zhuǎn)染效率。pcDNA3.1(+)-Grp78和

pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染后24 h，加入G418 (400 μg/ml)進(jìn)行克隆篩選，每3 ～ 4 d更換含有G418的新鮮培養(yǎng)液，直至生長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆，用滅菌棉簽調(diào)取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)于含200 μg/ml的G418新鮮培養(yǎng)液中，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

4免疫印跡 用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，PBS漂洗3次，RIPA緩沖液裂解，離心，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(50 μg/孔)，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，1% BSA封閉1 h，一抗(1∶1 000稀釋)孵育3h，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)常溫孵育30min。BCIP/NBT顯色液顯色。Chemi-Genius凝膠分析系統(tǒng)分析條帶的灰度值(UK)。

5GST-pull down檢測(cè)Rac1和RhoA活性 Rac1和RhoA活性測(cè)定按Pierce公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將Tca-8113裸細(xì)胞、Vector細(xì)胞、78C6、78C6-sicontrol及78C6-siRNA 5種細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%以上密度時(shí)，用PBS沖洗3遍然后加入裂解液200 μl，在冰上裂解細(xì)胞，離心，取上清偶聯(lián)GST-PBD的谷胱甘肽瓊脂糖珠(20 μl)混合，置于漩渦儀上混懸，然后離心棄上清，向沉淀中加入等體積2×Lamelli緩沖液，95℃加熱5 min洗脫，離心取上清。取20 μl用于免疫印跡分析，用Chemi-Genius(UK)凝膠分析系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

6Tranwell侵襲實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，用含0.1% FBS的培養(yǎng)液稀釋至106/ml，取100 μl接種于細(xì)胞外基質(zhì)凝膠包被的聚碳酸酯膜上層，小室下層置含10% FBS的培養(yǎng)基500 μl，培養(yǎng)48 h。取出聚碳酸酯膜，4%甲醛固定20 min，用細(xì)胞刮刀去除上層細(xì)胞，10%的結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3次，倒置顯微鏡下選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)每視野中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

7免疫熒光分析 以105/ml的密度接種于10 μg/ ml纖維黏連蛋白處包被的蓋玻片上，培養(yǎng)過(guò)夜，PBS漂洗，4%甲醛固定30 min，0.2% Triton-X-100透化5 min，1% BSA封閉30 min，一抗(1∶200稀釋)室溫溫育1 h，PBS漂洗，TRITC標(biāo)記的二抗(1∶100)室溫孵育1 h，95%甘油封片，油鏡下觀察結(jié)果。

8細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn) 以105/ml的密度接種于10 μg/ ml纖維黏連蛋白包被的六孔板中，分別于1 h和2 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞伸展情況，并拍照。用Osiris分析軟件測(cè)定細(xì)胞面積和細(xì)胞長(zhǎng)短軸的長(zhǎng)度，以細(xì)胞面積代表細(xì)胞伸展情況，以長(zhǎng)短軸長(zhǎng)度的比值代表細(xì)胞極性變化。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示；用SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1特異性上調(diào)Grp78后促進(jìn)舌癌Tca-8113細(xì)胞的侵襲 應(yīng)用pcDNA3.1(+)-Grp78重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Tca-8113，G418篩選40 d，免疫印跡鑒定得到穩(wěn)定高表達(dá)Grp78的舌癌細(xì)胞系Tca8113/Grp78，并根據(jù)克隆鑒定的結(jié)果選擇6號(hào)克隆作為后續(xù)研究的細(xì)胞，命名為78C6(圖1)。Transwell結(jié)果顯示，48 h后Tca8113/Grp78細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量明顯多于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，提示特異性上調(diào)Grp78表達(dá)可以增強(qiáng)舌癌細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖2。

2Grp78高表達(dá)促進(jìn)舌癌的伸展和極性形成 應(yīng)用Osiris分析軟件在細(xì)胞貼壁后1 h和2 h分別對(duì)細(xì)胞面積和長(zhǎng)短軸的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示，在貼壁后1 h，絕大多數(shù)Tca8113/Grp78稍呈現(xiàn)不規(guī)則圓形，伸展良好。貼壁后2 h，Tca8113/Grp78多呈現(xiàn)伸展的非對(duì)稱外觀，而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞多呈現(xiàn)圓形外觀(圖3)。應(yīng)用Osiris軟件分析結(jié)果表明，在貼壁后1 h和2 h后Tca8113/Grp78細(xì)胞的面積和長(zhǎng)短軸比均大于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提示Grp78具有促進(jìn)細(xì)胞伸展和極性形成的作用。見(jiàn)圖4。

