趙洪慶, 賀香嫦， 林建忠， 周延彪， 許光明

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 湖南省教育廳中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410000)

反相HPLC法研究影響水稻維生素C含量的關(guān)鍵基因

趙洪慶1, 賀香嫦1， 林建忠2， 周延彪2， 許光明1

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 湖南省教育廳中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410000)

HPLC測(cè)定水稻葉中維生素 C (Vc)含量的測(cè)定方法，測(cè)定后比較轉(zhuǎn)基因水稻葉與普通水稻葉中Vc含量的差異，為尋找調(diào)控水稻中Vc含量的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。草酸水溶液提取水稻葉中的Vc后，反相HPLC方法測(cè)定含量，選用的色譜柱為Diamonsil C18柱(250×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為0.2%磷酸-甲醇，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm,柱溫30℃。測(cè)的線性范圍為 1～40 μg/mL(r=0.9992)，平均回收率為98.51%，轉(zhuǎn)基因水稻葉組含量為(0.356±0.009)和(0.444±0.008) mg/g，而普通組Vc含量為(0.554±0.013) mg/g，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0分析表明二者有顯著差異(P<0.01) 。此方法測(cè)水稻葉中Vc含量具有簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確的特點(diǎn)；類受體蛋白激酶439即為影響水稻中Vc含量的關(guān)鍵基因。

轉(zhuǎn)基因；水稻葉中的Vc；HPLC；類受體蛋白439

維生素C(Vc)是一種重要的植物衍生的抗氧化劑，并且是構(gòu)成膳食Vc的主要來源。Vc對(duì)動(dòng)植物的成長(zhǎng)、應(yīng)激反應(yīng)起著重要的作用[1]。 Wheeler等提出的L-半乳糖途徑被公認(rèn)為高等植物中合成ASA的主要途徑[2]。在擬南芥中，有9種酶被證明直接參與Vc的生物合成[ 3-8], 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，CSN5B(COP9信號(hào)亞基5B)能降解VTC1(Vc合成酶)，影響Vc的含量。而我們所研究的類受體蛋白激酶439，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證能與CSN5B相互作用，預(yù)測(cè)蛋白激酶439是CSN5B的上游基因，可通過調(diào)控CSN5B來影響水稻中Vc含量。類受體蛋白激酶(RLK)是一類定位在質(zhì)膜上，包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域的膜蛋白。因?yàn)檫@類蛋白激酶的分子結(jié)構(gòu)和功能類似動(dòng)物細(xì)胞中的受體蛋白激酶(RPK)[9-12]，并且絕大多數(shù)尚未鑒定出其配基，故稱為類受體蛋白激酶。CSN5B 在酵母和植物中能與VTC1的N末端相互作用，凝膠過濾譜表明VTC1-CSN5B也與COP9信號(hào)復(fù)合物有關(guān)，而這互動(dòng)通過26S蛋白酶體途徑促進(jìn)泛素依賴的VTC1降解。目前除了對(duì)水稻PMM和GME基因在分子和生化水平上的一些研究外，對(duì)其他參與Vc合成的基因報(bào)道較少[7-8,13-15]。

通過培育轉(zhuǎn)基因439、COP9過表達(dá)的水稻苗，采用高效液相色譜法對(duì)水稻葉進(jìn)行Vc含量測(cè)定，觀察轉(zhuǎn)基因水稻葉中Vc含量的變化情況,為尋找調(diào)控水稻葉片Vc含量的基因提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1200，安捷倫儀器公司)；5417R高速冷凍離心機(jī)(Eppendor)；液氮(湖南大學(xué)提供)；Vc標(biāo)準(zhǔn)品(購自湖南省藥檢所)；甲醇(HPLC純，購自長(zhǎng)沙天恒試劑公司，下同)，磷酸，草酸，三乙胺，以上試劑除說明的外均為分析純。二次蒸餾水(自制)，轉(zhuǎn)基因水稻葉和正常水稻葉(湖南大學(xué)生物學(xué)院培育)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(5 μm ，250 ×4.6 mm)；流動(dòng)相：A相為0.2%磷酸溶液(用三乙胺回調(diào)pH值至4.0)，B相為甲醇，梯度洗脫程序?yàn)椋?、7、15、30 min時(shí)對(duì)應(yīng)的B%分別為5、5、25、85，總流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

精稱取Vc對(duì)照品0.4 g,至于100 mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.4000 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別取0.400 mg/mL的Vc對(duì)照品溶液0.25、1.25、2.50、2.75、6.25和10.00 mL于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得1.00、5.00、10.00、15.00、25.00和40.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，待用。

1.4 樣品溶液的配制

按農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法培育一定時(shí)間后，準(zhǔn)確稱取0.2 g轉(zhuǎn)基因439、COP9過表達(dá)水稻和正常水稻新鮮葉片，液氮下研磨成粉末，然后加5 mL 0.1%的草酸混勻，冰浴5 min，12000 r/min離心10 min。吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾，稀釋至標(biāo)準(zhǔn)液的線性濃度范圍，進(jìn)樣測(cè)試，測(cè)試的色譜圖如圖1，Vc的色譜峰保留時(shí)間為4.17 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 試液制備及儲(chǔ)存

