程媛媛,顧若波,王小林,聶志娟,徐鋼春,陸建明,黃鶴忠*
(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,蘇州大學(xué)水產(chǎn)研究所,江蘇蘇州215123;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫214081;
3.江蘇省太湖漁業(yè)管理委員會(huì),江蘇蘇州215004)
萼花臂尾輪蟲(chóng)(Brachionus calyciflorus)是淡水中常見(jiàn)的一種輪蟲(chóng),由于其在漁業(yè)生產(chǎn)上具有易于高密度培養(yǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)、種群增長(zhǎng)迅速、適口性好、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn),因此被廣泛用于魚(yú)、蝦等水產(chǎn)動(dòng)物的開(kāi)口餌料[1],而且輪蟲(chóng)這一活餌料的培養(yǎng)好壞常常是導(dǎo)致水產(chǎn)苗種生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵因素。另外,由于輪蟲(chóng)在水體中分布廣泛,體型微小,對(duì)環(huán)境污染物的敏感性較高,因而也可較好地將其作為水域生態(tài)和環(huán)境檢測(cè)的重要指示生物[2-3]。通常情況下,富營(yíng)養(yǎng)化水體的氨氮含量較高,尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘和輪蟲(chóng)專門(mén)培育池中,由于生產(chǎn)上常采用施肥培養(yǎng)單胞藻或直接潑灑豆?jié){等方法培養(yǎng)輪蟲(chóng)以及水生動(dòng)物的排泄物、糞便及殘餌等有機(jī)物的不斷分解,導(dǎo)致水體的氨氮大量積累,這可能是影響其生長(zhǎng)、繁殖等種群增長(zhǎng)的重要制約因素之一。國(guó)內(nèi)有關(guān)氨氮對(duì)輪蟲(chóng)影響的研究報(bào)道較少,僅見(jiàn)到關(guān)于pH與氨的交互作用對(duì)壺狀臂尾輪蟲(chóng)(Brachionus urceolaris)種群增長(zhǎng)、繁殖及存活影響[4]的報(bào)道和氨離子對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)[5]的報(bào)道。但是,有關(guān)氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的毒性及其抗氧化生理響應(yīng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者研究了水體氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的毒性,并從抗氧化生理響應(yīng)的角度探討氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的毒理機(jī)制,以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中輪蟲(chóng)餌料生物的大量培養(yǎng)時(shí)的環(huán)境調(diào)控以及輪蟲(chóng)作為水域富營(yíng)養(yǎng)化監(jiān)測(cè)的指示生物提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1.1 材料來(lái)源及培養(yǎng) 試驗(yàn)用萼花臂尾輪蟲(chóng)采集于太湖水體,在解剖鏡下觀察載玻片上的輪蟲(chóng)種類,經(jīng)確認(rèn)后再用微吸管吸入500 ml三角錐形瓶中,采用“單克隆”方法進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)[6]。輪蟲(chóng)的培養(yǎng)條件為:水溫(25±l)℃、光照強(qiáng)度90 μmol/(m2·s)、光照周期 L∶D=12∶12、pH 7.0 ~8.0,培養(yǎng)過(guò)程中投喂橢圓小球藻,密度為2×106個(gè)/ml,每天觀察輪蟲(chóng)生長(zhǎng)情況。
1.2.1 氨氮濃度對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)氨氮對(duì)輪蟲(chóng)急性毒性的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)定6個(gè)氨氮質(zhì)量濃度(NH3-N)組為:1.5、2.5、10.0、15.0、20.0、25.0 和 30.0 mg/L,用 NH4Cl(分析純)配制,另設(shè)置1個(gè)對(duì)照組(未添加氨氮),每個(gè)組設(shè)置4個(gè)平行重復(fù)。用吸管隨機(jī)吸取預(yù)培養(yǎng)三角錐形瓶中不帶卵、個(gè)體較大、游動(dòng)活躍的萼花臂尾輪蟲(chóng),置于含不同氨氮濃度梯度的微孔培養(yǎng)板中,每孔含10個(gè)輪蟲(chóng)個(gè)體和10 ml試驗(yàn)溶液,蓋上蓋子以防止水分蒸發(fā)。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),pH(7.5 ±0.2),投喂橢圓小球藻密度為 4 ×106個(gè)/ml,溫度和光照條件同預(yù)培養(yǎng)。在試驗(yàn)開(kāi)始后6、24、48、96 h,用解剖鏡觀察輪蟲(chóng)的存活情況,及時(shí)挑出并記錄個(gè)體死亡數(shù),輪蟲(chóng)死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為其頭冠纖毛停止擺動(dòng)且各器官組織停止活動(dòng)[7]。試驗(yàn)重復(fù)3 次。
采用作圖計(jì)算法[8]分別求出不同時(shí)間段的半致死濃度24 h LC50、48 h LC50、96 h LC50及其 95% 可信限,并計(jì)算出安全濃度(SC=0.1 ×24 h LC50)[9]。
