劉曉瑛 張玉杰

銀屑病的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

劉曉瑛 張玉杰

銀屑病是一種與多基因遺傳相關(guān)的慢性炎癥性皮膚病，確切病因尚不明確。近年來(lái)已有越來(lái)越多的研究在轉(zhuǎn)錄組水平上探索其病理生理機(jī)制。主要的研究方法包括：表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、基因芯片技術(shù)、第二代測(cè)序技術(shù)等。通過(guò)各種研究方法，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)微小RNA-21、微小RNA-203、微小RNA-31等非編碼RNA在銀屑病患者皮損中存在明顯差異表達(dá)，且與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化增殖密切相關(guān)，為銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究提供了重要依據(jù)。

銀屑??；芯片分析技術(shù)；多位點(diǎn)測(cè)序分型

基因組學(xué)主要包括功能基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)則是功能基因組學(xué)中的重要部分，是指在整體水平研究某一個(gè)細(xì)胞中基因的全部轉(zhuǎn)錄本在種類、結(jié)構(gòu)、功能、和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面規(guī)律的科學(xué)，即在RNA水平上研究基因表達(dá)情況。銀屑病是一種多基因遺傳相關(guān)的炎癥性皮膚病，已有越來(lái)越多的研究［1-3］是在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)一步探討其病理生理、治療靶點(diǎn)等。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的一個(gè)重要研究是發(fā)現(xiàn)、分析非編碼RNA（ncRNA），包括調(diào)節(jié)ncRNA和看家ncRNA。微小RNA（miRNA）是目前研究最多的非編碼RNA，為一種長(zhǎng)18～25 nt的RNA，能夠通過(guò)特異性的堿基配對(duì)來(lái)抑制靶mRNA的翻譯、誘導(dǎo)剪切，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。近年來(lái)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的方法主要是基因芯片技術(shù)、第二代測(cè)序技術(shù)，銀屑病轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究也隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法發(fā)展而不斷進(jìn)步。

1 基因芯片技術(shù)

20世紀(jì)90年代，基因芯片技術(shù)因其高效、簡(jiǎn)易等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用，應(yīng)用的是核苷酸原位雜交技術(shù)，將核苷酸通過(guò)各種技術(shù)手段按順序排列、固定于固體載體上（固體載體可以是玻璃滑塊，尼龍膜，硅片等），形成DNA分子點(diǎn)陣，與處理好的樣品進(jìn)行雜交，從而獲得所測(cè)樣品的基因數(shù)量和序列信息?；蛐酒治鲂枰媚繕?biāo)靶基因制備基因芯片;提純RNA并示蹤;將樣本與基因芯片雜交;檢測(cè)RNA/DNA數(shù)量，并記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析?；蛐酒夹g(shù)的一個(gè)重要的應(yīng)用方面是基因表達(dá)分析，其可以在較短時(shí)間測(cè)出不同組織、不同功能狀態(tài)的基因表達(dá)差異。其優(yōu)點(diǎn)：有全人類的基因探針；因?yàn)楹苄?，僅需要少量的RNA；可以量化RNA，這使得樣本間的比較變得簡(jiǎn)單，如癌癥和健康組織比較、治療和未治療比較等［4］。

Lerman等［5］采用基因芯片技術(shù)比較正常皮膚與銀屑病患者皮損、非皮損組織的miRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14個(gè)差異表達(dá)的miRNA，正常皮膚與銀屑病非皮損組織比較，存在表達(dá)差異的有：hsa-miR-199a*2、hsa-miR-186、hsa-miR-22、hsa-miR-221、hsa-miR-220、hsa-miR-24-1、 hsa-miR-296、hsamiR-331、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-329、hsa-miR-423。正常皮膚與銀屑病皮損組織比較，存在表達(dá)差異的有：hsa-miR-149、hsa-miR-150、hsa-miR-210、hsa-miR-220、hsa-miR-326、has-miR-324-5p、hsamiR-342、hsa-miR-326、hsa-miR-328、hsa-miR-345、hsa-miR-346、hsa-miR-197。Hsa-miR-99a 和 hsamiR-150在兩組中均存在表達(dá)差異，且相差2倍以上。其中 hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-423和hsa-miR-197已經(jīng)通過(guò)定量PCR驗(yàn)證。作者還發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）和miR-99a在表皮細(xì)胞中的表達(dá)是相互作用的，IGF-1R是miR-99a的作用靶點(diǎn)，miR-99a在原始角質(zhì)形成細(xì)胞中的高表達(dá)導(dǎo)致IGF-1R蛋白表達(dá)下調(diào)。

Meisgen 等［6］發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損表皮中 miR-21表達(dá)量較正常皮膚高出2.8倍，銀屑病皮損真皮中其表達(dá)量較正常皮膚高出2.6倍，并且通過(guò)抑制miR-21表達(dá)導(dǎo)致活化T細(xì)胞凋亡的比率增加，從而得出miR-21可以抑制活化T細(xì)胞的凋亡，其過(guò)度表達(dá)可能是導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)銀屑病的發(fā)生。

