肖仕圓，許敬亮，袁 濤，趙 月，吳 浩，李謝昆，袁振宏

（1. 中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

富含碳水化合物微藻的篩選、鑒定及其在不同氮濃度條件下的產(chǎn)糖分析

肖仕圓1,2，許敬亮1?，袁 濤1,2，趙 月1,2，吳 浩1，李謝昆1,2，袁振宏1

（1. 中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

以實(shí)驗(yàn)室保存的4株藻株為研究對(duì)象，分析了它們的生長(zhǎng)速率和淀粉等糖類的含量，其中1株富含碳水化合物的微藻#3，其生長(zhǎng)速率和淀粉含量分別可達(dá)0.086 g/(L·d)和225.2 mg/L。18S rDNA聚類分析表明，其屬于柵藻科鏈帶藻屬Desmodesmus sp。缺N條件下，微藻生長(zhǎng)速率慢，總糖積累快；而在其他不同N濃度條件下，生長(zhǎng)速率趨勢(shì)一致，總糖積累速度不盡相同。

微藻；18S rDNA；總糖

0 引 言

當(dāng)前，能源、資源和環(huán)境問(wèn)題已經(jīng)成為制約人類社會(huì)和諧發(fā)展的桎梏，尋找開發(fā)清潔替代能源是解決這些問(wèn)題的有效途徑之一[1]。燃料乙醇作為清潔、可再生的能源，能有效減少汽車尾氣中的PM2.5和CO2排放，同時(shí)具有較高的辛烷值等優(yōu)點(diǎn)而備受人們青睞[2]。微藻[3-4]作為高效的光合微生物，能將太陽(yáng)能、H2O和CO2通過(guò)光合作用轉(zhuǎn)化為碳水化合物存儲(chǔ)在細(xì)胞內(nèi)。許多藻類細(xì)胞內(nèi)含有大量的淀粉和纖維素[5]，有些微藻淀粉含量可與玉米、小麥等相媲美；另外，微藻細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)素和半纖維素含量較低，而且與植物細(xì)胞中的纖維素Iβ不同，微藻細(xì)胞內(nèi)為Iα型纖維素，其氫鍵較弱，更易被降解為單糖，因此是作為燃料乙醇生產(chǎn)的優(yōu)良原料[6]。微藻中可溶性碳水化合物含量的高低，是制約利用微藻制備燃料乙醇成本高低的關(guān)鍵。因此，選育生長(zhǎng)速率快、碳水化合物含量高的藻株，對(duì)實(shí)現(xiàn)第三代燃料乙醇的高效制備至關(guān)重要。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期保存的4株藻株為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)它們的生長(zhǎng)速率和含糖量進(jìn)行分析，以期篩選出生長(zhǎng)速率快和總糖含量高的藻株。同時(shí)，研究在不同N濃度條件下微藻生長(zhǎng)和產(chǎn)糖的變化，為后期利用微藻制備燃料乙醇技術(shù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)使用的藻株、菌株和質(zhì)粒見表1；Trans Start Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒、DNA Loading Buffer、DNA Marker、卡那霉素等購(gòu)自北京全式金生物公司；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化級(jí)。

表1 藻株、菌株與質(zhì)粒的性質(zhì)和來(lái)源Table1 The properties and sources of microalgae, bacterial strains and plasmids

大腸桿菌LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉；藻株采用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，配方見表2。

表2 BG11培養(yǎng)基配方Table 2 Composition of BG11 medium

1.2 方 法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線和生長(zhǎng)速率測(cè)定

在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)4株藻株，每天取藻液測(cè)吸光度 OD550，連續(xù)檢測(cè)8天，以吸光度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌體的生長(zhǎng)曲線。

在藻株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，微藻生長(zhǎng)速率（μ）使用以下方程測(cè)得[7]：

其中：N0是指在開始時(shí)刻t0時(shí)微藻細(xì)胞數(shù)；Nt是指在tt時(shí)微藻細(xì)胞數(shù)。

藻細(xì)胞干重采用差重法，即取一定體積藻培養(yǎng)液，經(jīng)去離子水沖洗，用 GF/C 玻璃纖維濾紙抽濾，真空度在 （0.075～0.090）MPa 范圍內(nèi)。在 105℃ 烘箱中烘干至衡重[8]，并利用下式計(jì)算生物量。

