王會(huì)芳，蘇顯都，于彩霞，王家坡，王國增，王麗麗，張 碩，李麗霞，李 健

1河北省涿州市醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北涿州 072750；2海南省農(nóng)墾那大醫(yī)院 檢驗(yàn)科，海南那大 571700；3解放軍總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100853

125例成人急性髓系白血病免疫表型特點(diǎn)分析

王會(huì)芳1，蘇顯都2，于彩霞1，王家坡1，王國增1，王麗麗1，張 碩1，李麗霞1，李 健3

1河北省涿州市醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北涿州 072750；2海南省農(nóng)墾那大醫(yī)院 檢驗(yàn)科，海南那大 571700；3解放軍總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100853

目的探討成人急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)患者的免疫表型特點(diǎn)及臨床意義。方法2011年5月- 2014年6月在河北省涿州市醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院就診的125例成人AML患者為研究對(duì)象，采用多色流式細(xì)胞術(shù)，以CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門，對(duì)其骨髓進(jìn)行免疫表型檢測(cè)。結(jié)果AML患者髓系特異性抗原表達(dá)陽性率依次為CD13(90.4%)、CD33(86.4%)、MPO(80.0%)、CD117(73.6%)；CD14和CD15主要在M4和M5中表達(dá)，CD64和CD15同時(shí)強(qiáng)陽性伴HLA-DR高表達(dá)，提示M5可能性大；在M3患者中有較強(qiáng)的自發(fā)熒光，表達(dá)髓系抗原CD13、CD33和MPO，低表達(dá)CD34和HLA-DR。造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記抗原CD34、HLA-DR、CD38在AML中呈高表達(dá)，分別為53.6%、70.4%、71.2%。125例中56例伴有淋系抗原表達(dá)，各抗原表達(dá)率依次為CD56(25.6%)、CD7(19.2%)、CD19(9.6%)、CD4(7.2%)、CD2(6.4%)。有淋系抗原表達(dá)(LymAg+)組表達(dá)CD34+比例和肝脾大患者比例明顯高于無淋系抗原表達(dá)(LymAg-)組(P＜0.01)。伴有CD7+患者完全緩解(CR)率明顯低于CD7-患者(P＜0.05)，而伴有淋系抗原表達(dá)的AML患者CR率(55.6%)與未伴有淋系抗原表達(dá)的AML患者CR率(76.2%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論AML患者高表達(dá)CD13、CD33、MPO，部分患者同時(shí)表達(dá)髓系、淋系抗原；伴有CD7+表達(dá)的患者，化療后CR率低，預(yù)后較差。

急性髓系白血??；流式細(xì)胞術(shù)；免疫表型

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系統(tǒng)惡性疾病，骨髓被髓系白血病細(xì)胞代替，失去分化成熟潛力。AML的法美英(FAB)分型存在著個(gè)人主觀因素、細(xì)胞形態(tài)的多樣性等局限性。隨著流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)的廣泛應(yīng)用，免疫學(xué)分型對(duì)白血病分型的診斷尤為重要[1-4]。它可以全面、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出白血病細(xì)胞抗原的分布情況，對(duì)白血病的診斷、治療及預(yù)后分析具有重要意義。本研究對(duì)125例初診成人急性髓系白血病患者應(yīng)用多色流式細(xì)胞術(shù)CD45/ SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門方法進(jìn)行免疫表型分析，探討各種類型AML表型分化抗原的表達(dá)特點(diǎn)及意義。

對(duì)象和方法

1研究對(duì)象 2011年5月- 2014年6月于河北省涿州市醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院就診的125例初診成人AML患者，骨髓經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色及各種組化染色，分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)檢測(cè)最終確診為AML。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照天津標(biāo)準(zhǔn)和FAB標(biāo)準(zhǔn)，其中男性67例，女性58例，中位年齡40.2(26 ～82)歲。按FAB分類M112例、M247例、M325例、M414例、M518例、M64例、M75例。125例均行骨髓穿刺(bone marrow aspiration，BMA)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2主要儀器和試劑 流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司的FACSCalibur。所用單克隆抗體包括多甲藻葉綠素蛋白標(biāo)記的CD45、異硫氰酸熒光素、別藻青蛋白或

藻紅蛋白標(biāo)記CD34、CD10、CD19、CD9、CD2、CD14、CD13、HLA-DR、CD33、CD7、CD3、CD38、CD117、CD64、CD56、CD15、CD20、髓過氧化物酶、CD22、CD4、CD41及同型對(duì)照IgG等，以上試劑均購自美國Becton Dickinson公司。

