范春輝，程兆忠，韓偉忠，王燕

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 青島 266003)

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NGF對支氣管哮喘大鼠氣道重塑影響及其機制

范春輝，程兆忠，韓偉忠，王燕

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 青島 266003)

目的 研究神經(jīng)生長因子(NGF)在支氣管哮喘氣道重塑中的作用及其可能機制，為哮喘治療尋求新的靶點。方法 將30只SPF級健康雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、哮喘模型組和NGF抗體干預(yù)組。蘇木精-伊紅染色觀察大鼠氣道壁組織學(xué)改變，Masson染色觀察氣道上皮下膠原層厚度，免疫組化法檢測肺組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Ⅲ型膠原表達(dá)。結(jié)果 哮喘模型組及NGF抗體干預(yù)組支氣管壁厚度、支氣管平滑肌厚度、支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)、支氣管壁血管密度、上皮下膠原層厚度、VEGF及Ⅲ型膠原的表達(dá)較對照組顯著增加，NGF抗體干預(yù)組以上改變較哮喘模型組減輕，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=108.29～554.21，P<0.01)。大鼠支氣管壁血管密度和管壁厚度與肺組織中VEGF蛋白表達(dá)，氣道膠原層厚度與Ⅲ型膠原含量均呈正相關(guān)(r=0.82～0.87，P<0.05)。結(jié)論 NGF可能通過調(diào)控肺組織VEGF、Ⅲ型膠原的表達(dá)參與哮喘氣道重塑。

哮喘；神經(jīng)生長因子；氣道重塑；血管內(nèi)皮生長因子A；膠原Ⅲ型

近年來大量研究表明，慢性哮喘病人即使在臨床緩解期仍持續(xù)存在肺功能的異常,存在一定程度不可逆的氣流阻塞，即氣道重塑[1]。氣道重塑目前被認(rèn)為是哮喘慢性化、持續(xù)化及嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)，治療哮喘必須與防治氣道重塑相結(jié)合，才可能達(dá)到真正意義上的控制。糖皮質(zhì)激素是目前公認(rèn)的最有效的治療哮喘的藥物，但它是否可直接或通過減輕炎癥間接抑制或逆轉(zhuǎn)氣道重塑，目前仍存在爭議，所以探尋新的緩解氣道重塑的藥物對于哮喘的控制具有重要意義[2]。有研究表明，神經(jīng)生長因子(NGF)與哮喘氣道炎癥、高反應(yīng)性和氣道重塑密切相關(guān)[3]。體外實驗結(jié)果證明，NGF可引起皮膚血管的增生和重建,而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可作為新生血管形成及重建的重要指標(biāo)[4-5]。膠原是氣道壁的重要組成部分。因此，本實驗通過阻斷哮喘模型大鼠NGF，研究NGF與哮喘氣道重塑及VEGF、Ⅲ型膠原表達(dá)的關(guān)系，探討NGF是否參與哮喘氣道重塑及其可能機制。

1 材料與方法

1.1動物分組及處理

SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，鼠齡7周齡，體質(zhì)量(200±20)g (青島市藥檢所動物實驗中心提供)。隨機分為3組。①哮喘模型組(哮喘組)：第1、8天大鼠腹腔注射新鮮配制的雞卵清蛋白(OVA)溶液2 mL(內(nèi)含OVA 100 mg、氫氧化鋁100 mg)致敏，第15天起將大鼠置于半封閉玻璃箱內(nèi)霧化吸入10 g/L的OVA 10 mL激發(fā)哮喘，隔日1次，每次30 min，共6周。②對照組：操作同哮喘組，但以生理鹽水代替過敏原腹腔注射及霧化。③NGF抗體干預(yù)組(干預(yù)組)：模型建立同哮喘組，于第6次霧化激發(fā)起，激發(fā)前3 h，先經(jīng)鼻滴入兔抗大鼠NGFβ抗體(1∶50稀釋，購于武漢博士德生物公司)50 μL。