Bhandari等［7］比較了野生型小鼠和 Grhl3-/-表型小鼠的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在Grhl3-/-表型的小鼠皮膚中存在11個(gè)差異表達(dá)的microRNA，6個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)，并且通過(guò)PCR驗(yàn)證了其中8個(gè)，7個(gè)符合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)譜，miR-21在Grhl3-/-表型的小鼠皮膚中上調(diào)表達(dá)。

Xu等［8］通過(guò)定量RT-PCR得到miR-31主要在角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞中表達(dá)，他們運(yùn)用基因芯片對(duì)健康皮膚、銀屑病皮損和非皮損的miR-31表達(dá)進(jìn)行比較。正常皮膚中miR-31低表達(dá)，且僅限于基底層細(xì)胞，相反，在銀屑病非皮損中較高表達(dá)，且在基底層和基底層以上細(xì)胞均出現(xiàn)，銀屑病皮損中表達(dá)更高，且主要出現(xiàn)在基底層以上細(xì)胞。

2 第二代測(cè)序技術(shù)

2005年，Life Sciences公司首先推出第二代技術(shù)［9］，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也隨之進(jìn)入一個(gè)新的研究階段，隨后相繼出現(xiàn)了Solexa、Solid、Gaiix等測(cè)序平臺(tái)。其中用于轉(zhuǎn)錄組分析的主要是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）。其原理及操作步驟：①提取獲得RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到c DNA文庫(kù)；②將cDNA剪切成小片段，兩端加上接頭連接；③經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行深度測(cè)序；④與參考基因組進(jìn)行比較，或從頭組裝形成全基因組轉(zhuǎn)錄譜。與基因芯片技術(shù)相比，RNA-seq可以檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新序列，無(wú)需設(shè)計(jì)已知探針；靈敏度高，可以檢測(cè)低豐度目標(biāo)序列，并且可以檢測(cè)重復(fù)序列；數(shù)字化信號(hào)使其用于較高的精確度，更廣泛的動(dòng)態(tài)變化范圍，能夠同時(shí)檢測(cè)、定量正常和稀有轉(zhuǎn)錄本。

Joyce等［10］首先提取銀屑病患者皮損、銀屑病患者皮膚、健康人皮膚的RNA，建立RNA文庫(kù)，并通過(guò)Illumina公司GAIIx平臺(tái)對(duì)67個(gè)RNA文庫(kù)進(jìn)行獨(dú)立測(cè)序，產(chǎn)生了6.7×108個(gè)小RNA讀段。在銀屑病皮損中發(fā)現(xiàn)80個(gè)已知和18個(gè)新的差異表達(dá)miRNA（差異倍數(shù)在2～42倍）。最重要的是源于miR-203基因座反義鏈的miRNA，其上調(diào)表達(dá)2.7倍，在表皮分化中起重要作用。其他差異性表達(dá)的miRNA還有：造血特異性miRNA：miR-142-3p、miR-223/223；血管生成特異性miRNA：miR-21、miR-378、miR-100、miR-31。

Xia等［11］為了研究miRNA和內(nèi)源性小干擾RNA在銀屑病中潛在的表達(dá)和功能，做了一個(gè)全面的、基因組范圍的研究，即利用深度測(cè)序法測(cè)得銀屑病患者和健康人皮膚的小RNA的系列數(shù)據(jù)。從67個(gè)miRNA庫(kù)中分析了不少于67億個(gè)合格的序列，發(fā)現(xiàn)了21個(gè)新的、非經(jīng)典miRNA（3個(gè)小核仁ncRNA來(lái)源的miRNA、2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)ncRNA來(lái)源的miRNA、16個(gè)小沉默RNA）和39個(gè)新發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性小干擾RNA。4個(gè)新發(fā)現(xiàn)小RNA已經(jīng)通過(guò)定量RT-PCR驗(yàn)證，他們之間的關(guān)系也通過(guò)HEK293細(xì)胞中異常小RNA的免疫共沉淀法證實(shí)。15個(gè)非經(jīng)典miRNA或內(nèi)源性小干擾RNA在銀屑病皮損和正常皮損中差異表達(dá)。這些或其他差異表達(dá)的小ncRNA可能調(diào)節(jié)皮膚的基因表達(dá)在疾病的病因?qū)W方面發(fā)揮作用。miRNA和內(nèi)源性小干擾RNA屬于小ncRNA，他們?cè)谡婧松锏幕蛘{(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，包括mRNA裂解、RNA降解、轉(zhuǎn)錄抑制、和DNA甲基化。在已知的小沉默RNA中，表達(dá)最高的是miR-877。

