莫紫賀 黃江鴻 王大平 劉國平 廖福朋

隨著人口老齡化現(xiàn)象日益突出，臨床上以軟骨破壞和軟骨退化為主的骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）等疾病的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為一個(gè)亟需解決的公共醫(yī)療問題。據(jù)WHO 有關(guān)統(tǒng)計(jì)資料顯示［1］，65歲以上的人群中，90%的女性和80%的男性患OA。關(guān)節(jié)軟骨為無血管組織，且缺乏神經(jīng)支配與營養(yǎng)，再加上其低代謝性和高密度的細(xì)胞外基質(zhì)限制了軟骨細(xì)胞向缺損的地方生長［2］，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力有限，一旦受到傷害就有可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的逐步損傷與退化。隨著軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，損傷軟骨的完全生物再生有了新的希望。組織工程軟骨的構(gòu)建需要具備三個(gè)必要條件：種子細(xì)胞、細(xì)胞支架以及細(xì)胞因子。其中，細(xì)胞因子能顯著促進(jìn)細(xì)胞分化增殖并誘導(dǎo)其功能的發(fā)揮。多種細(xì)胞因子共同刺激，介導(dǎo)了種子細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的整個(gè)過程。本文就在軟骨組織工程中發(fā)揮重要作用的各種細(xì)胞因子的基本情況、作用機(jī)制及作用效果作一綜述。

目前研究較為深入的細(xì)胞因子主要有轉(zhuǎn)化生長因子－β（transforming growth factor－beta，TGF－β）、胰島素樣生長因子（insulin－like growth factor，IGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血小板源性生長因子（platelet－derived growth factor，PDGF）、軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白（cartilage－derived morphogenetic protein，CDMP）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

一、轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）

作為最重要的軟骨誘導(dǎo)因子之一，TGF－β是一種對(duì)細(xì)胞增殖和分化有重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。TGF－β由2個(gè)亞單位以二硫鍵的形式連接而成，分子量為12．5 kD，被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于正常組織中，其中以骨組織和血小板中的含量最為豐富。其作用機(jī)制主要有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌等，對(duì)纖維化疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病起重要調(diào)節(jié)作用［3］。

TGF－β主要有四種存在形式。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)時(shí)，TGF－β1可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）定向分化為軟骨細(xì)胞，其Ⅱ型膠原蛋白（Col－Ⅱ）的表達(dá)與TGF－β1的劑量呈正相關(guān)［4］。在現(xiàn)階段的軟骨組織工程研究中，TGF－β1應(yīng)用最為廣泛，被認(rèn)為是最重要的軟骨誘導(dǎo)因子之一。Glowacki等［5］將人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含1% Nutridoma的DMEM 培養(yǎng)液中，加入TGF－β1和白細(xì)胞介素－1α（IL－1α）11 d后，可以觀察到4－硫酸黏多糖軟骨素顯著增多，表明在軟骨組織工程細(xì)胞培養(yǎng)中可以用TGF－β1和IL－1α替代胎牛血清。

以上研究充分表明，TGF－β尤其是TGF－β1在誘導(dǎo)軟骨生長增殖方面起到非常重要的作用。

二、胰島素樣生長因子（IGF）

作為對(duì)細(xì)胞增殖和調(diào)控有著重要影響的一類細(xì)胞因子，IGF在細(xì)胞分化、增殖以及個(gè)體生長發(fā)育中的各種作用逐漸被研究者們發(fā)現(xiàn)。IGF 和人類前胰島素肽段有很高的同源性，有IGF－1和IGF－2兩種形式。IGF－1是一種單鏈堿性蛋白，分子量7．7 kD，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞DNA的合成、軟骨細(xì)胞的增殖，并維持其表型的穩(wěn)定，甚至可以誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞［6，7］，局部應(yīng)用IGF－1后，可觀察到軟骨細(xì)胞的凋亡明顯減少，損傷軟骨的修復(fù)明顯加快。殼聚糖（chitosan，CS）介導(dǎo)IGF－1局部轉(zhuǎn)染對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究表明：CS／IGF－1復(fù)合物對(duì)損傷軟骨的修復(fù)有著明顯促進(jìn)作用，其作用機(jī)制在于可增加軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因的表達(dá)，促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)［8，9］。

