程媛媛，顧若波，王小林，聶志娟，徐鋼春，陸建明，黃鶴忠*

(1.蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，蘇州大學水產研究所，江蘇蘇州215123;2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農業(yè)部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫214081;

3.江蘇省太湖漁業(yè)管理委員會，江蘇蘇州215004)

萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)是淡水中常見的一種輪蟲，由于其在漁業(yè)生產上具有易于高密度培養(yǎng)、適應性強、種群增長迅速、適口性好、營養(yǎng)豐富等特點，因此被廣泛用于魚、蝦等水產動物的開口餌料［1］，而且輪蟲這一活餌料的培養(yǎng)好壞常常是導致水產苗種生產成敗的關鍵因素。另外，由于輪蟲在水體中分布廣泛，體型微小，對環(huán)境污染物的敏感性較高，因而也可較好地將其作為水域生態(tài)和環(huán)境檢測的重要指示生物［2－3］。通常情況下，富營養(yǎng)化水體的氨氮含量較高，尤其在水產養(yǎng)殖池塘和輪蟲專門培育池中，由于生產上常采用施肥培養(yǎng)單胞藻或直接潑灑豆?jié){等方法培養(yǎng)輪蟲以及水生動物的排泄物、糞便及殘餌等有機物的不斷分解，導致水體的氨氮大量積累，這可能是影響其生長、繁殖等種群增長的重要制約因素之一。國內有關氨氮對輪蟲影響的研究報道較少，僅見到關于pH與氨的交互作用對壺狀臂尾輪蟲(Brachionus urceolaris)種群增長、繁殖及存活影響［4］的報道和氨離子對萼花臂尾輪蟲急性毒性試驗［5］的報道。但是，有關氨氮對萼花臂尾輪蟲的毒性及其抗氧化生理響應的研究尚未見報道。筆者研究了水體氨氮對萼花臂尾輪蟲的毒性，并從抗氧化生理響應的角度探討氨氮對萼花臂尾輪蟲的毒理機制，以期為水產養(yǎng)殖業(yè)中輪蟲餌料生物的大量培養(yǎng)時的環(huán)境調控以及輪蟲作為水域富營養(yǎng)化監(jiān)測的指示生物提供一定的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源及培養(yǎng) 試驗用萼花臂尾輪蟲采集于太湖水體，在解剖鏡下觀察載玻片上的輪蟲種類，經確認后再用微吸管吸入500 ml三角錐形瓶中，采用“單克隆”方法進行預培養(yǎng)［6］。輪蟲的培養(yǎng)條件為:水溫(25±l)℃、光照強度90 μmol/(m2·s)、光照周期 L∶D=12∶12、pH 7.0 ～8.0，培養(yǎng)過程中投喂橢圓小球藻，密度為2×106個/ml，每天觀察輪蟲生長情況。

1.2 方法

1.2.1 氨氮濃度對輪蟲的急性毒性試驗。根據(jù)氨氮對輪蟲急性毒性的預試驗結果，設定6個氨氮質量濃度(NH3-N)組為:1.5、2.5、10.0、15.0、20.0、25.0 和 30.0 mg/L，用 NH4Cl(分析純)配制，另設置1個對照組(未添加氨氮)，每個組設置4個平行重復。用吸管隨機吸取預培養(yǎng)三角錐形瓶中不帶卵、個體較大、游動活躍的萼花臂尾輪蟲，置于含不同氨氮濃度梯度的微孔培養(yǎng)板中，每孔含10個輪蟲個體和10 ml試驗溶液，蓋上蓋子以防止水分蒸發(fā)。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，pH(7.5 ±0.2)，投喂橢圓小球藻密度為 4 ×106個/ml，溫度和光照條件同預培養(yǎng)。在試驗開始后6、24、48、96 h，用解剖鏡觀察輪蟲的存活情況，及時挑出并記錄個體死亡數(shù)，輪蟲死亡判定標準為其頭冠纖毛停止擺動且各器官組織停止活動［7］。試驗重復3 次。

采用作圖計算法［8］分別求出不同時間段的半致死濃度24 h LC50、48 h LC50、96 h LC50及其 95% 可信限，并計算出安全濃度(SC=0.1 ×24 h LC50)［9］。