1.2標(biāo)本采集

最后一次激發(fā)后24 h內(nèi)，腹腔注射100 g/L水合氯醛3.5 mL/kg麻醉大鼠，心臟穿刺放血處死。即刻打開胸腔，自肺門處分離左肺，生理鹽水快速沖洗，取左肺下葉肺組織，置于中性甲醛固定液中固定24 h，轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇溶液中，24 h內(nèi)送病理科行石蠟包埋、切片，厚度為4 μm，分別用于蘇木精-伊紅染色、Masson染色、免疫組化方法檢測肺組織VEGF和Ⅲ型膠原的表達(dá)。

1.3標(biāo)本組織學(xué)檢測

①氣道形態(tài)學(xué)觀察：蘇木精-伊紅染色病理切片在光學(xué)顯微鏡(100倍)下找到完整的無軟骨中小支氣管橫斷面，每張切片均隨機選取上、中、下3個視野，采用英吉爾數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，使用Image-Pro Plus圖文分析軟件對染色標(biāo)本分別測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、總管壁面積(WAt)、支氣管平滑肌面積(WAm)、支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N)，將測得的WAt、WAm、N使用Pbm進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。②氣道血管形態(tài)學(xué)觀察：每個標(biāo)本觀察5張切片，顯微鏡(100倍)下于黏膜下層、黏膜固有層血管多的區(qū)域選10個視野，計數(shù)50個視野(1 mm2)中管腔樣結(jié)構(gòu)的總數(shù)作為血管密度。③上皮下膠原：采用Masson染色進(jìn)行觀察，隨機選取直徑500～1 000 μm結(jié)構(gòu)完整的支氣管橫斷面3個，測定上皮下膠原面積(Wcol)，并用Pbm進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，代表氣道膠原層的厚度。④肺組織VEGF和Ⅲ型膠原：采用免疫組織化學(xué)方法檢測，以平均吸光度(A)表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1哮喘發(fā)作情況

對照組大鼠吸入生理鹽水后無明顯反應(yīng)；哮喘組和干預(yù)組大鼠在第1次霧化吸入OVA后，大部分哮喘發(fā)作(多在激發(fā)后30 min發(fā)作)，表現(xiàn)為呼吸頻率加深加快，口唇發(fā)紺，腹部翕動，肋間隙凹陷，四肢無力，行動遲緩，俯伏不動，煩躁不安，大小便失禁等；干預(yù)組霧化吸入OVA后，哮喘癥狀逐漸減輕，第4次應(yīng)用抗體后已無明顯反應(yīng)。

2.2肺組織病理學(xué)變化

對照組大鼠支氣管黏膜上皮、黏膜肌層、肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔規(guī)則，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。與對照組比較，哮喘組大鼠支氣管管腔狹窄，支氣管上皮可見大量杯狀細(xì)胞，平滑肌及基底膜明顯增厚，大量膠原沉積，肺泡間隔明顯增厚，氣道壁及肺泡間隔可見淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤。與哮喘組比較，干預(yù)組大鼠上述改變明顯減輕。

2.3圖像分析

2.3.1各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)比較 在支氣管壁厚度(WAt/Pbm)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pbm)及支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pbm)3個指標(biāo)上，哮喘組及干預(yù)組均顯著高于對照組,而干預(yù)組較哮喘組則明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=273.62～554.21，P<0.05)。見表1。

2.3.2各組大鼠氣道血管密度的比較 哮喘組及干預(yù)組的氣道血管密度均明顯高于對照組，干預(yù)組氣道血管密度則明顯低于哮喘組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=108.29，P<0.05)。見表2。

2.3.3各組大鼠上皮下膠原層厚度(Wcol/Pbm)的比較 哮喘組及干預(yù)組大鼠上皮下膠原沉積較對照組明顯增多，干預(yù)組上皮下膠原沉積較哮喘組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=142.29，P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定