3方法 根據(jù)AML患者中各抗原表達(dá)情況分組，其中有淋系抗原表達(dá)(LymAg+)56例，無淋系抗原表達(dá)(LymAg-)69例；并分析抗原CD7+和CD7-組，LymAg+和LymAg-組，CD34+和CD34-組，CD56+和CD56-組，CD19+和CD19-組與AML患者完全緩解率的關(guān)系。采用四色直接免疫熒光法和骨髓涂片檢查，分析AML患者細(xì)胞形態(tài)及免疫表型特點(diǎn)。

4流式細(xì)胞分析 取肝素抗凝骨髓標(biāo)本3 ml，24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。將每個(gè)試管中加入肝素抗凝骨髓或外周血(1×106/ml)100μl及四色直接標(biāo)記熒光抗體，室溫避光孵育20 min，再向各試管中加入溶血素500μl，震蕩置室溫避光，10 min后用500μl PBS洗滌細(xì)胞1次，加入500μl PBS重懸細(xì)胞。測(cè)定前以標(biāo)準(zhǔn)校正熒光微球校正儀器，用流式細(xì)胞儀Cell Quest軟件獲取并分析50 000個(gè)細(xì)胞，對(duì)數(shù)取樣，CD45/SSC設(shè)門選中幼稚細(xì)胞群體，再對(duì)幼稚細(xì)胞群體進(jìn)行分析，檢測(cè)各種抗原的表達(dá)率。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：抗原CD3/MPO/CD34≥10%，其他抗原≥20%。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，正態(tài)分布資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1CD45/SSC設(shè)門的FCM檢測(cè)結(jié)果 125例成人AML患者免疫表型(圖1)證實(shí)白血病細(xì)胞比例為50.7% ～ 92.8%，與骨髓形態(tài)學(xué)(圖2)檢查結(jié)果(53.2% ～ 96.4%)基本一致，在允許誤差范圍內(nèi)(＜5%)。

圖 1 1例AML患者骨髓細(xì)胞 CD45/SSC 散點(diǎn)圖Fig. 1 Scatter plot of BM cells CD45 in a AML patient P1: group of blast cells; P2: lymphocytes; P3: monocytes; P4: neutrophils)

圖 2 AML患者骨髓細(xì)胞形態(tài)Fig. 2 BM cell morphology of AML patients

2AML患者的造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記抗原及髓系抗原表達(dá) 造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記抗原CD34、HLADR、CD38在AML中呈高表達(dá)，分別為53.6%、70.4%、71.2%；但M3中CD34、HLA-DR表達(dá)明顯低于其他亞型(P＜0.05)。在25例M3中CD9、CD13、CD33、CD117、CD64和MPO表達(dá)均明顯高于CD34和HLA-DR(P＜0.05)。125例中主要表達(dá)髓系抗原CD13、CD33、MPO和CD117，分別為90.4%、86.4%、80.0%和73.6%。CD14和CD15主要在M4和M5中表達(dá)；CD64主要在M5、M3、M4、M2中表達(dá)，分別為72.2%、68.0%、57.1%、46.8%；CD64和CD15同時(shí)陽性表達(dá)多見于M4和M5。CD41在7例M7中有5例表達(dá)，而在M1～ M6中未見表達(dá)。見表1。

3AML患者淋系抗原表達(dá) 125例中56例伴有淋系抗原表達(dá)，陽性率為44.8%；以CD56表達(dá)最高占25.6%，其次為CD7(19.2%)、CD19(9.6%)、CD4(7.2%)、CD2(6.4%)，CD3、CD20、CD22無表達(dá)。除M3和M7外，其他AML亞型中均可見CD7不同程度表達(dá)。CD56在AML各亞型中均有表達(dá)，多見于M1和M5。另外2個(gè)淋系相關(guān)抗原共表達(dá)也可見，CD7+和CD56+共表達(dá)者6例，CD19+和CD56+共表達(dá)者3例，CD7+和CD4+共表達(dá)者2例、CD56+和CD4+共表達(dá)者2例。見表2。

4AML患者LymAg+組和LymAg-組臨床特征比較

根據(jù)淋系抗原(LymAg)表達(dá)情況，將125例成人AML患者分為LymAg+組(56例)和LymAg-組(69例)。LymAg+組表達(dá)CD34+比例和肝脾大患者比例明顯高于LymAg-組(P＜0.01)；而兩組間平均年齡、性別、血紅蛋白水平、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、骨髓原始細(xì)胞百分比及抗原CD38+比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表3。

