方 華，段書芬，何 磊，陳 麗，鄭柏洪

(1. 南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210044;2. 大氣環(huán)境與裝備技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210044;3. 江蘇立能環(huán)保水處理工程有限公司，江蘇蘇州 215168)

富油微藻被認(rèn)為是唯一具有完全替代化石燃料潛力的生物柴油原料［1］，但微藻制備生物柴油的高成本制約了該技術(shù)發(fā)展［2］，而其中微藻培養(yǎng)成本則占到生物柴油生產(chǎn)總成本的70%以上［3］。另一方面，微藻生長(zhǎng)的同時(shí)也會(huì)大量攝取水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利用微藻對(duì)污水進(jìn)行深度脫氮除磷處理，自20 世紀(jì)中葉以來(lái)即被提出和研究［4，5］。假如能利用污水廠二級(jí)出水培養(yǎng)富油微藻，可同步實(shí)現(xiàn)富油微藻培養(yǎng)和污水深度凈化，并能大幅降低微藻培養(yǎng)成本，具有極佳的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益，而適宜藻種的篩選及其在二級(jí)出水中生長(zhǎng)和富油特性的研究則是這一技術(shù)的基礎(chǔ)。本研究選取了國(guó)內(nèi)外常用于生物柴油制備和污水處理的普通小球藻(Chlorella vulgaris)、二形柵藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和海水小球藻(Chlorella pacifica)等4種微藻為對(duì)象，對(duì)比研究了它們?cè)诙?jí)生化出水中的生長(zhǎng)、油脂積累和脫氮除磷性能，以期為篩選出適于在二級(jí)出水中培育的富油微藻提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)廢水

采用模擬二級(jí)出水［6］為微藻培養(yǎng)液，水質(zhì)如表1 所示。

表1 二級(jí)出水水質(zhì)Tab.1 Water Quality of Secondary Effluent

1.2 藻種及微藻培養(yǎng)

普通小球藻、二形柵藻和蛋白核小球藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，海水小球藻購(gòu)自青島海洋研究所。采用BG11 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行藻種的擴(kuò)大培養(yǎng)。

微藻培養(yǎng)在500 mL 錐形瓶中進(jìn)行，按1 ∶9(體積比)將藻液接種至滅菌后二級(jí)出水中;接種前藻液采用15 mg /L 的NaHCO3溶液清洗2 遍;接種后置于光照培養(yǎng)箱中，溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為8 000 lux、光暗比為12 ∶12 的條件下培養(yǎng)。

1.3 微藻生物量和油脂含量的測(cè)定

微藻干重采用重量法測(cè)定［7］，藻細(xì)胞的光密度值采用分光光度法測(cè)定［8，9］。分別建立4 種微藻光密度值與干重的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于微藻生物量計(jì)算。培養(yǎng)液中微藻油脂含量采用重量法測(cè)定［10］，提取劑為氯仿-甲醇混合液;同步測(cè)定藻干重，計(jì)算藻細(xì)胞含油率。

1.4 微藻生長(zhǎng)與氮磷去除模型擬合

利用Logistic 模型對(duì)微藻生長(zhǎng)特性進(jìn)行擬合分析。Logistic 模型常用于描述微生物生長(zhǎng)速率和生物量之間的關(guān)系［11］，其表達(dá)式如式(1)所示。

其中t—培養(yǎng)時(shí)間，d;

N—t 時(shí)刻微藻生物量，mg/mL;

K—微藻最大生物量，mg/mL;

a—初始偏移量;

r—比生長(zhǎng)速率，d-1。

當(dāng)N 為K 的一半時(shí)，生物量增長(zhǎng)速率最大，以Rmax表示，其計(jì)算式如式(2)所示。

利用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)氮磷去除進(jìn)行擬合。一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)是指反應(yīng)速率與反應(yīng)物含量的一次方成正比的反應(yīng)，可用來(lái)描述氮磷等污染物的生物降解過(guò)程［12］，其表達(dá)式如式(3)所示。

其中—si—t 時(shí)刻的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度;

s0—初始的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度;

k—一級(jí)反應(yīng)常數(shù)。

1.5 水質(zhì)分析

TN 采用過(guò)硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測(cè)定;TP 采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定;COD 采用重鉻酸鉀法測(cè)定。培養(yǎng)后藻液以4 000 r/min 離心30 min 后，取上清液測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻生長(zhǎng)特性

模擬二級(jí)出水中，4 種微藻生長(zhǎng)及其Logistic 模型擬合曲線如圖1 所示，采用origin 軟件所得擬合結(jié)果如表2 所示。

圖1 生物量隨時(shí)間的變化Fig.1 Variation of Biomass with Time

表2 四種藻的生長(zhǎng)特征參數(shù)Tab.2 Growth Parameters of Four Species of Microalgae

4 種微藻的生長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先快速增長(zhǎng)后趨于平緩的規(guī)律，與經(jīng)典的微生物批次培養(yǎng)生長(zhǎng)特性相符。普通小球藻和二形柵藻的生長(zhǎng)速率與生物量顯著高于其他兩種微藻，18 d 時(shí)最大藻干重分別可達(dá)293.04 和409.94 mg/L。已有研究中，小球藻、柵藻等在BG11 等常用培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物量一般為300 ～500 mg/L 左右［13］;本試驗(yàn)所用的二級(jí)出水雖然氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度較低，但培養(yǎng)后微藻生物量與此相近，初步表明二級(jí)出水可滿足微藻生長(zhǎng)需要。由擬合結(jié)果可知，4 種微藻的生長(zhǎng)曲線與Logistic 模型相關(guān)性均較好;普通小球藻的比生長(zhǎng)速率r 最大，為0. 31 d-1;二形柵藻的最大生物量K 最高，為453.49 mg/mL;普通小球藻和二形柵藻的最大生物量增長(zhǎng)速率Rmax分別為20.65 與26.08 mg/mL·d，大大高于其他兩種微藻。這些均表明普通小球藻和二形柵藻更適于在二級(jí)出水中生長(zhǎng)。