表2 各組大鼠氣道血管密度及Wcol/Pbm的比較

2.3.4VEGF在大鼠肺組織中表達(dá)情況 VEGF陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于胞漿。與對照組比較，哮喘組及干預(yù)組大鼠肺組織VEGF蛋白表達(dá)顯著增加，干預(yù)組大鼠VEGF蛋白表達(dá)與哮喘組比較明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=243.81，P<0.05)。見表3。

2.3.5Ⅲ型膠原在大鼠肺組織中的表達(dá)情況 Ⅲ型膠原陽性染色為棕黃色。哮喘組及干預(yù)組大鼠肺組織Ⅲ型膠原表達(dá)顯著高于對照組，干預(yù)組大鼠Ⅲ型膠原表達(dá)顯著低于哮喘組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=399.25，P<0.05)。見表3。

2.4相關(guān)性分析

大鼠氣道血管密度和管壁厚度與肺組織VEGF蛋白的表達(dá)，氣道膠原層厚度與Ⅲ型膠原含量均呈正相關(guān)(r=0.82～0.87，P<0.05)。

組別nVEGFⅢ型膠原對照組100.11±0.040.17±0.04模型組100.33±0.040.43±0.04干預(yù)組100.21±0.040.32±0.03

3 討 論

氣道重塑是哮喘除慢性炎癥性改變之外的又一特征性病理變化，包括氣道平滑肌增生、肥大，上皮細(xì)胞增生，上皮下纖維化，細(xì)胞間質(zhì)重構(gòu)和血管分布增多等[6-7]。本實驗成功復(fù)制了大鼠哮喘氣道重塑模型，病理組織學(xué)觀察顯示，與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的氣道重塑的改變，包括氣道壁增厚，氣道平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多、肥大，氣道壁血管增生，上皮下膠原沉積量明顯增加等。

NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，最初因其可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活和分化而被發(fā)現(xiàn)[8]。除了神經(jīng)保護(hù)作用外，有越來越多的證據(jù)支持NGF在修復(fù)機制中發(fā)揮作用。有研究結(jié)果顯示，哮喘病人體內(nèi)NGF水平顯著高于正常人，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9]。而與氣道重塑密切相關(guān)的支氣管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞均可表達(dá)NGF，而且自身有NGF受體[10]。因此，推測NGF可能在哮喘氣道重塑中亦起一定的作用。本文結(jié)果顯示，阻斷NGF活性后，大鼠氣道壁增厚程度、氣道平滑肌厚度及細(xì)胞數(shù)目、氣道血管密度及上皮下膠原沉積厚度均較模型組明顯減輕，表明NGF可能通過某種機制參與哮喘氣道重塑。

有研究顯示，應(yīng)用卵蛋白反復(fù)激發(fā)的致敏大鼠，血清中VEGF水平與氣道血管計數(shù)、血管平滑肌厚度及血管滲透指數(shù)呈正相關(guān)[5]。本文結(jié)果顯示，模型組肺組織VEGF表達(dá)及氣道血管密度均較對照組明顯升高，肺組織VEGF表達(dá)與氣道血管密度及氣道壁厚度均呈正相關(guān)，此結(jié)果進(jìn)一步證明VEGF產(chǎn)生增加可能通過某種機制促進(jìn)氣道血管生成從而參與氣道重塑。在既往的體外實驗中已證明，NGF可引起皮膚血管的增生和重建[4]。而本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用NGF抗體干預(yù)后，大鼠肺組織VEGF表達(dá)及氣道血管密度較模型組均顯著下降，提示在哮喘發(fā)病過程中，NGF可能通過某種機制促進(jìn)VEGF的釋放，進(jìn)而促進(jìn)氣道血管生成增加，從而促進(jìn)哮喘氣道重塑。其具體機制及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚待進(jìn)一步研究。