1.2.2 輪蟲(chóng)對(duì)氨氮脅迫的抗氧化生理響應(yīng)試驗(yàn)。
1.2.2.1 輪蟲(chóng)在不同氨氮濃度條件下的抗氧化生理響應(yīng)。設(shè)定1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)試驗(yàn)組,氨氮質(zhì)量濃度分別為0、1.5、2.5、5.0、10.0 和20.0 mg/L,每組設(shè)置 3 個(gè)平行重復(fù)。試驗(yàn)在玻璃缸(38 cm×24 cm×24 cm)中進(jìn)行,每個(gè)玻璃缸里加入3 L含有相應(yīng)氨氮濃度和橢圓小球藻密度為2×106個(gè)/ml的輪蟲(chóng)培養(yǎng)液,用加熱棒控制水溫、用日光燈控制光照、用NaOH和HCl控制pH,環(huán)境條件同“1.2.1”。輪蟲(chóng)培養(yǎng)24 h后分別取樣,輪蟲(chóng)樣品用生理鹽水潤(rùn)洗、過(guò)濾,濾紙吸干水分。準(zhǔn)確稱量后,在冰冷的研缽中用質(zhì)量體積1∶9的勻漿介質(zhì)制成組織勻漿,4℃條件下5 000 r/min離心10 min,取上清液待用。采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定輪蟲(chóng)H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)的試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)中的方法測(cè)定輪蟲(chóng)H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。
1.2.2.2 輪蟲(chóng)在不同氨氮脅迫時(shí)間條件下的抗氧化生理響應(yīng)。氨氮質(zhì)量濃度設(shè)定為12.3 mg/L(24 h LC50),分別在試驗(yàn)開(kāi)始后0、3、12、24 h的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。試驗(yàn)條件、指標(biāo)測(cè)定和方法均與“1.2.2.1”相同。
1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。分別計(jì)算各平行重復(fù)試驗(yàn)組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤,試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan's單因子多重方差分析,分析氨氮處理組與對(duì)照組間的差異顯著性。其中,*表示組間差異顯著(P<0.05)。
2.1 氨氮濃度對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性 從表1可以看出,隨著氨氮濃度從0 mg/L逐漸增加到30 mg/L,萼花臂尾輪蟲(chóng)的死亡率總體上呈增加趨勢(shì),在脅迫6、12、24、48 h和96 h各時(shí)間段的萼花臂尾輪蟲(chóng)的死亡率與環(huán)境氨氮濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.959 2、0.923 5、0.965 3、0.956 4 和 0.958 5,均具有很好的線性關(guān)系。對(duì)表1的數(shù)據(jù)作直線回歸處理,得出24 h輪蟲(chóng)死亡率與氨氮濃度的回歸方程:y=50.915x-5.535(R2=0.965 3),從而計(jì)算出萼花臂尾輪蟲(chóng)的24 h半致死氨氮濃度(24 h LC50)值為 12.3 mg/L,95% 置信區(qū)間為 9.8 ~ 15.5 mg/L;同理得出48 h輪蟲(chóng)死亡率與氨氮濃度的回歸方程為:y=65.008x - 3.708 7(R2=0.903 1)和 48 h LC50為 6.7 mg/L,95%置信區(qū)間為5.6 ~8.0 mg/L;96 h 輪蟲(chóng)死亡率與氨氮濃度的回歸方程為 y=69.694x+18.891(R2=0.991 1)和96 h LC50為2.8 mg/L,95%置信區(qū)間為 2.3 ~3.3 mg/L。根據(jù)公式安全濃度(SC)=24 h LC50×0.1,計(jì)算出萼花臂尾輪蟲(chóng)對(duì)氨氮的安全濃度(SC)為1.23 mg/L。
表1 氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)死亡率的影響
2.2 不同濃度氨氮對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)H2O2含量的影響 在氨氮脅迫24 h后,萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2含量隨著氨氮濃度的升高呈逐漸增加的趨勢(shì)(圖1A)。當(dāng)氨氮濃度大于或等于2.5 mg/L時(shí),其H2O2含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在12.3 mg/L氨氮(24 h LC50)的脅迫環(huán)境中,萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)的H2O2含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加(圖1B)。在脅迫12h和24 h后,萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)H2O2含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