Tian等［10］在小鼠實(shí)驗(yàn)中通過逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)證明了IGF－1可以顯著增加軟骨低聚物基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）的表達(dá)，通過連接膠原纖維中的Ⅱ型和Ⅸ型膠原促進(jìn)損傷或變性軟骨的修復(fù)。黃建榮等［11］在體外培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的研究證明IGF－1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生，使體外軟骨組織工程的質(zhì)量得到很大發(fā)展。此外，胰島素被發(fā)現(xiàn)能與IGF－1 受體結(jié)合，從而表現(xiàn)出與IGF－1相似的效果。最新的研究證實(shí)［12］，在牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞混合培養(yǎng)的多孔支架中添加高生物活性的胰島素，可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的接種和空間分布，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

上述研究表明，IGF 在促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、損傷軟骨修復(fù)及再生等方面起著重要作用，而與其同源的胰島素分子也起著與其類似的作用。

三、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）

1940年，研究者在大腦和垂體中發(fā)現(xiàn)了一種可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的物質(zhì)，之后在其他很多組織中均有發(fā)現(xiàn)。30年后，研究者純化出該物質(zhì)，通過測(cè)定確定其為一種分子量16～18 kD的蛋白質(zhì)，命名為FGF。后來，F(xiàn)GF在動(dòng)物及人類的大腦、垂體、肝、腎、軟骨和骨等多種組織中均被檢測(cè)出來。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF的作用機(jī)制是通過與細(xì)胞外基質(zhì)中的肝素黏多糖分子的受體相結(jié)合并激活細(xì)胞，從而產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)［13］。成纖維細(xì)胞生長因子可有效促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，也可誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生以及分化過程，參與細(xì)胞生長增殖和組織損傷的修復(fù)過程。

FGF可明顯抑制幼稚軟骨細(xì)胞的分化，減少合成堿性磷酸酶，抑制軟骨細(xì)胞對(duì)鈣的吸收。徐平等［14］的研究結(jié)果顯示FGF在肢體發(fā)育過程中與軟骨增殖、關(guān)節(jié)發(fā)育以及關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)的形成和發(fā)育有密切的關(guān)系。任昌松等［15］的研究提示小劑量的FGF對(duì)體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞都有促進(jìn)增殖的作用，而持續(xù)大劑量使用FGF 對(duì)體外培養(yǎng)的骺板軟骨細(xì)胞表達(dá)Col－Ⅱ和Col－Ⅹ產(chǎn)生抑制作用。Barr等［16］通過體外研究，探討重組人成纖維細(xì)胞生長因子18（rhFGF－18）對(duì)機(jī)械損傷的關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)反應(yīng)的影響。動(dòng)物模型證明，rhFGF－18明顯增加了蛋白聚糖的合成，修復(fù)細(xì)胞數(shù)量，并防止細(xì)胞凋亡，這項(xiàng)最新的研究結(jié)果表明，rhFGF－18對(duì)機(jī)械損傷的軟骨修復(fù)有著重要促進(jìn)作用。Mori等［17］的最新研究結(jié)果顯示，rhFGF－18是通過基因表達(dá)譜來保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，這一效應(yīng)可能是由基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP－1）介導(dǎo)。Shasti等［18］在體外軟骨耳廓再造組織工程研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF的主要作用在于增加軟骨細(xì)胞的數(shù)量，而成骨蛋白－1（osteogenic protein－1，OP－1）的作用則是保持軟骨細(xì)胞的表型。Komura等［19］將FGF緩慢注入新西蘭白兔氣管腔，證實(shí)FGF能顯著促進(jìn)氣管軟骨的生長，表明FGF 是一種非常有效的誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖的生長因子。

以上研究表明，F(xiàn)GF 對(duì)軟骨損傷修復(fù)及生長方面起重要調(diào)節(jié)作用，并且與其濃度密切相關(guān)。

四、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）

BMP屬于TGF－β超家族中的一個(gè)亞群，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有15種之多，與其相關(guān)的蛋白則達(dá)到40種。BMP在胚胎的形成過程中有著重要的作用，是介導(dǎo)早期發(fā)育和器官形成的主要因子。而在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中，BMP有促進(jìn)軟骨、骨和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)相關(guān)結(jié)締組織發(fā)生的作用?，F(xiàn)已證實(shí)BMP－2、4、6、7和9都具有明顯的成骨作用，而BMP－3則對(duì)成骨具有抑制作用［20］。Hoffmann等［21］研究發(fā)現(xiàn)，BMP介導(dǎo)了四肢與中軸骨骼以及軟骨形成的初始階段。