2.2 油脂含量與含油率

圖2 油脂含量隨時(shí)間的變化Fig.2 Variation of Lipid Productivity with Time

圖3 含油率隨時(shí)間的變化Fig.3 Variation of Lipid Content of Time

4 種微藻在模擬二級(jí)出水中的油脂含量及藻細(xì)胞含油率變化如圖2 和圖3 所示。4 種微藻藻液中油脂含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)先快速增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，與生物量變化規(guī)律相似，表明微藻生物量是決定油脂含量的重要因素。培養(yǎng)前期，藻生物量的快速增殖使得油脂含量同步大幅提高;而普通小球藻和二形柵藻因生物量較高，其油脂含量也顯著高于其他兩種微藻，20 d 時(shí)分別可達(dá)94 和113 mg/L。但與生長(zhǎng)曲線不同，油脂含量在培養(yǎng)后期再次呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明微藻進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后存在著顯著的油脂富集過(guò)程。

4 種微藻的含油率隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先快速上升、后小幅下降、再上升的趨勢(shì)，在培養(yǎng)的中后期與生物量變化存在明顯差異。這表明微藻生長(zhǎng)和油脂富集過(guò)程中存在著一定的相互制約關(guān)系;進(jìn)入穩(wěn)定期后，微藻生長(zhǎng)速率下降可促進(jìn)油脂的積累。有研究認(rèn)為，在氮源受限的條件下，藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸等基本結(jié)構(gòu)物的合成速率降低，使得碳固定的主要產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔锖陀椭?4］。在培養(yǎng)末期，培養(yǎng)液中氮元素含量大幅降低引起了微藻油脂富集作用加強(qiáng)，從而使得藻細(xì)胞含油率及藻液中油脂含量上升。在本研究中，普通小球藻的含油率可達(dá)37.46%，明顯高于其他三種微藻，且高于一般培養(yǎng)條件下的普通小球藻的油脂含量(28%～32%)［15］，表現(xiàn)出可觀的產(chǎn)油潛力。

2.3 氮磷去除能力

培養(yǎng)過(guò)程中，4 種微藻對(duì)TN 和TP 的去除效果如圖4 所示。

圖4 TN 和TP 的去除Fig.4 Removal Rate of TN and TP

由圖4 可知4 種微藻對(duì)TN(初始濃度為38.8 ～40.1 mg/L)的去除效果較為接近，隨時(shí)間呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢(shì);培養(yǎng)20 d 后，去除率可達(dá)75%左右。4種微藻對(duì)TP(初始濃度為2.7 ～3.1 mg /L)的去除效果均較好，短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到較好的去除效果(8 d 時(shí)去除率達(dá)80%以上)，并趨于穩(wěn)定。微藻為自養(yǎng)型生物，可通過(guò)光合作用直接利用水中的無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮合成氨基酸和蛋白質(zhì)，也可通過(guò)多種磷酸化途徑將水中的磷轉(zhuǎn)化成磷脂等物質(zhì)，對(duì)氮、磷等污染物質(zhì)具有吸附作用強(qiáng)、凈化效果好的優(yōu)勢(shì)［5］。總體來(lái)看，4 種微藻在二級(jí)生化出水中均展現(xiàn)出較強(qiáng)的脫氮除磷效能。

采用一級(jí)反應(yīng)方程對(duì)微藻培養(yǎng)過(guò)程中氮磷去除進(jìn)行擬合，結(jié)果如表3 所示。

4 種微藻的反應(yīng)速率常數(shù)kN較為接近。4 種微藻對(duì)磷的去除存在一定差異，其中普通小球藻的反應(yīng)速率常數(shù)kP最高，為0.36 d-1。Wang 等［12］研究表明氮濃度提高可促進(jìn)微藻對(duì)磷的吸收，當(dāng)培養(yǎng)基中N/P ＞9 時(shí)，kP將顯著大于kN;本試驗(yàn)中N/P 約為12.5 ～14.5，故4 種藻的kP大大高于kN，即微藻對(duì)磷的去除要快于對(duì)氮的去除，這也與前述的TN 和TP 的去除曲線一致。

3 結(jié)論

(1)4 種微藻在二級(jí)出水中生長(zhǎng)符合經(jīng)典的微生物生長(zhǎng)規(guī)律，二形柵藻和普通小球藻可達(dá)到較高生物量，分別為409.94 和293.04 mg /L;普通小球藻的比生長(zhǎng)率最大(0.31 d-1)，柵藻的最大生物量最高(453.49 mg/mL);兩種藻的最大生物量增長(zhǎng)速率分別為20.65 與26.08 mg/mL·d，這表明兩種微藻更適于在二級(jí)出水中生長(zhǎng)。

(2)普通小球藻和二形柵藻培養(yǎng)后藻液中油脂含量顯著高于其他兩種微藻，分別可達(dá)94. 00 和112.63 mg/L;微藻進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后存在著顯著的油脂富集過(guò)程;淡水小球藻的含油率最高為37.46%，表現(xiàn)出可觀的產(chǎn)油潛力。

(3)4 種微藻在二級(jí)生化出水中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的脫氮除磷效果，TP 的去除率都達(dá)到80%以上，TN去除率達(dá)到75%以上;微藻對(duì)磷的去除速率要顯著大于對(duì)氮的去除速率。

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