魏春，劉利峰，孔令民

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

畢赤酵母生產(chǎn)重組β-半乳糖苷酶的指數(shù)補料分批發(fā)酵研究

魏春，劉利峰，孔令民

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

對畢赤酵母重組表達源于植物乳桿菌的β-半乳糖苷酶的5 L罐高密度發(fā)酵進行了研究。建立了甲醇指數(shù)補料動力學(xué)模型，并考察了不同比生長速率對β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的影響。四個不同比生長速率（0.010/h，0.029/h，0.043/h和0.058/h）的甲醇指數(shù)補料分批發(fā)酵結(jié)果表明，比生長速率對β-半乳糖苷酶生產(chǎn)具有顯著的影響。最大β-半乳糖苷酶產(chǎn)量60 U/mL在比生長速率為0.029/h時獲得。采用指數(shù)補料分批發(fā)酵工藝的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量優(yōu)于常規(guī)策略下的產(chǎn)量，該工藝在甲醇誘導(dǎo)后期具有明顯生產(chǎn)優(yōu)勢。

畢赤酵母；β-半乳糖苷酶；指數(shù)補料；比生長速率

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23），又稱乳糖酶，能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，可用于解決乳糖不耐癥患者的乳品消費問題。另外，某些種類的β-半乳糖苷酶還兼具轉(zhuǎn)半乳糖基作用，在合成半乳糖苷化合物，比如功能性低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）等產(chǎn)品方面具有重要應(yīng)用價值［1］。不同微生物來源的β-半乳糖苷酶的酶學(xué)特性具有不同特點，適用于不同場合，因此尋求新的高效的β-半乳糖苷酶的研究仍是熱點。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum WZ011）作為益生菌，其β-半乳糖苷酶具有良好的應(yīng)用潛力［2］。畢赤酵母分泌表達具有雜蛋白少、高表達量等優(yōu)點［3］。因此，在畢赤酵母中表達生產(chǎn)植物乳桿菌來源的β-半乳糖苷酶并加以發(fā)酵優(yōu)化，將是實現(xiàn)該酶大量生產(chǎn)的有效手段。因此，對已構(gòu)建的分泌表達重組β-半乳糖苷酶的畢赤酵母的補料發(fā)酵工藝進行了研究。指數(shù)補料是高密度發(fā)酵中的一種補料策略，也適用于研究微生物生理狀態(tài)與產(chǎn)物之間的關(guān)系［4］。本文建立了一套能應(yīng)用于發(fā)酵罐上生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的畢赤酵母指數(shù)補料工藝，研究了誘導(dǎo)階段比生長速率對產(chǎn)酶的影響，并與常規(guī)補料工藝進行了比較。

1 材料與方法

1.1 菌種

畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115用作重組表達的宿主（Invitrogen公司）。源于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum WZ011）的β-半乳糖苷酶基因被整合到畢赤酵母細胞分泌表達載體pPIC9k，然后轉(zhuǎn)化宿主菌GS115獲得Mut+型的重組表達菌株。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（1 L）：YNB（Yeast nitrogen base withoutamino acids，Sigma公司）13.4 g，甘油10 g，生物素0.4 mg；發(fā)酵用BSM培養(yǎng)基（1 L）：甘油40 g，85%H3PO426.7 mL，CaSO40.93 g，K2SO418.2 g，MgSO4·7H2O 14.9 g，KOH 4.13 g，ANTIFOAM 204（Sigma）0.3 mL，PTM1 4.5 mL。

PTM1微量元素溶液的組成（1 L）：CuSO4· 5H2O 6.0 g，NaI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO4· 2H2O 0.2 g，HBO30.02 g，CoCl2·6H2O 0.914 g，ZnCl220.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0 g，生物素0.2 g，H2SO45.0mL，無菌過濾，4℃避光保存。

甘油補料培養(yǎng)基：50%（W/V）甘油（含12mL/ L PTM1）；甲醇補料培養(yǎng)基：含有12 mL/L PTM1的甲醇。

1.3 發(fā)酵

畢赤酵母細胞在種子培養(yǎng)基里生長至OD600為6時，以10%的接種量接種到裝有3 L BSM培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中開始分批培養(yǎng)。用28%的氨水控制pH在5.0，溫度控制在30℃，溶氧（DO）控制在空氣飽和的40%，必要時補充純氧。一旦DO迅速回升，表示培養(yǎng)基里的甘油完全消耗，分批培養(yǎng)結(jié)束，開始以15 mL/（L·h）的流速補料50%（W/ V）的甘油。3.5 h后停止甘油補料，先加入6 mL甲醇以便酵母快速適應(yīng)甲醇，1.5 h后以2.5 mL/ (L·h)的流速補料甲醇2 h，然后按常規(guī)補料策略（Invitrogen公司畢赤酵母發(fā)酵指南）和指數(shù)補料策略流加甲醇進行誘導(dǎo)生產(chǎn)。