哮喘病人氣道上皮下膠原纖維層的密度和厚度均比正常增加，因此氣道壁發(fā)生形變時的阻力相應(yīng)增加，從而對抗平滑肌的收縮和使氣道縮窄，最終導(dǎo)致氣道強直。因此有學(xué)者提出，氣道壁膠原的增多可以作為氣道重塑的標(biāo)志物之一[11]。研究顯示，增厚的氣道基底膜主要由Ⅲ、Ⅴ型膠原、少量Ⅰ型膠原及纖維連接蛋白組成，組織纖維化過程中早期以Ⅲ型膠原為主[12]。本研究中，模型組較對照組Ⅲ型膠原含量及氣道膠原層厚度均顯著增加，而且氣道膠原層厚度與Ⅲ型膠原含量呈顯著正相關(guān)。表明Ⅲ型膠原可作為氣道膠原沉積及氣道重塑的敏感指標(biāo)。NGF干預(yù)后大鼠氣道膠原層厚度及Ⅲ型膠原含量較模型組顯著下降，提示NGF可能通過促進(jìn)Ⅲ型膠原的合成導(dǎo)致氣道膠原沉積增加，進(jìn)而促進(jìn)哮喘氣道重塑。已有研究結(jié)果表明，NGF可誘導(dǎo)肺纖維母細(xì)胞遷移及分化成肌成纖維細(xì)胞，也能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生膠原[13]。且既往研究報道肺成纖維細(xì)胞表面有NGF受體表達(dá)[10]。因此，推測肺成纖維細(xì)胞可能為NGF作用的靶細(xì)胞，NGF引起肺成纖維細(xì)胞分泌膠原的具體機制尚待進(jìn)一步研究證實。

氣道重塑是一種不可逆的病理改變，是難治性哮喘的病理基礎(chǔ)。因此，研發(fā)新的防治哮喘氣道重塑的藥物具有重要的臨床意義。本研究及國內(nèi)外的許多研究均證明，NGF與哮喘氣道重塑密切相關(guān)。然而，NGF及其受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NGF與其他細(xì)胞因子、炎癥遞質(zhì)的相互作用機制尚不明確。研發(fā)安全有效的NGF阻斷劑用于哮喘的防治成為一個具有重大臨床意義的設(shè)想，有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 馬偉平)

EFFECT OF NERVE GROWTH FACTOR ON THE AIRWAY REMODELING OF ASTHMA RATS AND ITS MECHANISMS

FANChunhui,CHENGZhaozhong,HANWeizhong,WANYan

(Department of Respirology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo study the effect of nerve growth factor (NGF) on the airway remodeling of asthma and its possible mechanisms, and explore new targets for its therapy.MethodsThirty healthy maleWistarrats were divided into normal group, the asthma model group and NGF-antibody group at random. HE staining was used to observe the histological changes of the airway, Masson staining to estimate the thickness of epithelium collagen, and immunohistochemistry to measure the levels of VEGF and collagen Ⅲ.ResultsThe thickness of the bronchial wall and the bronchial smooth muscle (BSM), the number of the BSM cells, the vascular density of the bronchial wall, the thickness of epithelium collagen, the levels of VEGF and collagen Ⅲ in the asthma model group and the NGF-antibody group increased versus the control group, and the above changes in the NGF-antibody group were lighter than the asthma model group, the differences being significant (F=108.29-554.21,P<0.01). The density of the bronchial vessels and the thickness of the wall were positively correlated with VEGF expression in the lung tissue, the thickness of the bronchial wall and the level of collagen Ⅲ (r=0.82-0.87,P<0.05).ConclusionNerve growth factor is likely involved in airway remodeling of asthma rats by regulating the expressions of VEGF and collagen Ⅲ in lung tissue.

asthma; nerve growth factor; airway remodeling; vascular endothelial growth factor A; collagen type Ⅲ

2014-01-15;

2014-05-14

范春輝 (1987-)，女，碩士研究生。

程兆忠(1963-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師。

R562.25

A

1008-0341(2015)02-0173-04