3特異性下調(diào)Tca8113/Grp78細(xì)胞中Grp78表達(dá)抑制舌癌細(xì)胞的侵襲能力 應(yīng)用siRNA技術(shù)特異性下調(diào)Tca8113/Grp78(78C6)細(xì)胞中Grp78表達(dá)，Western blot進(jìn)行鑒定結(jié)果顯示，48 h后siRNAGrp78處理的Tca8113/Grp78細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。提示特異性下調(diào)Grp78可以抑制Tca8113/Grp78細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖5。

4Grp78影響細(xì)胞骨架的排列 應(yīng)用TRITC-毒傘素對(duì)細(xì)胞骨架的排列進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Tca8113/Grp78(78C6)中，微絲主要分布于細(xì)胞邊緣，而siRNA-Grp78轉(zhuǎn)染的Tca8113/Grp78細(xì)胞中，在細(xì)胞皮質(zhì)部位可見(jiàn)明顯的應(yīng)力纖維形成，這表明Grp78可影響Tca-8113細(xì)胞骨架的形成。見(jiàn)圖6。

圖 1 Western blot檢測(cè)篩選得到3、6、10克隆Grp78的表達(dá)情況, (aP＜0.05, vs vector group)Fig. 1 Western blot analysis of the expression of Grp78 in the cloning 3, 6, 10 cells (aP＜0.05, vs vector group)

圖 2 Transwell顯示48 h后Grp78高表達(dá)對(duì)舌癌侵襲能力的影響(aP＜0.05, vs vector group， 10×)Fig. 2 Transwell analysis of the effects of overexpression of Grp78 on the invasion potentials of tongue cancer cell after 48 hours (aP＜0.05, vs vector group, 10×)

圖 3 細(xì)胞接種于纖維黏連蛋白包被的6孔板中，1 h和2 h后的形態(tài)變化 (放大倍數(shù)40×)Fig. 3 Cell stretching experiment analysis of morphological changes after 1 and 2 hours when cells were planted in 6 wells where fiber adhesion protein was packaged (magnification 40×)

5Grp78對(duì)Rac1、RhoA活性及對(duì)Rac1、RhoA、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)GST-pull down 檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，特異性上調(diào)Grp78后Rac1活性升高而RhoA活性降低，用siRNA-Grp78下調(diào)Tca8113/Grp78中Grp78的表達(dá)后Rac1活性降低而RhoA活性升高。蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)Rac1、RhoA、MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與組照相比Tca8113/Grp78細(xì)胞中MMP-9和MMP-2的表達(dá)明水平明顯增高,而siRNA-Grp78轉(zhuǎn)染的78C6細(xì)胞中MMP-9和MMP-2的表達(dá)明水平降低。Rac1和RhoA的蛋白表達(dá)水平前后無(wú)明顯變化(P＞0.05)。見(jiàn)圖7。

圖 4 分別于1 h和2 h后檢測(cè)78C6和Vector細(xì)胞的伸展情況 (aP＜0.05, vs vector 1 h,bP＜0.05, vs vector 2 h)Fig. 4 Cell stretching experiment analysis of the spread of vector and 78C6 cells after 1 hour and 2 hours respectively (aP＜0.05, vs vector 1 h,bP＜0.05, vs vector 2 h)

圖 5 Western blot檢測(cè)78C6,78C6-siControl 和78C6-siGRP78中Grp78的表達(dá)情況 (aP＜0.05, vs 78C6-siControl group)Fig. 5 Western blot analysis of the expression of Grp78 in 78C6, 78C6-siControl and 78C6-siGRP78 (aP＜0.05, vs 78C6-siControl group)

圖 6 免疫熒光檢測(cè)Grp78對(duì)細(xì)胞骨架排列的影響(油鏡600×)Fig. 6 Immunofluorescence tested the effect of Grp78 on the arrangement of cytoskeleton (Oil immersion lens：600×)