2.3 不同濃度氨氮對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的影響 在氨氮脅迫24 h后,萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性隨著氨氮濃度的升高呈逐漸減小的趨勢(shì)(圖2A)。當(dāng)氨氮濃度大于或等于1.5 mg/L時(shí),其SOD活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。這說(shuō)明氨氮對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性有較強(qiáng)的抑制作用。從圖2B可以看出,在12.3 mg/L(24 h LC50)的氨氮脅迫的環(huán)境中,萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小。在脅迫12 h和24 h后,其體內(nèi)SOD活均顯著高于對(duì)照組(P <0.05)。
2.4 不同濃度氨氮對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的影響 從圖3可以看出,隨著環(huán)境氨氮濃度的升高以及同一氨氮濃度(12.3 mg/L)下脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)的CAT活性呈現(xiàn)先增加再減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)氨氮濃度為1.5 mg/L和2.5 mg/L以及同一氨氮濃度處理3 h和12 h時(shí),CAT活性與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.050)。氨氮濃度大于或等于10 mg/L時(shí)CAT活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05);當(dāng)12.3 mg/L氨氮脅迫處理24 h時(shí),CAT活性均顯著低于對(duì)照組(P <0.05)。
圖1 氨氮脅迫濃度(A)和時(shí)間(B)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)H 2 O 2含量的影響
圖2 氨氮脅迫濃度(A)和時(shí)間(B)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的影響
圖3 氨氮脅迫濃度(A)和時(shí)間(B)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的影響
2.5 不同濃度氨氮對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)MDA含量的影響 從表4可以看出,隨著環(huán)境氨氮濃度的上升以及同一氨氮濃度(12.3 mg/L)下脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)的MDA含量呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢(shì)。當(dāng)氨氮濃度大于或等于2.5 mg/L以及同一氨氮濃度下脅迫12 h和24 h時(shí),其MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),表明其體內(nèi)的脂質(zhì)氧化程度顯著增加。
生物體均存在抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)清除內(nèi)源代謝或外源不良刺激而產(chǎn)生的過(guò)量活性氧自由基,其中一些酶類能夠被氧化應(yīng)激誘導(dǎo),如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)等對(duì)清除氧自由基起到關(guān)鍵作用。SOD可催化O2-生成H2O2,從而清除O2-,而H2O2由CAT催化生成水和氧氣。研究表明,氨氮脅迫初期生物機(jī)體受到刺激會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基,此時(shí)的抗氧化系統(tǒng)可生成更多的SOD和CAT等抗氧化酶對(duì)其做出響應(yīng),從而消除氧自由基。但是,隨著脅迫濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng),機(jī)體抗氧化系統(tǒng)已不足以達(dá)到清理大量氧自由基的能力,從而使氧自由基在體內(nèi)大量累積并影響SOD和CAT的進(jìn)一步合成,表現(xiàn)出抗氧化酶活性逐漸降低,并且過(guò)量的氧自由基發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),最終生成可間接反映組織和細(xì)胞造成損傷程度的氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)[10]。筆者通過(guò)測(cè)定萼花臂尾輪蟲(chóng)在不同氨氮濃度和時(shí)間脅迫條件下體內(nèi)H2O2含量和SOD、CAT活性以及MDA含量的變化,能在一定程度上反映其機(jī)體內(nèi)抗氧化生理響應(yīng)的過(guò)程和氧化損傷程度。該試驗(yàn)結(jié)果表明,在水溫(25±l)℃和pH(7.5±0.2)的環(huán)境條件下,氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50分別為12.3、6.7 和2.3 mg/L。然而,萼花臂尾輪蟲(chóng)對(duì)氨氮脅迫的抗氧化生理響應(yīng)更加敏感。當(dāng)氨氮濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)輪蟲(chóng)體內(nèi)24 h內(nèi)的SOD活性顯著下降(P<0.05);氨氮濃度升高至2.5 mg/L時(shí),輪蟲(chóng)體內(nèi)24 h內(nèi)H2O2和MDA含量均出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)。