BMP－7即OP－1，屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族，顯著特點(diǎn)是骨誘導(dǎo)能力強(qiáng)。Chubinskaya等［22］在各種動(dòng)物模型軟骨修復(fù)的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)顯示，OP－1是一種十分獨(dú)特的生長因子，不同于BMP家族中的其他成員，它具有很強(qiáng)的合成代謝活性和非常突出的抗分解代謝能力。動(dòng)物研究表明，OP－1具有修復(fù)損傷或退化軟骨的作用，對(duì)軟骨缺損及骨關(guān)節(jié)炎患者具有積極的意義。

Che等［23］把BMP－7基因轉(zhuǎn)染到密度為5×106／mL的兔軟骨細(xì)胞中，再接種到膠原纖維蛋白凝膠支架，培養(yǎng)14 d。然后，支架被植入到兔膝關(guān)節(jié)的人造軟骨缺陷處（缺損直徑為5 mm）。12周后，將兔處死并用改良O’Driscoll軟骨評(píng)分來評(píng)價(jià)軟骨修復(fù)的效果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)基因療法可能是一個(gè)有前途的治療方法，但新的治療方法仍需要長期隨訪及進(jìn)一步研究。

最新研究發(fā)現(xiàn)，脂肪源性干細(xì)胞（adipose－derived stem cells，ASCs）有望用于軟骨再生。Lu 等［24］使用桿狀病毒（BV）系統(tǒng)，對(duì)兔的脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行FLPo／Frt－介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因重組。在多孔支架上添加BMP－6培養(yǎng)2周后，再植入全層關(guān)節(jié)軟骨缺損。12周后進(jìn)行透明軟骨細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)成分和機(jī)械性能評(píng)估，結(jié)果表明BMP－6可明顯促進(jìn)透明軟骨的再生。

上述結(jié)果表明，不同BMP亞型對(duì)軟骨細(xì)胞的刺激作用不一，其中BMP－7和BMP－6對(duì)軟骨損傷的修復(fù)及再生有重要影響。

五、血小板源性生長因子（PDGF）

PDGF是人們?cè)趯?duì)血小板的研究中偶然發(fā)現(xiàn)的，后來，研究者發(fā)現(xiàn)這種因子在骨組織中表達(dá)，并對(duì)骨組織代謝起到重要調(diào)節(jié)作用。PDGF是骨細(xì)胞重要的有絲分裂源，它主要由成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生并貯存于骨基質(zhì)中，對(duì)骨的生成和改建有較大的影響。PDGF由兩種不同類型的多肽鏈構(gòu)成，其作用機(jī)制在于它可以結(jié)合在受體上并形成二聚體，使酪氨酸蛋白激酶受到激活，從而發(fā)生磷酸化。

早在1995年，PDGF 就被證實(shí)對(duì)骨和軟骨細(xì)胞有著重要的影響作用，但僅僅是體外研究。Andrew 等［25］通過實(shí)驗(yàn)指出，在正常人體的骨折修復(fù)當(dāng)中，PDGF 高度表達(dá)。2009年，Tumia等［26］使用不同濃度的PDGF 對(duì)羊半月板細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)，并用放射性胸苷攝取測(cè)定法來評(píng)估細(xì)胞增殖情況，證明PDGF既刺激了半月板區(qū)細(xì)胞的增殖也促進(jìn)了基質(zhì)的形成。Yuan 等［27］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高壓氧和PDGF能顯著增強(qiáng)軟骨的修復(fù)，且促進(jìn)修復(fù)組織的透明軟骨再生。