1.2.2 輪蟲對氨氮脅迫的抗氧化生理響應試驗。

1.2.2.1 輪蟲在不同氨氮濃度條件下的抗氧化生理響應。設定1個對照組和5個試驗組，氨氮質量濃度分別為0、1.5、2.5、5.0、10.0 和20.0 mg/L，每組設置 3 個平行重復。試驗在玻璃缸(38 cm×24 cm×24 cm)中進行，每個玻璃缸里加入3 L含有相應氨氮濃度和橢圓小球藻密度為2×106個/ml的輪蟲培養(yǎng)液，用加熱棒控制水溫、用日光燈控制光照、用NaOH和HCl控制pH，環(huán)境條件同“1.2.1”。輪蟲培養(yǎng)24 h后分別取樣，輪蟲樣品用生理鹽水潤洗、過濾，濾紙吸干水分。準確稱量后，在冰冷的研缽中用質量體積1∶9的勻漿介質制成組織勻漿，4℃條件下5 000 r/min離心10 min，取上清液待用。采用蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒，按照說明書測定輪蟲H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。采用蘇州科銘生物技術有限公司購買的試劑盒，按照說明書中的方法測定輪蟲H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。

1.2.2.2 輪蟲在不同氨氮脅迫時間條件下的抗氧化生理響應。氨氮質量濃度設定為12.3 mg/L(24 h LC50)，分別在試驗開始后0、3、12、24 h的4個時間點取樣。試驗條件、指標測定和方法均與“1.2.2.1”相同。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。分別計算各平行重復試驗組的平均值和標準誤，試驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行Duncan's單因子多重方差分析，分析氨氮處理組與對照組間的差異顯著性。其中，*表示組間差異顯著(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 氨氮濃度對輪蟲的急性毒性 從表1可以看出，隨著氨氮濃度從0 mg/L逐漸增加到30 mg/L，萼花臂尾輪蟲的死亡率總體上呈增加趨勢，在脅迫6、12、24、48 h和96 h各時間段的萼花臂尾輪蟲的死亡率與環(huán)境氨氮濃度的相關系數(shù)分別為0.959 2、0.923 5、0.965 3、0.956 4 和 0.958 5，均具有很好的線性關系。對表1的數(shù)據(jù)作直線回歸處理，得出24 h輪蟲死亡率與氨氮濃度的回歸方程:y=50.915x－5.535(R2=0.965 3)，從而計算出萼花臂尾輪蟲的24 h半致死氨氮濃度(24 h LC50)值為 12.3 mg/L，95% 置信區(qū)間為 9.8 ～ 15.5 mg/L;同理得出48 h輪蟲死亡率與氨氮濃度的回歸方程為:y=65.008x － 3.708 7(R2=0.903 1)和 48 h LC50為 6.7 mg/L，95%置信區(qū)間為5.6 ～8.0 mg/L;96 h 輪蟲死亡率與氨氮濃度的回歸方程為 y=69.694x+18.891(R2=0.991 1)和96 h LC50為2.8 mg/L，95%置信區(qū)間為 2.3 ～3.3 mg/L。根據(jù)公式安全濃度(SC)=24 h LC50×0.1，計算出萼花臂尾輪蟲對氨氮的安全濃度(SC)為1.23 mg/L。

表1 氨氮對萼花臂尾輪蟲死亡率的影響

2.2 不同濃度氨氮對輪蟲體內H2O2含量的影響 在氨氮脅迫24 h后，萼花臂尾輪蟲體內產生的H2O2含量隨著氨氮濃度的升高呈逐漸增加的趨勢(圖1A)。當氨氮濃度大于或等于2.5 mg/L時，其H2O2含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。在12.3 mg/L氨氮(24 h LC50)的脅迫環(huán)境中，萼花臂尾輪蟲體內的H2O2含量隨著脅迫時間的延長而逐漸增加(圖1B)。在脅迫12h和24 h后，萼花臂尾輪蟲體內H2O2含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 不同濃度氨氮對輪蟲體內SOD活性的影響 在氨氮脅迫24 h后，萼花臂尾輪蟲體內SOD活性隨著氨氮濃度的升高呈逐漸減小的趨勢(圖2A)。當氨氮濃度大于或等于1.5 mg/L時，其SOD活性均顯著低于對照組(P＜0.05)。這說明氨氮對輪蟲體內SOD活性有較強的抑制作用。從圖2B可以看出，在12.3 mg/L(24 h LC50)的氨氮脅迫的環(huán)境中，萼花臂尾輪蟲體內SOD活性隨著脅迫時間的延長而逐漸減小。在脅迫12 h和24 h后，其體內SOD活均顯著高于對照組(P ＜0.05)。