1.4 分析方法

1.4.1 細胞濕重（WCW）測定

積極開展水土保持知識進校園活動，針對中小學(xué)生開展了新一輪水土保持知識教育活動。在西寧市教委的支持下，2013年4月19日西寧市黃河路小學(xué)組織200余名師生在長嶺水土保持科技示范園區(qū)開展了“攜手保護生態(tài)，共建綠色家園”的主題活動。5月31日西寧市南川西路小學(xué)近1400名少年兒童到西寧長嶺水土保持科技示范園開展水土保持科普教育戶外實踐活動。同時編印了中小學(xué)《水土保持科普教育知識讀本》，在西寧市、海東市、黃南州等地中小學(xué)發(fā)放5000余冊。面向生產(chǎn)建設(shè)單位、水土保持重點地區(qū)印發(fā)了《水土保持科普讀本》1000余冊。同時制作了《青海小流域綜合治理紀(jì)實》《生態(tài)公園、綠色長嶺》等兩部專題宣傳片。

取1 mL發(fā)酵液，以8 000 r/min離心5 min，去上清，稱量菌體濕重（WCW）。取至少3次測定的平均值。

1.4.2 β-半乳糖苷酶酶活的測定

β-半乳糖苷酶酶活單位定義為：30℃每分鐘水解1μmol ONPG的酶量定義為1 U。參照Invitrogen公司“Pichia Expression Kit”中的方法測定酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醇指數(shù)補料動力學(xué)模型的建立

為了實現(xiàn)指數(shù)補料策略在β-半乳糖苷酶發(fā)酵上的應(yīng)用，需要建立相應(yīng)的指數(shù)補料模型。由物料平衡可知，在畢赤酵母發(fā)酵的甲醇誘導(dǎo)階段，甲醇比消耗速率vMg/（gWCW·h）滿足以下關(guān)系［5］：

其中，μM是菌體以甲醇為碳源的比生長速率（1/h），YX/M是菌體關(guān)于甲醇的得率（gWCW/g），YX/M，M是菌體關(guān)于甲醇的最大得率（gWCW/g），m是菌體以甲醇為碳源的維持系數(shù)g/（gWCW·h）。YX/M，M和m可認為恒定，但是很難直接得到其數(shù)值，而vM和μM可以由發(fā)酵數(shù)據(jù)直接計算出。因此通過先前多批發(fā)酵得到多組vM和μM的數(shù)據(jù)，回歸出兩者之間的線性關(guān)系，由所得直線的斜率和截距就可得到Y(jié)X/M，M和m，結(jié)果見圖1。

圖1 甲醇比消耗速率與比生長速率的關(guān)系

圖1表明，甲醇比消耗速率與比生長速率呈線性關(guān)系(R2=0.977)，因此得下述方程：

在甲醇限制性補料、底物濃度維持不變的穩(wěn)態(tài)條件下，由物料平衡可得下述方程［6-7］：

其中，F(xiàn)M，t（L/h）為甲醇補料速率，Xt（g/L）和Vt（L）分別為甲醇流加時間t時的濕細胞密度和發(fā)酵液體積，S為發(fā)酵液中的殘留甲醇濃度（g/L），Si為補料液中的甲醇濃度（790 g/L）。由于甲醇為限制性流加，發(fā)酵液中殘留甲醇很少，所以S相對于Si可視為S≈0，因此可得：

把FM，t（L/h）轉(zhuǎn)換為以mL/h為流量單位的FM，可得到：

當(dāng)酵母細胞在甲醇中生長的比生長速率恒定為μM時，菌體生長滿足以下關(guān)系：

其中，X0（g/L）和V0（L）分別為指數(shù)補料開始時（這時的t設(shè)為0）的濕細胞密度和發(fā)酵液體積。把式（7）代入式（6）可得到以時間為變量的甲醇指數(shù)補料動力學(xué)模型：

2.2 比生長速率對β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的影響

設(shè)定4個不同的比生長速率0.015/h，0.035/ h，0.05/h，0.065/h，應(yīng)用方程（8）進行指數(shù)補料。甲醇誘導(dǎo)3.5 h后，開始指數(shù)補料甲醇，酵母生長能保持較恒定的比生長速率。由于系統(tǒng)誤差，實際得到的比生長速率比設(shè)定的要小，分別為0.010/h，0.029/h，0.043/h，0.058/h。