以上研究均表明，PDGF在骨組織的損傷修復(fù)過程中起著很重要的作用。

六、軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMP）

1994年，Storm 等［28］從小鼠中分離出CDMP。后來人們發(fā)現(xiàn)不同種屬的CDMP具有高度的同源性，故CDMP 一般不引起排斥反應(yīng)。正是由于CDMP的低免疫屬性，跨種屬應(yīng)用已成為可能，有著廣泛的應(yīng)用前景。同年，Chang等［29］克隆出一種多肽，被命名為CDMP－1。

CDMP包括CDMP－1、CDMP－2 和CDMP－3 三種亞型，無論在結(jié)構(gòu)或生物學(xué)特性上，這三者都極為相似，它們參與了軟骨組織的發(fā)生、生長以及損傷修復(fù)的全過程，對(duì)軟骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)起到重要作用。其中，人們對(duì)CDMP－1的研究最為深入。

CDMP－1主要表達(dá)于四肢骨及關(guān)節(jié)區(qū)，是早期軟骨化重要的調(diào)節(jié)因子，可以劑量依賴的方式促進(jìn)軟骨祖細(xì)胞的聚集和黏附，在晚期則起到刺激軟骨細(xì)胞增生和促進(jìn)其成熟的作用［30］。Spiro 等［31］在SD大鼠的皮下和脛骨后肌植入含rhCDMP－1的Ⅰ型膠原／羥基磷灰石，2周后發(fā)現(xiàn)了其堿性磷酸酶的活性與rhCDMP－1的濃度呈正相關(guān)，證明CDMP－1可以在體外誘導(dǎo)BMSCs形成軟骨樣結(jié)構(gòu)。Dines等［32］利用大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用rhCDMP－1治療其損傷的肌腱，結(jié)果證實(shí)受損肌腱明顯肥大，肌腱愈合率較空白組明顯增高。

七、腫瘤壞死因子（TNF）

TNF主要由活化的巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。其中，TNF－α由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種骨性關(guān)節(jié)炎促炎細(xì)胞因子，通過上調(diào)MMP 基因表達(dá)，抑制蛋白多糖及膠原的合成，最終導(dǎo)致了軟骨基質(zhì)的降解。Sakai等［33］證明，TNF－α和環(huán)氧化酶（COX）－2 共同參與軟骨基質(zhì)降解和相關(guān)炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致軟骨溶解。但是到目前為止，其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)途徑以及導(dǎo)致軟骨溶解的機(jī)制尚未有進(jìn)一步的研究進(jìn)展。

Criscione等［34］證實(shí)，TNF－α拮抗劑是一種最有價(jià)值的抗風(fēng)濕藥。依那西普（可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ）和英夫利昔單抗（抗TNF－α單克隆抗體的嵌合體）在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的臨床試驗(yàn)中證明了其顯著的治療效果。其作用機(jī)制可能是，機(jī)體過量產(chǎn)生TNF－α促進(jìn)滑膜的炎癥和增殖，以及關(guān)節(jié)軟骨和骨的降解，而TNF－α拮抗劑可有效地降低滑膜的炎癥并抑制軟骨和骨的退化［35］。IL－1 和TNF－α協(xié)同作用，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的一氧化氮合酶被激活，從而抑制蛋白多糖和膠原的合成，最終誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡［36］。

綜上所述，TGF－β、IGF、FGF、BMP、PDGF、CDMP 和TNF在軟骨細(xì)胞的發(fā)育、生長、增殖、分化、代謝以及凋亡等各個(gè)方面相互協(xié)調(diào)、互相作用。損傷軟骨的修復(fù)是一個(gè)極其困難與復(fù)雜的過程，而軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，可以極大地促進(jìn)人體軟骨的修復(fù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。軟骨的修復(fù)過程是由多種細(xì)胞因子之間共同作用的結(jié)果。過去研究者們對(duì)單一細(xì)胞因子的作用較為重視，而往往忽略了不同細(xì)胞因子之間的復(fù)合作用，不同因子之間的組合往往可以表現(xiàn)出更強(qiáng)的協(xié)同或者拮抗效應(yīng)。再者，各種因子的信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及量效關(guān)系也需要更深入的探索。此外，當(dāng)細(xì)胞因子在體內(nèi)起效應(yīng)時(shí)是否對(duì)其他組織也有影響，甚至是有害的影響，其臨床安全性也有待人們?nèi)ミM(jìn)一步發(fā)掘。

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