圖 7 Grp78對(duì)Rac1、 RhoA活性的影響及對(duì)MMP-9、 MMP-2、 Rac1、 RhoA蛋白表達(dá)的影響1： parental; 2: vector; 3:78C6; 4： 78C6-siControl; 5: 78C6-siRNA; A,B: Western blot檢測(cè)(aP＜0.05, vs 78C6-siControl)Fig. 7 Effects of GRP78 on the activities of Rac1 and Rac1 as well as on the expression of Rac1, RhoA, MMP-2 and MMP-91：parental; 2: vector; 3: 78C6; 4: 78C6-siControl; 5: 78C6-siRNA; A, B: Western blot analysis of the expression of Rac1, RhoA, MMP-2 and MMP-9 in 1, 2, 3, 4 and 5 cells (aP＜0.05, vs 78C6-siControl)

討 論

近年來(lái)，許多研究表明，Grp78與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，為了研究Grp78對(duì)舌癌細(xì)胞Tca-8113侵襲轉(zhuǎn)移的影響，我們通過(guò)Transwell(圖2)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Grp78后穿過(guò)聚碳酸酯膜明顯增加，伸展實(shí)驗(yàn)(圖3、圖4)顯示上調(diào)Grp78后細(xì)胞的黏附和伸展能力也強(qiáng)于對(duì)照細(xì)胞。細(xì)胞骨架染色(圖6)顯示，與對(duì)照的細(xì)胞相比，在Tca-8113/ Grp78細(xì)胞中，細(xì)胞骨架發(fā)生明顯變化，微絲主要分布于細(xì)胞邊緣。之后我們用siRNA-Grp78下調(diào)Tca-8113/Grp78細(xì)胞中Grp78的表達(dá)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)Tca-8113/Grp78細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-Grp78后穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量明顯少于對(duì)照組，細(xì)胞骨架染色顯示細(xì)胞皮質(zhì)部位可見(jiàn)明顯的應(yīng)力纖維形成(圖6)。這些研究結(jié)果表明，在舌癌細(xì)胞系Tca-8113中特異性上調(diào)Grp78表達(dá)對(duì)舌癌的侵襲能力具有促進(jìn)作用，而這種促進(jìn)作用可以被siRNA-Grp78所抑制。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及宿主細(xì)胞、宿主環(huán)境、各種細(xì)胞分子及轉(zhuǎn)移微環(huán)境等復(fù)雜并且嚴(yán)格控制的過(guò)程。具體就腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)而言，包括細(xì)胞間黏著的喪失、細(xì)胞-基質(zhì)黏著的改變、細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶降解及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架改變參與的運(yùn)動(dòng)。已知RhoGTPases在細(xì)胞、細(xì)胞骨架、細(xì)胞形態(tài)的維持及細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用[10]，其中Rac1和RhoA作為RhoGTPases重要的亞家族成員具有調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞形體極化，影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與遷移等作用。Rac1和RhoA蛋白分別是以GDP結(jié)合的失活狀態(tài)和GTP結(jié)合的激活狀態(tài)存在，與GTP結(jié)合后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象改變，隨后可以與下游底物結(jié)合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]；目前認(rèn)為，Rac1通過(guò)使其靶蛋白Scar/ Wave活化，隨后激活A(yù)rp2/3復(fù)合體，使得肌動(dòng)蛋白微絲不斷發(fā)出分支，刺激肌動(dòng)蛋白單體的成核作用，使新的肌動(dòng)蛋白聚合從而驅(qū)使細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)[12]。此外Rac1通過(guò)作用于其下游分子PAK1使Limk1的第508位蘇氨酸磷酸化[13-14]，活化后的Limk1使Confilin的第3位絲氨酸磷酸化，從而抑制Confilin與絲狀肌動(dòng)蛋白的結(jié)合而對(duì)絲狀肌動(dòng)蛋白的解聚作用，從而維持了肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定，使細(xì)胞發(fā)生遷移[15]。許多研究表明，RhoA蛋白活性受其上游分子FAK的負(fù)性調(diào)節(jié)[16-17]。Yuan等[8]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)，Grp78高表達(dá)通過(guò)使FAK發(fā)生磷酸化從而抑制RhoA蛋白活性。我們的研究結(jié)果顯示，Grp78特異性上調(diào)后使舌癌細(xì)胞Tca-8113的Rac1活性升高，RhoA活性降低，用siRNAGrp78下調(diào)Tca-8113/Grp78細(xì)胞中Grp78的表達(dá)后Rac1活性降低，但RhoA活性升高(圖7)。這表明Grp78促進(jìn)舌癌細(xì)胞的侵襲是通過(guò)增加Rac1活性和降低RhoA活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。