由于Vc在空氣中極易被氧化，尤其是在堿性條件下更快，而在酸性介質(zhì)中，它受空氣氧化的速度稍慢。因而用0.1%的草酸來配制Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液。實(shí)驗(yàn)過程中，24 h內(nèi)的測(cè)試結(jié)果較為穩(wěn)定，但溶液經(jīng)過36 h后，氧化現(xiàn)象明顯，72 h后測(cè)試時(shí)有近一半的Vc被氧化了。在提取過程中，0.1%草酸液進(jìn)行提取還考慮了抑制抗壞血酸氧化酶的原因。

圖1 HPLC檢測(cè)Vc色譜圖結(jié)果

2.2 色譜條件的選擇

參照文獻(xiàn)[16-17]，根據(jù)Vc的紫外吸收情況，選擇245 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)?？紤]到測(cè)試需要，Vc出峰時(shí)間是在前段，為了節(jié)省試劑及分析時(shí)間，后端出的組分的分離加以忽略了，因而選擇了如1.2的梯度洗脫條件，較好地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)峰的分離檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)中，由于Vc在水溶液中的離解作用，導(dǎo)致色譜峰會(huì)由于固定相吸附作用而拖尾，流動(dòng)相中加入一定的酸會(huì)起到抑制離解作用，且能保護(hù)Vc避免被氧化。經(jīng)試驗(yàn)，最終流動(dòng)相確定為0.2%磷酸溶液-甲醇體系。為了防止磷酸導(dǎo)致流動(dòng)相的酸度過大而影響色譜柱，用三乙胺回調(diào)酸度至pH值為4.0左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明測(cè)試中色譜峰拖尾現(xiàn)象得到了較好的控制。

2.3 精密度試驗(yàn)

取同一濃度對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，測(cè)得峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.96%，表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品液分別于0、2、4、6和8 h進(jìn)樣20 μL,峰面積基本不變，RSD為2.09%，表明樣品液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的樣品液，按樣品液制備項(xiàng)下操作，平行制備5份，測(cè)得含量，計(jì)算RSD為2.11%，說明該樣品成分測(cè)定的重復(fù)性良好。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

將1.4制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，得測(cè)試V c的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。線性回歸方程為：Y=57.40X-46.75(r=0.9992),表明在測(cè)試過程中Vc在1～40μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取6份同樣的樣品，按樣品處理方法平行處理，按等濃度加標(biāo)方法，每份等量加入Vc標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)試回收率情況，試驗(yàn)結(jié)果如表1，得平均回收率為98.51%，RSD為1.91%。測(cè)試的準(zhǔn)確性達(dá)到要求。

表1 樣品加標(biāo)回收率測(cè)量結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定

取5批次的2組不同轉(zhuǎn)基因水稻葉樣品與普通水稻葉樣品，每批次測(cè)來自不同植株的葉片6片的含量，按樣品處理方法處理，取平均值得每批葉片中Vc含量。5個(gè)批次的測(cè)量結(jié)果如表2。用SPSS19.統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻葉樣品與普通水稻葉中的Vc含量有明顯差別(P<0.01)

表2 不同批次的轉(zhuǎn)基因和普通水稻葉中Vc含量比較

*—與普通水稻組比較 (P<0.01)。

3 結(jié)論

建立的高效液相方法分析水稻中的Vc含量，該方法能對(duì)主要組分進(jìn)行完全分離，對(duì)非定量組分快速洗脫，從而節(jié)省了分析時(shí)間和流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)中，為防止Vc的離解作用導(dǎo)致色譜峰拖尾而影響定量的精密度和準(zhǔn)確性，流動(dòng)相中加入0.2%磷酸溶液。同時(shí)為防止磷酸酸度過大而影響色譜柱，用三乙胺回調(diào)酸度至pH值4.0左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明測(cè)試中色譜峰拖尾現(xiàn)象得到了控制，該定量方法的線性范圍寬，回收率、精密度和重復(fù)性均較高，適合于水稻葉等的Vc含量分測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)表明，普通水稻葉組(對(duì)照組)Vc含量最高，COP9過表達(dá)組次之，439過表達(dá)組最低。由于COP9能夠降解Vc合成酶(VTC1)，所以COP9過表達(dá)組比對(duì)照組中Vc含量要低，又由于439能夠激活COP9，使COP9降解活性增高，所以使Vc含量進(jìn)一步降低。本文通過對(duì)水稻Vc含量的研究，找到了調(diào)控水稻葉片Vc含量的關(guān)鍵基因，為水稻Vc的合成與降解提供了理論研究依據(jù)，更好地為水稻的分子育種提供了廣闊的前景。

[1]Conklin P L, Williams E H, Last R L. Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficientArabidopsismutant[J]. Proc Acad Sci, 1996, 93(18): 9970-9974.