其中：B為生物量，g/L；M1表示濾膜烘干后質(zhì)量，g；M2表示藻液烘干后濾膜質(zhì)量，g；V為藻液體積，L。

1.2.2 總糖和淀粉含量測(cè)定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取一定量分析純葡萄糖粉末，80℃烘至恒重；準(zhǔn)確稱取20 mg烘干后的葡萄糖粉末溶解于超純水中，定容至500 mL；準(zhǔn)確稱取30 g分析純苯酚溶于470 mL超純水中，并用棕色試劑瓶低溫保存；取具塞比色管，按表4加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液及超純水，并快速加入苯酚溶液1 mL及濃硫酸（98%）5 mL；室溫靜置10 min后搖勻，避光靜置20 min后測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度；每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液與超純水用量表Table 3 The glucose standard solution with ultrapure water use scale

（2）藻液中總糖含量測(cè)定：取1 mL藻液，經(jīng)12 000 rpm離心4 min，去掉上層清液；加入超純水至適當(dāng)濃度，取2 mL藻液加入比色管中，并快速加入苯酚溶液1 mL及濃硫酸（98%）5 mL；

室溫靜置10 min后搖勻，避光靜置20 min后測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出稀釋后液體中的總糖濃度，再換算為原藻液中總糖濃度。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線：將表3中葡萄糖濃度作為 x軸，測(cè)得的吸光值作為 y軸，算出形如 y=ax+b（R2=0.995～0.999）的線性漸進(jìn)趨勢(shì)線，確定 a、b 的值。培養(yǎng)液中總糖的含量為：

其中：TC 為培養(yǎng)液中總糖的含量，g/L；A 為吸光值；a、b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線中的數(shù)值；D 為加入的超純水體積。

（4）淀粉含量：根據(jù)FERNANDES等[9]的方法測(cè)定其中的淀粉含量。

1.2.3 18S rDNA的PCR擴(kuò)增

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻株#3藻液1.5 mL于離心管中，以12 000 rpm離心2 min。棄去上層清液，用滅菌的去離子水洗滌沉淀，然后加入液氮研磨沉淀，其它提取藻株#3基因組 DNA的步驟參照TIANGEN 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒說(shuō)明書。

按照真菌分類鑒定中的18S rDNA和ITS核酸序列分析方法，設(shè)計(jì)了2對(duì)相應(yīng)的通用引物（表4）。 以藻株#3基因組DNA為模板，按照Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，用NS1和NS8作為引物對(duì)得到的產(chǎn)物是18S1，用ITS1和ITS2作為引物對(duì)得到的產(chǎn)物是18S2。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30 s；55℃ 退火30 s；72℃ 延伸，延伸時(shí)間按1 kb的長(zhǎng)度用時(shí)1 min；72℃延長(zhǎng)10 min；4℃終止反應(yīng)。循環(huán)數(shù) 35次。

表4 引物序列Table 4 The sequence of primer

1.2.4 陽(yáng)性重組子的鑒定和測(cè)序

PCR產(chǎn)物18S1、18S2和克隆載體pEASY–T1通過(guò)A-T堿基互補(bǔ)配對(duì)，25℃恒溫30 min，得到重組質(zhì)粒T-18S1和T-18S2，經(jīng)過(guò)42℃熱擊轉(zhuǎn)化進(jìn)E. coli TRANS1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)于含卡那霉素終濃度為 50 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，挑取單菌落，經(jīng)菌落PCR初步鑒定，驗(yàn)證得到的陽(yáng)性克隆子，菌液送去上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 不同N濃度對(duì)碳水化合物累積的影響

微藻對(duì)氮源的需求僅次于碳源，氮源的濃度會(huì)對(duì)藻體細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組分的分布產(chǎn)生影響。在藻株BG11培養(yǎng)基基礎(chǔ)上剔除NaNO3，配成5 L培養(yǎng)基，高溫滅菌后，往5只柱式光生物反應(yīng)器中加入455 mL體積的培養(yǎng)基，再加入約10%體積的藻液，然后分別加入之前配好并已滅菌的一定體積不同濃度的NaNO3溶液，使柱式光合反應(yīng)柱中NaNO3濃度分別為0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L，其中1.5 g/L為正常條件[10]。藻株的培養(yǎng)條件[11-12]為：培養(yǎng)溫度 25 ± 1°C；光為單側(cè)冷光白熾燈管（光強(qiáng)：150 ± 50 μmol/(m2·s)）；持續(xù)通入空氣或含12%體積 CO2的混合氣。