降解細(xì)胞外基質(zhì)破壞基底膜的完整性是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件。基質(zhì)金屬蛋白酶是一類Zn2+離子依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶類，此類蛋白通過(guò)水解酶通過(guò)降解基底膜的膠原、層黏連蛋白使得癌細(xì)胞能夠侵襲周圍組織以至于穿過(guò)血管或淋巴發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[18-19]。為了證實(shí)在舌癌中Grp78高表達(dá)會(huì)引起MMPs表達(dá)水平的改變，我們分別檢測(cè)了MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)在舌癌中Grp78特異性高表達(dá)會(huì)引MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平升高，用siRNA-Grp78下調(diào)Grp78的表達(dá)后MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平降低(圖5)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，Grp78對(duì)舌癌Tca-8113細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用，并且初步明確了這種調(diào)節(jié)作用與Rac1和RhoA活性及MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。抑制Grp78的表達(dá)可能是抑制舌癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)有效的分子靶點(diǎn)。

1 Preis M， Hadar T， Soudry E， et al. Early tongue carcinoma：Analysis of failure［J］. Head Neck， 2012， 34（3）： 418-421.

2 Fu R， Yang P， Wu HL， et al. GRP78 secreted by colon cancer cells facilitates cell proliferation via PI3K/Akt signaling［J］. Asian Pac J Cancer Prev， 2014， 15（17）： 7245-7249.

3 Chang YJ， Huang CY， Hung CS， et al. GRP78 mediates the therapeutic efficacy of curcumin on colon cancer［J/OL］. http：// link.springer.com/article/10.1007%2Fs13277-014-2640-3.

4 Raiter A， Yerushalmi R， Hardy B. Pharmacological induction of cell surface GRP78 contributes to apoptosis in triple negative breast cancer cells［J/OL］. http：//www.impactjournals.com/oncotarget/index.php ?journal=oncotarget&page=article&op=view&path［］=2576.

5 Yang L， Yang SY， Ji JM， et al. GRP78 expression in gastric cancer and its clinical significance［J］. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2013， 35（11）：837-842.

6 Wu JY， Cheng CC， Wang JY， et al. Discovery of tumor markers for gastric cancer by proteomics［J］. PLoS One， 2014， 9（1）：e84158.

7 Zheng YZ， Cao ZG， Hu X， et al. The endoplasmic reticulum stress markers GRP78 and CHOP predict disease-free survival and responsiveness to chemotherapy in breast cancer［J］. Breast Cancer Res Treat， 2014， 145（2）： 349-358.

8 Yuan XP， Dong M， Li X， et al. GRP78 promotes the invasion of pancreatic cancer cells by FAK and JNK［J］. Mol Cell Biochem，2015， 398（1-2）：55-62.

9 Su R， Li Z， Li H， et al. Grp78 promotes the invasion of hepatocellular carcinoma［J］. BMC Cancer， 2010， 10：20.

10 Price LS， Collard JG. Regulation of the cytoskeleton by Rho-family GTPases： implications for tumour cell invasion［J］. Semin Cancer Biol， 2001， 11（2）：167-173.

11 Bourne HR， Sanders DA， McCormick F. The GTPase superfamily： a conserved switch for diverse cell functions［J］. Nature， 1990， 348（6297）：125-132.

12 Nakagawa H， Miki H， Ito M， et al. N-WASP， WAVE and Mena play different roles in the organization of actin cytoskeleton in lamellipodia［J］. J Cell Sci， 2001， 114（Pt 8）：1555-1565.

13 Edwards DC， Sanders LC， Bokoch GM， et al. Activation of LIM-kinase by Pak1 couples Rac/Cdc42 GTPase signalling to actin cytoskeletal dynamics［J］. Nat Cell Biol， 1999， 1（5）：253-259.