圖2 比生長速率對β-半乳糖苷酶產(chǎn)量的影響

圖2表明，在甲醇誘導(dǎo)階段，4個不同比生長速率對應(yīng)的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量也不同。當(dāng)比生長速率維持在相對較低的0.01/h時，β-半乳糖苷酶產(chǎn)量為20 U/m L，也相對較低；當(dāng)比生長速率在相對較高的0.043/h、0.058/h時，β-半乳糖苷酶產(chǎn)量在40 U/mL。當(dāng)比生長速率維持在0.029/h時，β-半乳糖苷酶產(chǎn)量達最大。過高或過低的比生長速率均不利于β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)。甲醇誘導(dǎo)階段的比生長速率是影響畢赤酵母生產(chǎn)重組蛋白的最重要因素［8-9］。對于畢赤酵母分泌型表達，比生長速率甚至還能影響重組蛋白的糖基化程度［10］。文獻報道的重組畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)階段的最優(yōu)比生長速率一般在0.018/h到0.035/h之間，具體數(shù)值和重組蛋白特性有關(guān)。比生長速率影響重組蛋白產(chǎn)量的機理可能是它影響生長和蛋白生產(chǎn)之間的能量平衡狀態(tài)［11］。

2.3 常規(guī)補料策略與指數(shù)補料策略的比較

圖3是按照常規(guī)的甲醇補料策略實施的發(fā)酵過程曲線，圖4是誘導(dǎo)階段實際維持0.029/h比生長速率的發(fā)酵過程曲線，在甘油分批培養(yǎng)階段和甘油補料階段采用相同工藝。酵母經(jīng)過10 h左右的延滯期后進入快速生長的對數(shù)生長期，生長至濕細胞密度為100 g/L左右時培養(yǎng)基里的甘油完全被消耗，進入甘油補料培養(yǎng)階段。經(jīng)過3.5 h的限制性甘油補料，細胞密度增至160 g/L，同時達到AOX啟動子去阻遏的目的，停止甘油補料進入甲醇誘導(dǎo)階段，在甲醇適應(yīng)之后開始流加甲醇。圖3與圖4對比結(jié)果表明，在應(yīng)用常規(guī)補料條件時，誘導(dǎo)后期發(fā)酵后勁不足，細胞密度和β-半乳糖苷酶產(chǎn)量在誘導(dǎo)后期同時段要低于指數(shù)補料策略下的相對應(yīng)指標(biāo)，最高的細胞密度和β-半乳糖苷酶產(chǎn)量為410 gWCW/L和40.5 U/mL，低于指數(shù)補料的細胞密度442 gWCW/L和β-半乳糖苷酶產(chǎn)量60 U/mL。采用指數(shù)補料工藝的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量比常規(guī)補料策略提高了48%。甲醇指數(shù)補料有助于誘導(dǎo)后期畢赤酵母生長及β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的穩(wěn)定，而常規(guī)策略里的甲醇補料量可能不足以支持后期的穩(wěn)定生長和生產(chǎn)。

圖3 常規(guī)補料策略下重組畢赤酵母的生長（■）和β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)（□）過程

圖4 甲醇指數(shù)補料策略下（0.029/h）重組畢赤酵母的生長（■）和β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)（□）過程

3 結(jié)論

對分泌表達β-半乳糖苷酶的畢赤酵母高密度發(fā)酵進行了研究。以多批預(yù)發(fā)酵實驗為基礎(chǔ)，通過線性擬合獲得了重組菌株的甲醇比消耗速率與比生長速率的線性關(guān)系，建立了甲醇指數(shù)補料動力學(xué)模型，利用該模型能夠在發(fā)酵罐上維持特定的比生長速率?？疾炝思状颊T導(dǎo)階段0.010/h、0.029/h、0.043/h和0.058/h四個不同比生長速率對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，比生長速率對β-半乳糖苷酶生產(chǎn)有顯著的影響，過高或過低的比生長速率均不利于β-半乳糖苷酶的積累。最大β-半乳糖苷酶產(chǎn)量60 U/mL在比生長速率為0.029/h時獲得。對比試驗表明，采用指數(shù)補料分批發(fā)酵工藝優(yōu)于常規(guī)補料分批發(fā)酵工藝。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Production of recombinantβ-galactosidase by Pichia pastoris based on exponential fed-batch fermentation

WEIChun，LIU Lifeng，KONG Lingmin
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

Production of recombinantβ-galactosidase derived from Lactobacillus plantarum by Pichia pastoris was investigated in 5-L bioreactor.A kinetic model of methanol feeding at the exponential rate was established and the effect of specific growth rate on theβ-galactosidase production was examined.In methanol induction phase，four specific growth rates，0.010/h，0.029/ h，0.043/h and 0.058/h，were investigated.The specific growth rate was found to play a significant role on theβ-galactosidase production.Themaximumβ-galactosidase production(60 U/mL)was achieved at a specific growth rate of 0.029/h.Compared with the regular feeding strategy，the exponential feeding ofmethanol could afford higherβ-galactosidase production，especially during the later stage ofmethanol induction.

Pichia pastoris；β-galactosidase；exponential feeding；specific growth rate

TQ92

A

1674-2214(2015)04-0006-04

2015-08-03

浙江省自然科學(xué)基金項目（LY12B06010）

魏春（1977—），男，浙江新昌人，副教授，博士，主要從事發(fā)酵工程的研究，E-mail：springweispring@163.com.