2 結(jié)果和分析

2.1 富含碳水化合物微藻的篩選

2.1.1 生長(zhǎng)情況

4株藻株在通氣培養(yǎng)的過(guò)程中，生長(zhǎng)規(guī)律如圖1a所示，微藻CZ進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較為遲緩，而其余3株微藻第2天即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第6～7天進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。

在藻株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期取樣對(duì)其生長(zhǎng)速率進(jìn)行對(duì)比（圖1b），可以看出，藻株#3的生長(zhǎng)速率最快，可達(dá)0.086 g/(L·d)，SO次之，為0.079 g/(L·d)，PM2為0.076 g/(L·d)，CZ生長(zhǎng)速率最慢，為0.047 g/(L·d)。

圖1 四種微藻的生長(zhǎng)曲線（a）和生長(zhǎng)速率（b）Fig. 1 Growth curve (a) and growth rate (b) of four microalgae

2.1.2 總糖和淀粉含量分析

進(jìn)一步對(duì)4株微藻的總糖和淀粉含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同藻株的總糖含量差異明顯。CZ的總糖含量最高，為745 mg/L；#3次之，為556 mg/L；PM2為469 mg/L；SO最少，為436.2 mg/L。但就淀粉含量而言，#3淀粉含量最高，為225.2 mg/L，CZ為137.8 mg/L，PM2為134.7 mg/L，SO為113.4 mg/L，含量最低。此結(jié)果表明，微藻總糖含量的多少和淀粉等易還原性糖類的含量高低沒有相關(guān)的關(guān)系?？紤]到后期發(fā)酵產(chǎn)乙醇需要，淀粉等可溶性糖更容易被轉(zhuǎn)化利用，選取生長(zhǎng)速率最快和淀粉含量最高的藻株#3作為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

圖2 淀粉含量和總糖含量Fig. 2 Starch content and total sugar content

2.2 微藻的18s rDNA鑒定結(jié)果

以藻株#3基因組DNA為模板，用引物對(duì)NS1和NS8、ITS1和ITS2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.2%的瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，得到和理論大小2 000 bp、634 bp接近的目的條帶（圖3），初步判定擴(kuò)增成功。

圖3 18s rDNA基因克隆Fig. 3 18s rDNA gene cloning

經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物和pEASY–T1連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E. coli TRANS1 中，菌落PCR獲得陽(yáng)性克隆子，菌液測(cè)序，將測(cè)序的結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上使用Blastn程序進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：所獲得的序列與眾多隸屬于柵藻科鏈帶藻屬Desmodesmus sp.的多個(gè)物種的18S DNA 有很高的同源性，其中相似性最高的是與柵藻科鏈帶藻屬Desmodesmussp.，僅有一個(gè)堿基有差異，一致性達(dá)到99%以上。依據(jù)以上結(jié)果，可以初步鑒定該藻株隸屬于柵藻科的鏈帶藻屬Desmodesmus sp.。

2.3 不同N濃度條件下藻體碳水化合物累積變化

2.3.1 Desmodesmus sp.生長(zhǎng)情況

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5組不同質(zhì)量濃度的NaNO3溶液，研究了氮濃度對(duì)Desmodesmus sp. #3生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4中以看出，除了在缺氮條件，其它氮濃度條件下藻株的生長(zhǎng)曲線基本一致，表明N濃度的增加對(duì)藻株的生長(zhǎng)影響并不大?？赡艿脑蚴?，當(dāng)?shù)床蛔銜r(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素總量減少，對(duì)光照強(qiáng)度和CO2濃度需求降低，光合作用和呼吸作用均減弱，從而導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)?shù)礉舛仍黾訒r(shí)，微藻快速生長(zhǎng)。研究表明，該藻種可以在低濃度的氮源環(huán)境下生長(zhǎng)。