[2]Wheeler G L, Jones M A, Smirnoff N. The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[J]．Nature, 1998, 393(5): 365-369.

[3]Tahata K, Oba K, Suzuki K. et al．Generation and properties of ascorbic acid deficient transgenic tobacco cells expressing antisense RNA for L-galactono-1,4-lactone-dehydrogenase[J]. Plant J, 2001, 27(2):139-148.

[4]Wolucka B A, Persiau G, Doorsaelaere J V, et a1．Partial purification and identification of GDP-mannose 3", 5"-epimeraac ofArabidopsisthaliana，a key enzyme of the plant vitanmin C pathway[J]．Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(26):14843-14848.

[5]Gatzek S, Wheeler G L, Smirnoff N．Antisense suppression of L-galactose dehydrogenase inArabidopsisthalianaprovides evidence for its role in ascorbate synthesis and reveals light modulated L-galactose synthesis [J].Plant J, 2002, 30(4): 541-553.

[6]Linster C L, Clarke S G. L-ascorbatc biosynthesis in higher plants：the role of VTC2 [J]. Trends Plant Sci, 2008,13(11):567-573.

[7]Qian W, Yu C, Qin H, et al. Molecular and functional analysis of phosphomannomutase(PMM) from higher plants and genetic evidence for the involvement of PMM in ascorbic acid biosynthesis inArabidopsisandNicotianabenthamiana[J]. Plant J, 2007, 49(3): 399-413.

[8]Maruta T, Yonemitsu M, Yahuta Y, et a1. Arabidopxis phosphomannose isomerasel. but not phosphomannose isomerase 2, is essential for ascorbic acid biosynthesis[J]. J Biol Chem, 2008, 283(43): 28842-28851.

[9]Wang J, Yu Y W, Zhang Z J.ArabidopsisCSN5B interacts with VTC1 and modulates ascorbic acid synthesis[J]. The Plant Cell, 2013, 25(2): 625-636.

[10]Hanks H K, Ouinn A M, Hunter T. The protein kinase family: conserved feature and deduced phylogeny of the catalytic domains[J]. Science, 1988, 241(4861) :42-52.

[11]Yarden Y, Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases[J]. Annu Rev Biochem, 1988, 57: 443-478.

[12]Ullrich A, Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity[J]. Cell, 1990, 61(2): 203-212.

[13]Fransson L A, Mani K. Novel aspects of vitamin C：how important is glypican 1 recycling[J]. Trends Mol Med, 2007, 13(4): 143-149.

[14]Watanabe K, Suzuki K, Kitamura S. Characterization ot a GDP-D-mannose 3"，5"-epimerase from rice [J]. Phytochemistry, 2006, 67(4): 338-346.

[15]張桂云，徐 根，于恒秀等. 水稻維生素C合成相關(guān)基因的表達(dá)分析[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2011,32(1):15-19.

[16]迪麗努爾.馬里克，沙拉買提，曼蘇爾.高效液相色譜法測(cè)定野薔薇果中Vc含量的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008,29(7):87-89.

[17]黃桂穎，陳悅嬌，白衛(wèi)東.RP-HPLC測(cè)定夏橙中Vc含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36(6):2197-2198.

Study on regulation of the key genes on Vitamin C content in the rice by HPLC

ZHAO Hong-qing1， HE Xiang-chang1， LING Jian-zhong2,ZHOU Yan-biao2, XU Guang-ming1

(1. Key Laboratory of Modernization Education, College of Pharmaceutical Science, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208; 2. Biology School， Hunan University , Changsha 410000, China)

The difference of Vc content in leaves was compared between transgenic rice and ordinary rice to find the key genes which regulate the Vc content. Leaf Vc in the rice leaves was extracted with oxalic acid solution. The determination was performed with RP-HPLC on Diamonsil C18 column(250×4.6 mm,5 μm) under the condition of gradient elution with 0.2% phosphoric acid-methanol as mobile phase, detection wavelength of 245 nm and column temperature at 30℃. The detection linear range was 1-40 μg/mL(r=0.9992) and average recovery was 98.51%. The statistic analysis with SPSS19.0 soft showed significant differences(P<0.01) of Vc content between transgenic rice leaf group, (0.356±0.009) and (0.444±0.008) mg/g, and the normal group, (0.554±0.013) mg/g. Result showed that this method was simple, rapid and accurate for determination of Vc in rice leaf. The result indicated that receptor protein 439 was the key gene for regulation on Vc content in the rice.

transgenic；Vc in rice leaves；HPLC；receptor protein 439

2014-07-15；

2014-08-19

湖南省教育廳科研項(xiàng)目(11C0943，11C0952)資助；湖南省中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

許光明，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镝t(yī)藥分，E-mail：1052262329@qq.com。

S511

A

2095-1736(2015)01-0052-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.052