2.4 不同濃度氨氮對輪蟲體內CAT活性的影響 從圖3可以看出，隨著環(huán)境氨氮濃度的升高以及同一氨氮濃度(12.3 mg/L)下脅迫時間的延長，萼花臂尾輪蟲體內的CAT活性呈現(xiàn)先增加再減小的變化趨勢。當氨氮濃度為1.5 mg/L和2.5 mg/L以及同一氨氮濃度處理3 h和12 h時，CAT活性與對照組相比均無顯著差異(P＞0.050)。氨氮濃度大于或等于10 mg/L時CAT活性顯著低于對照組(P＜0.05);當12.3 mg/L氨氮脅迫處理24 h時，CAT活性均顯著低于對照組(P ＜0.05)。

圖1 氨氮脅迫濃度(A)和時間(B)對萼花臂尾輪蟲體內H 2 O 2含量的影響

圖2 氨氮脅迫濃度(A)和時間(B)對萼花臂尾輪蟲體內SOD活性的影響

圖3 氨氮脅迫濃度(A)和時間(B)對萼花臂尾輪蟲體內CAT活性的影響

2.5 不同濃度氨氮對輪蟲體內MDA含量的影響 從表4可以看出，隨著環(huán)境氨氮濃度的上升以及同一氨氮濃度(12.3 mg/L)下脅迫時間的延長，萼花臂尾輪蟲體內的MDA含量呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢。當氨氮濃度大于或等于2.5 mg/L以及同一氨氮濃度下脅迫12 h和24 h時，其MDA含量均顯著高于對照組(P＜0.05)，表明其體內的脂質氧化程度顯著增加。

3 討論與結論

生物體均存在抗氧化防御系統(tǒng)來清除內源代謝或外源不良刺激而產生的過量活性氧自由基，其中一些酶類能夠被氧化應激誘導，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等對清除氧自由基起到關鍵作用。SOD可催化O2－生成H2O2，從而清除O2－，而H2O2由CAT催化生成水和氧氣。研究表明，氨氮脅迫初期生物機體受到刺激會產生過量的氧自由基，此時的抗氧化系統(tǒng)可生成更多的SOD和CAT等抗氧化酶對其做出響應，從而消除氧自由基。但是，隨著脅迫濃度的升高以及作用時間的延長，機體抗氧化系統(tǒng)已不足以達到清理大量氧自由基的能力，從而使氧自由基在體內大量累積并影響SOD和CAT的進一步合成，表現(xiàn)出抗氧化酶活性逐漸降低，并且過量的氧自由基發(fā)生過氧化反應，最終生成可間接反映組織和細胞造成損傷程度的氧化產物丙二醛(MDA)［10］。筆者通過測定萼花臂尾輪蟲在不同氨氮濃度和時間脅迫條件下體內H2O2含量和SOD、CAT活性以及MDA含量的變化，能在一定程度上反映其機體內抗氧化生理響應的過程和氧化損傷程度。該試驗結果表明，在水溫(25±l)℃和pH(7.5±0.2)的環(huán)境條件下，氨氮對萼花臂尾輪蟲的24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50分別為12.3、6.7 和2.3 mg/L。然而，萼花臂尾輪蟲對氨氮脅迫的抗氧化生理響應更加敏感。當氨氮濃度達到1.5 mg/L時輪蟲體內24 h內的SOD活性顯著下降(P＜0.05);氨氮濃度升高至2.5 mg/L時，輪蟲體內24 h內H2O2和MDA含量均出現(xiàn)顯著升高(P＜0.05)。盡管氨氮2.5 mg/L濃度下24 h內輪蟲體內清除H2O2的CAT活性尚未出現(xiàn)顯著下降(P＞0.05)，但可能由于GPX等其他抗氧化酶活性的降低和其他非酶類抗氧化物質的下降，仍然導致了輪蟲體內過氧化物和過氧化產物的積累，表明氨氮引起的過氧化反應已對輪蟲的生物膜造成了一定程度的破壞。這些引起輪蟲抗氧化生理指標出現(xiàn)顯著變化的氨氮濃度閾值均遠低于24 h LC50值，表明氨氮對萼花臂尾輪蟲的毒害作用可能是首先產生氧自由基并過量積累，進而破壞其抗氧化防御體系，最終導致過氧化物積累和機體一定程度的傷害。但是，只有當氨氮濃度繼續(xù)升高和脅迫時間延長才能引起機體傷害加劇甚至死亡。輪蟲體內的SOD酶較易被氨氮損傷，導致其活性下降，從而影響對體內氧自由基的清除;輪蟲在氨氮12.3 mg/L的脅迫條件下，其SOD活性、CAT活性分別在12 h和24 h出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)以及H2O2、MDA含量均在12 h出現(xiàn)顯著升高(P＜0.05)的試驗結果也佐證了這一推論。采用SOD活性和H2O2、MDA含量的指標檢測氨氮對萼花臂尾輪蟲急性毒性比24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50指標更加靈敏。