Li等［12］通過(guò) RNA-seq 技術(shù)比較了銀屑病、扁平苔蘚、特應(yīng)性皮炎患者與健康人外周血T細(xì)胞的基因表達(dá)差異。在銀屑病組中發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)基因131個(gè)，下調(diào)20個(gè)，經(jīng)過(guò)RT-PCR驗(yàn)證，在銀屑病組中CD244和KL RC 2下調(diào)表達(dá)，RPRD 1B上調(diào)表達(dá)，與 RNA-seq 結(jié)果一致。Jabbari等［13］為了明確銀屑病患者皮膚的轉(zhuǎn)錄譜，同時(shí)用基因芯片技術(shù)和RNA-seq技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果RNA-seq組選取了3組皮損和非皮損對(duì)照皮膚活檢樣本，發(fā)現(xiàn)2 629個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括大量新發(fā)現(xiàn)基因，倍數(shù)變化 ＞ 1.5，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于 0.1。相反，基因芯片技術(shù)在相同條件下發(fā)現(xiàn)了569個(gè)差異表達(dá)基因，其中46%也被RNA-seq識(shí)別出。通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證了6個(gè)上調(diào)基因的表達(dá)，GPR110、SPRR2A、HEPHL1、CLEC3A、CD274、SPRR2E均上調(diào)。驗(yàn)證6個(gè)下調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)DIRAS2和LRRC3B有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為8.25×10-5，1.57 × 10-3。RT-PCR 和12 個(gè)基因的Spearman′s rank相關(guān)系數(shù)為0.88，這些數(shù)據(jù)均證明，RNA等級(jí)分析的結(jié)果是有效的。雖然基因芯片技術(shù)是重要的技術(shù)手段，但只能發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)基因，而RNA-seq能補(bǔ)充這些技術(shù)。

3 兩種技術(shù)比較

在兩種技術(shù)的研究中，發(fā)現(xiàn)了很多共同的差異表達(dá)基因。其中miR-21有較高的差異倍數(shù)。Gu等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活 p63，在健康對(duì)照與未經(jīng)治療的銀屑病患者樣本分析中得到miR-21與轉(zhuǎn)錄激活p63呈正相關(guān)，與轉(zhuǎn)錄激活p63 mRNA呈負(fù)相關(guān)，而轉(zhuǎn)錄激活p63是皮膚穩(wěn)定的重要因子，與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化增殖密切相關(guān)，其可以直接結(jié)合且反式激活Dicer啟動(dòng)子，從而調(diào)控Dicer的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)表皮的分化分層。Guinea-Viniegra 等［15］通過(guò)研究證實(shí)，miR-21 在銀屑病皮損中表達(dá)增加，導(dǎo)致皮損中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3表達(dá)減少和TACE/ADAM17的活化，而且進(jìn)一步通過(guò)患者皮損樣本和銀屑病小鼠模型得到，miR-21上調(diào)表達(dá)可能是由Jun/激活蛋白-1的轉(zhuǎn)錄活化導(dǎo)致，同時(shí)激活了IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Stst3信號(hào)通路。另外miR-31也有較高的差異倍數(shù)。Xu等［8］發(fā)現(xiàn)，特異性抑制miR-31可以抑制核因子κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和白細(xì)胞介素-1β、CXCL1、CXCL5、CXCL8/白細(xì)胞介素8的產(chǎn)生，STK40是miR-31的一個(gè)直接作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，抑制miR-31的表達(dá)可能通過(guò)干擾角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞間相互作用來(lái)減輕銀屑病的炎癥反應(yīng)。

與基因芯片技術(shù)相比，RNA-seq是一種更精確的轉(zhuǎn)錄組分析方法，其應(yīng)用具有革命性意義［16］。但是RNA-seq也具有其特殊的局限性：組織特異性，不同組織類型測(cè)得的序列是不統(tǒng)一的；時(shí)間獨(dú)立性，在生命周期的不同時(shí)間測(cè)得的序列有所不同。轉(zhuǎn)錄組研究方法仍有待優(yōu)化。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然銀屑病的確切病因尚不清楚，但普遍被認(rèn)為是一種與基因、免疫、環(huán)境相關(guān)的復(fù)雜疾病。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究得知，很多基因已經(jīng)被證實(shí)與銀屑病的病因相關(guān)。整合了基因、環(huán)境和免疫因素的模型已經(jīng)建成。近年來(lái)，銀屑病的發(fā)病機(jī)制和治療方面進(jìn)展較快。隨著轉(zhuǎn)錄組研究方法的不斷進(jìn)步，轉(zhuǎn)錄組水平上的研究也越來(lái)越多，不斷發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、差異表達(dá)基因，更好地了解銀屑病的發(fā)病機(jī)制、遺傳背景，為銀屑病的治療提供新的靶點(diǎn)。

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Transcriptomics of psoriasis

Liu Xiaoying,Zhang Yujie.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603,Shandong,China

Zhang Yujie,Email:byfyzyj@126.com

Psoriasis is a chronic inflammatory multigenic dermatosis of unclear etiology.Recently,more and more studies have been carried out to investigate into its physiopathologic mechanism at transcriptome level.The methods used in these studies mainly include expressed sequence tag （EST） analysis,GeneChip,second-generation sequencing technology,etc.Some non-coding RNAs,including miR-21,miR-203 and miR-31,have been found to be expressed abnormally in psoriatic lesions,and closely related to the differentiation and proliferation of keratinocytes.These findings provide important evidences for the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;Microchip analytical procedures;Multilocus sequence typing

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.01.012

256603山東省濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科

張玉杰，Email：byfyzyj@126.com

2014-03-27）