圖4 不同N濃度條件下藻株的生長(zhǎng)曲線Fig. 4 The growth curve under different concentrations of nitrogen

2.3.2 總糖含量

在缺N條件下，微藻總糖含量在第2天迅速達(dá)到最高值（圖5），占細(xì)胞干重的55.4%，然后迅速下降，最后維持在干重的9.2%；第二組（0.5 g/L）前兩天總糖并無(wú)太大變化，為最低值，占干重的11.6%，從第3天開始上升，在第4天達(dá)到最高值，占干重的24.9%，之后處于平穩(wěn)狀態(tài)，總糖含量變化不大；第三組（1 g/L）從第1天開始總糖含量就處于上升當(dāng)中，在第4天達(dá)到最高值，達(dá)到占干重的38.3%，之后就不停下降，最終維持在17.5%。第四組（1.5 g/L）正常條件培養(yǎng)下，總糖含量從第1天開始上升，在第3天達(dá)到最高值，占干重的32.6%，之后迅速下降，在第4天較低占干重的11.7%，之后又迅速上升到占干重的25.2%，然后又緩慢下降。第五組（2.0 g/L）屬于富N培養(yǎng)，和正常條件類似的是，前3天總糖含量急速增加，在第3天達(dá)到峰值，達(dá)到干重的31.3%，之后又迅速下降，第4天為占干重的12.8%，之后達(dá)到了平穩(wěn)的狀態(tài)緩。從結(jié)果可以推測(cè)，在氮源限制條件下，藻細(xì)胞中需要N元素參與合成的營(yíng)養(yǎng)組成如蛋白質(zhì)、葉綠素等含量會(huì)下降，從而糖類、脂類等不需要氮元素參與合成的營(yíng)養(yǎng)組成含量上升，這些結(jié)果和尤珊[13]、Lin[14]等的報(bào)道一致。

圖5 總糖含量變化曲線Fig. 5 The change curve of total carbohydrate

3 結(jié) 論

通過(guò)比對(duì)4株不同微藻的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)糖情況，獲得了1株生長(zhǎng)速率大且產(chǎn)糖量高的藻株#3。通過(guò)對(duì)微藻 #3其18S rDNA分析，鑒定該藻株隸屬于柵藻科的鏈帶藻屬Desmodesmus sp.。缺N條件下是有利于微藻積累淀粉的，但是不利于微藻生長(zhǎng)；富N條件在一定程度上能夠促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，但是不利于微藻積累糖類。綜合考慮，在濃度為0.5 g/L的NaNO3BG11培養(yǎng)基溶液中，該藻株具有最大的研究?jī)r(jià)值。

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Screening and Identification of Carbohydrate-rich Microalgae and Carbohydrate Production under Different Concentrations of Nitrogen

XIAO Shi-yuan1,2, XU Jing-liang1, YUAN Tao1,2, ZHAO Yue1,2, WU Hao1, LI Xie-kun1,2, YUAN Zhen-hong1
(1. Key Laboratory of Renewable Energy, Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China； 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The growth rate and starch content of four strains of microalgae preserved in our laboratory were analyzed. A carbohydrate-rich microalgae #3, as one of the four, was screened. Its growth rate and starch content could attain to 0.086 g/(L·d) and 225.2 mg/L, respectively. Further, microalgae #3 was identified as Desmodesmus sp. based on 18s rDNA cluster analysis. The growth rate of Desmodesmus sp. #3 was low and the total sugar accumulation was fast when cultured without adding nitrogen. The growth rate change at different nitrogen concentration was almost similar, but total sugar accumulation speed presented different change tendency.

microalgae； 18S rDNA； total sugar

TK6

A

10.3969/j.issn.2095-560X.2015.05.004

2095-560X（2015）05-0340-06

肖仕圓（1988-），男，碩士研究生，主要從事生物質(zhì)能源生化轉(zhuǎn)化技術(shù)研究。

2015-07-13

2015-08-27

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃，2013AA065803）；國(guó)家自然科學(xué)基金（2117623，21211140237）；廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013B010403021）；廣州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013J4300026）

? 通信作者：許敬亮，E-mail：xjl@ ms.giec.ac.cn

許敬亮（1977-），男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物質(zhì)能源生化轉(zhuǎn)化和纖維素燃料乙醇研究。