圖4 氨氮脅迫濃度(A)和時間(B)對萼花臂尾輪蟲體內MDA含量的影響

氨氮對水生生物毒害作用的機制較為復雜，有人認為可能與氨氮對血液載氧能力的抑制有關［11］;也有人認為高濃度的氨氮會對動物體內酶的催化作用和細胞膜的穩(wěn)定性產生嚴重影響，進而破壞排泄系統(tǒng)和滲透平衡［12］。該試驗結果表明，隨著氨氮濃度的升高和脅迫時間的延長，導致活性氧的積累和抗氧化酶系統(tǒng)的破壞以及脂質過氧化的加劇，這可能是氨氮對萼花臂尾輪蟲產生毒害作用的重要原因。這與氨氮對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)［13］、福瑞鯉(Cyprinus carpio)［14］、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)［15］、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)［9］等其他生物機體的毒害機制相似，但其具體作用機理還需通過進一步研究。

氨氮是富營養(yǎng)化水體的重要污染因子之一，我國湖泊富營養(yǎng)化的評價標準中富營養(yǎng)化湖泊的總氮含量大于1.2 mg/L(溫度20℃，pH 7～9)［16］。我國地表水環(huán)境質量標準(GB3838-2002)規(guī)定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類水質的氨氮限值分別為0.153、0.53、1.03、1.53 和 2.03 mg/L。因此，從萼花臂尾輪蟲24 h LC50得到的安全濃度為氨氮1.23 mg/L可以初步判定，Ⅳ類水質的氨氮濃度仍然是萼花臂尾輪蟲相對安全的生存環(huán)境條件。但是，由于輪蟲體內24 h內H2O2和MDA含量也均在氨氮濃度2.5 mg/L時出現(xiàn)顯著升高，因而在氨氮濃度高于2.03 mg/L的劣Ⅴ類水質環(huán)境條件下，會影響萼花臂尾輪蟲的生存和生長。在水產養(yǎng)殖和輪蟲培育系統(tǒng)中，氨氮更是主要的常見毒性物質之一。在水產養(yǎng)殖和輪蟲培育生產上為了培養(yǎng)浮游生物(輪蟲的天然餌料)，往往一次性大量施肥或一次性大量潑灑豆?jié){等輪蟲飼料，如果再加上換水量小、淤泥過厚、水溫過高等不利因素，會導致水體氨氮的不斷積累，水體的氨氮濃度可從0.27 mg/L逐漸上升到31.90 mg/L［17］。水體高濃度的氨氮環(huán)境必然對輪蟲的生理和生長繁殖產生極為不利的影響，最終會出現(xiàn)大批死亡，這可能是導致輪蟲培養(yǎng)最終失敗甚至泛池的原因之一。

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