盡管氨氮2.5 mg/L濃度下24 h內(nèi)輪蟲(chóng)體內(nèi)清除H2O2的CAT活性尚未出現(xiàn)顯著下降(P>0.05),但可能由于GPX等其他抗氧化酶活性的降低和其他非酶類抗氧化物質(zhì)的下降,仍然導(dǎo)致了輪蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)氧化物和過(guò)氧化產(chǎn)物的積累,表明氨氮引起的過(guò)氧化反應(yīng)已對(duì)輪蟲(chóng)的生物膜造成了一定程度的破壞。這些引起輪蟲(chóng)抗氧化生理指標(biāo)出現(xiàn)顯著變化的氨氮濃度閾值均遠(yuǎn)低于24 h LC50值,表明氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的毒害作用可能是首先產(chǎn)生氧自由基并過(guò)量積累,進(jìn)而破壞其抗氧化防御體系,最終導(dǎo)致過(guò)氧化物積累和機(jī)體一定程度的傷害。但是,只有當(dāng)氨氮濃度繼續(xù)升高和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)才能引起機(jī)體傷害加劇甚至死亡。輪蟲(chóng)體內(nèi)的SOD酶較易被氨氮損傷,導(dǎo)致其活性下降,從而影響對(duì)體內(nèi)氧自由基的清除;輪蟲(chóng)在氨氮12.3 mg/L的脅迫條件下,其SOD活性、CAT活性分別在12 h和24 h出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)以及H2O2、MDA含量均在12 h出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)的試驗(yàn)結(jié)果也佐證了這一推論。采用SOD活性和H2O2、MDA含量的指標(biāo)檢測(cè)氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)急性毒性比24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50指標(biāo)更加靈敏。
圖4 氨氮脅迫濃度(A)和時(shí)間(B)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)MDA含量的影響
氨氮對(duì)水生生物毒害作用的機(jī)制較為復(fù)雜,有人認(rèn)為可能與氨氮對(duì)血液載氧能力的抑制有關(guān)[11];也有人認(rèn)為高濃度的氨氮會(huì)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)酶的催化作用和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性產(chǎn)生嚴(yán)重影響,進(jìn)而破壞排泄系統(tǒng)和滲透平衡[12]。該試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著氨氮濃度的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),導(dǎo)致活性氧的積累和抗氧化酶系統(tǒng)的破壞以及脂質(zhì)過(guò)氧化的加劇,這可能是氨氮對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)產(chǎn)生毒害作用的重要原因。這與氨氮對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[13]、福瑞鯉(Cyprinus carpio)[14]、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)[15]、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)[9]等其他生物機(jī)體的毒害機(jī)制相似,但其具體作用機(jī)理還需通過(guò)進(jìn)一步研究。
氨氮是富營(yíng)養(yǎng)化水體的重要污染因子之一,我國(guó)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的總氮含量大于1.2 mg/L(溫度20℃,pH 7~9)[16]。我國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)規(guī)定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類水質(zhì)的氨氮限值分別為0.153、0.53、1.03、1.53 和 2.03 mg/L。因此,從萼花臂尾輪蟲(chóng)24 h LC50得到的安全濃度為氨氮1.23 mg/L可以初步判定,Ⅳ類水質(zhì)的氨氮濃度仍然是萼花臂尾輪蟲(chóng)相對(duì)安全的生存環(huán)境條件。但是,由于輪蟲(chóng)體內(nèi)24 h內(nèi)H2O2和MDA含量也均在氨氮濃度2.5 mg/L時(shí)出現(xiàn)顯著升高,因而在氨氮濃度高于2.03 mg/L的劣Ⅴ類水質(zhì)環(huán)境條件下,會(huì)影響萼花臂尾輪蟲(chóng)的生存和生長(zhǎng)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖和輪蟲(chóng)培育系統(tǒng)中,氨氮更是主要的常見(jiàn)毒性物質(zhì)之一。在水產(chǎn)養(yǎng)殖和輪蟲(chóng)培育生產(chǎn)上為了培養(yǎng)浮游生物(輪蟲(chóng)的天然餌料),往往一次性大量施肥或一次性大量潑灑豆?jié){等輪蟲(chóng)飼料,如果再加上換水量小、淤泥過(guò)厚、水溫過(guò)高等不利因素,會(huì)導(dǎo)致水體氨氮的不斷積累,水體的氨氮濃度可從0.27 mg/L逐漸上升到31.90 mg/L[17]。水體高濃度的氨氮環(huán)境必然對(duì)輪蟲(chóng)的生理和生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生極為不利的影響,最終會(huì)出現(xiàn)大批死亡,這可能是導(dǎo)致輪蟲(chóng)培養(yǎng)最終失敗甚至泛池的原因之一。
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