5免疫表型與預(yù)后的關(guān)系 125例中90例接受治療，有13例放棄治療。20例對(duì)癥支持治療延緩生命，2例臨床死亡(均為M3患者)。CD7+組CR率(38.1%)明顯低于CD7-組(84.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。盡管LymAg+、CD34+、CD56+、CD19+組CR率均低于其對(duì)應(yīng)的陰性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表1 AML患者造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記抗原及髓系抗原表達(dá)Tab. 1 Hematopoietic stem / progenitor cells labeled antigen and myeloid antigen expression in AML patients

表2 AML患者淋系抗原表達(dá)Tab. 2 Lymphoid antigen expression in AML patients

表3 LymAg+組和LymAg-組臨床特征比較Tab.3 Comparison of clinical features in LymAg+group and LymAg-group

表4 免疫表型與完全緩解率的關(guān)系Tab.4 Relationship between immunophenotype and complete remission

討 論

隨著單克隆抗體及流式細(xì)胞儀的應(yīng)用，免疫分型在急性白血病的診斷、治療和預(yù)后中具有重要的作用。根據(jù)FAB標(biāo)準(zhǔn)，以細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色為依據(jù)，其診斷準(zhǔn)確率僅為60% ～ 80%[5-7]，而免疫分型診斷準(zhǔn)確率可達(dá)90%左右。另外，免疫分型可以反映FAB分型無法顯示的一些生物學(xué)特性，如雙表型及急性淋巴細(xì)胞白血病的分期等，這些都與治療方案制訂和預(yù)后判斷有關(guān)。我們采用CD45/SSC設(shè)門法，來區(qū)別正常細(xì)胞和白血病細(xì)胞，并根據(jù)CD45表達(dá)的水平來鑒別白血病細(xì)胞的異質(zhì)性。

通過分析125例成人AML患者免疫表型結(jié)果顯示，主要表達(dá)髓系抗原CD13、CD33、MPO、CD117，其中最常見的抗原表達(dá)是CD13和CD33，因此CD13和CD33對(duì)判斷白血病細(xì)胞是否為髓系來源時(shí)具有很高的診斷價(jià)值。M3患者的免疫表型有一定特性，CD13、CD33、MPO高表達(dá)，CD34、HLA-DR很少表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-10]。另外，CD9在M3患者中呈高表達(dá)，陽性率為72.0%，以上分型特點(diǎn)在M3與其他亞型AML的鑒別診斷中具有很好提示作用。CD34是一個(gè)階段特異而非系特異的抗原，反映細(xì)胞的分化處于較早期階段。CD14作為單核細(xì)胞的特異標(biāo)記，敏感性較差，在M4和M5中常缺乏表達(dá)或弱表達(dá)。本研究中CD14在M4和M5的陽性率僅為28.6%、33.3%，這可能是由于CD14主要表達(dá)于成熟單核細(xì)胞、弱表達(dá)于幼單核細(xì)胞，而原始單核細(xì)胞表面很少表達(dá)，因此對(duì)其診斷應(yīng)結(jié)合其他單克隆抗體、細(xì)胞化學(xué)染色、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)綜合分析。M5主要表達(dá)CD64、CD15和HLA-DR，陽性率分別為72.2%、88.9%、94.4%，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[11]。這表明CD64和CD15同時(shí)強(qiáng)陽性伴HLA-DR高表達(dá)提示M5可能性大。CD117主要表達(dá)于正常的造血干細(xì)胞或髓系干祖細(xì)胞。有研究顯示，CD117在AML患者中的表達(dá)明顯高于ALL患者，其髓系特異性好于CD13、CD33[12]。本研究中73.6%的AML患者表達(dá)CD117，主要是M1(91.7%)、M2(85.1%)和M5(72.2%)，與國內(nèi)報(bào)道相似[13]。對(duì)于M3患者CD117的表達(dá)，目前尚存不同觀點(diǎn)，本研究中M3高表達(dá)CD117(80.0%)，與Zheng等[14]報(bào)道的結(jié)果基本一致。在7例M7患者中有5例表達(dá)CD41，陽性率為71.4%，但CD41除表達(dá)于巨核細(xì)胞外，也能跟血小板結(jié)合，另外，血小板極易和白血病細(xì)胞黏附，造成假陽性。因此M7免疫分型特征有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于AML患者淋系抗原表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)56例AML細(xì)胞表面有淋系抗原的表達(dá)，陽性率為44.8%，其中以CD56、CD7較常見。CD7抗原并非T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記抗原，多能干細(xì)胞、髓系干細(xì)胞與微分化型AML細(xì)胞等均可表達(dá)CD7抗原。本研究中，CD7的陽性率為19.2%，主要表達(dá)于M1，其次是M5、M4、M2，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15-16]。CD7+表達(dá)的AML患者CR率明顯低于CD7-表達(dá)的患者(P＜0.05)。這提示CD7+表達(dá)的AML患者預(yù)后較差。CD56主要在自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面上表達(dá)，是NK細(xì)胞特異性分化抗原，與細(xì)胞黏附有一定關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道15% ～ 35%的AML患者可表達(dá)CD56[17]，主要在M1、M2、M5中表達(dá)。本研究中CD56的陽性率為25.6%，在M5中表達(dá)最高，其次是M1和M2，多伴CD13、CD33、CD34和HLA-DR表達(dá)。這提示CD56+的AML是一種分化程度較差的白血病。盡管CD56+的AML患者CR率低于CD56-，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[18]，這可能與各研究的病例數(shù)或所使用的單克隆抗體來源不同有關(guān)。CD19是B系淋巴細(xì)胞的特異性分化抗原，但有研究發(fā)現(xiàn)在AML中也有異常表達(dá)。本研究中AML患者表達(dá)CD19的陽性率為9.6%，盡管CD19+的AML患者CR率低于CD19-，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外，LymAg+組表達(dá)CD34+比例和肝脾大患者比例明顯高于LymAg-組(P＜0.01)，而其他臨床特征在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。淋系分化抗原表達(dá)在AML患者中的預(yù)后意義存在不同觀點(diǎn)，這可能與方法學(xué)、研究的樣本量以及治療方案等的差異有關(guān)。