14 Delorme V， Machacek M， DerMardirossian C， et al. Cofilin activity downstream of Pak1 regulates cell protrusion efficiency by organizing lamellipodium and lamella actin networks［J］. Dev Cell， 2007， 13（5）：646-662.

15 Yang N， Higuchi O， Ohashi K， et al. Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization［J］. Nature， 1998， 393（6687）： 809-812.

16 Khyrul WA， Lalonde DP， Brown MC， et al. The integrin-linked kinase regulates cell morphology and motility in a Rho-associated kinase-dependent manner［J］. J Biol Chem， 2004， 279（52）：54131-54139.

17 Wei L， Zhou W， Wang L， et al. beta（1）-integrin and PI 3-kinase regulate RhoA-dependent activation of skeletal alpha-actin promoter in myoblasts［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2000， 278（6）：H1736-H1743.

18 Gialeli C， Theocharis AD， Karamanos NK. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting［J］. FEBS J， 2011， 278（1）： 16-27.

19 Zhen L， Fan D， Yi X， et al. Curcumin inhibits oral squamous cell carcinoma proliferation and invasion via EGFR signaling pathways ［J］. Int J Clin Exp Pathol， 2014， 7（10）： 6438-6446.

Effect and mechanism of Grp78 on invasion of tongue cancer cell

SONG Jia1, SONG Huijuan2, LI Dan2, LIU Tingting2, YE Liping11

Department of Physiology and Pathology Research Laboratory;2Science Laboratory Center Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

YE Liping. Email: ye960519@126.com

ObjectiveTo explore the role of Grp78 in invasion of human tongue cancer and its molecular mechanisms.MethodspcDNA3.1 (+) - Grp78 recombinant plasmid was used to transfect tongue cancer cell line Tca-8113 to get the cells that stably expressed Grp78 (78C6) and then siRNA - Grp78 was used to transfect 78C6 in order to knockout Grp78 expression. Transwell experiment was used to analyze the ability of invasion, and immunofluorescence and cell stretching experiments were used to detect cell cytoskeleton arrangement and stretch. The GST - pulldown technology was used to analyze the activity of Rac1 and RhoA. The expression of MMP - 9, MMP - 2, Rac1 and RhoA were detected by western blot.ResultsTranswell experiment results showed that overexpression of Grp78 promoted invasion of tongue cancer cells significantly when compared with the control group and this phenomenon could be inhibited by siRNA - Grp78 (P＜0.05). Furthermore, compared with the control group the overexpression of Grp78 also promoted the spread and polarity formation of tongue cancer cells Tca-8113 (P＜0.05). Cytoskeleton staining results showed that overexpression of Grp78 caused cytoskeleton microfilament to be mainly distributed in cell edge, however this effect could be suppressed by siRNA - Grp78 transfection which leaded to stress fibers appeared in cortical areas. GST - pull down results showed that the activity of Rac1 was higher and RhoA was lower in Tca-8113/Grp78 cells than the control group, while after transfection of siRNA - Grp78 in Tca-8113/Grp78 cells, the activity of Rac1 was lower and RhoA was higher than the control group (P＜0.05). Western blot analysis showed that compared with the control group, the expression of MMP - 2 and MMP - 9 increased in Tca-8113/Grp78 cells while the expression of MMP - 2 and MMP - 9 decreased in siRNA - Grp78 (P＜0.05), but the expression of RhoA and Rac1 had no difference in Tca-8113/Grp78 and siRNA - Grp78 cells (P＜0.05).ConclusionGrp78 promotes invasion of tongue cancer cells Tca-8113 by increasing activation of Rac1 and decreasing activation of RhoA as well as by raising the expression of MMP - 2 and MMP - 9.

glucose regulated protein 78; Tca-8113; invasion

Q291，R735.7

A

2095-5227(2015)04-0374-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.020

時(shí)間：2015-01-14 17:46

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150114.1746.004.html

2014-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172048)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81172048)

宋佳，女，在讀碩士。研究分向：腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。Email: jiajia4115@126.com

葉麗平，女，博士，副主任，碩士生導(dǎo)師。Email: ye960519@126.com