總之，F(xiàn)CM免疫分型可以分析白血病細(xì)胞的來源和所處的分化階段，提高急性白血病分型的準(zhǔn)確性，更好地指導(dǎo)治療及判定預(yù)后。

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Acute myeloid leukemia by flow cytometry immune phenotypic: A characteristics analysis of 125 cases

WANG Huifang1, SU Xiandu2, YU Caixia1, WANG Jiapo1, WANG Guozeng1, WANG Lili1, ZHANG Shuo1, LI Lixia1, LI Jian3

1Department of Clinical Laboratory, Zhuozhou City Hospital, Zhuozhou 072750, Hebei Province, China;2Department of Clinical Laboratory, Nongken Nada Hospital, Nada 571700, Hainan Province, China;3Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LI Jian. Email: hemthm@yahoo.com

ObjectiveTo investigate immune phenotypic characteristics of adult patients with acute myelogenous leukemia (AML) and its clinical significance.MethodsOne hundred and twenty-five adult patients with AML admitted to Zhuozhou City Hospital and Chinese PLA General Hospital from May 2011 to June 2014 were enrolled in this study. The immune phenotype in the 125 cases with AML were detected by multicolor flow cytometry with CD45 / SSC double parameters scatter plot setting as door.ResultsThe positive rate of myeloid specific antigen expression in AML patients were CD13 (90.4%), CD33 (86.4%), MPO (80.0%), CD117 (73.6%). CD14 and CD15 mainly expressed in M4and M5. CD64 and CD15 also showed strongly positive with high expression of HLA-DR which suggested high possibility of M5. A strong autofluorescence, myeloid antigens CD13, CD33 and low expression of CD34, MPO and HLA-DR were shown in M3patients. Hematopoietic stem/progenitor cell marker antigen CD34, HLA-DR and CD38 were highly expressed in AML with the rate of 53.6%, 70.4% and 71.2%. Of the 125 cases, 56 cases showed leaching antigen expression with the expression rate of CD56 (25.6%), CD7 (19.2%), CD19 (9.6%), CD4 (7.2%), CD2 (6.4%), respectively. The expression of CD34+ratio and the proportion of hepatosplenomegaly patients in LymAg+group were significantly higher than LymAg-group (P＜0.05). And the complete remission (CR) rate in patients with CD7+was significantly lower than CD7-patients (P＜0.05). However, there showed no significant difference in the CR rate of AML patients with lymphoid antigen expression and AML patients without lymphoid antigen expression (55.6% vs. 76.2%, P＞0.05).ConclusionAML patients show high expression of CD13, CD33, MPO, and part of AML patients also show expression of myeloid and lymphoid antigen. Patients with CD7+expression have low CR ratio with poor prognosis.

acute myeloid leukemia; flow cytometry; immunophenotype

R 733.3

A

2095-5227(2015)04-0363-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.017

時(shí)間：2015-02-10 10:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150210.1041.001.html

2014-11-24

保定市科技支撐項(xiàng)目(14ZF010)

Supported by the Key Technology R＆D Program of Hebei Province(14ZF010)

王會(huì)芳，女，主管檢驗(yàn)師，副主任。研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷。Email: fangzeyu2006@163.com

李健，男，博士，主任醫(yī)師，副主任。Email: hemthm@yahoo.com