孫華軍，李國瑞，2，陳永勝，2* ，黃鳳蘭，2，李 躍，邢 超，趙 永，陳曉鳳，包長春，張智勇

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028000;3.通遼市土肥料工作站，內(nèi)蒙古通遼 028000;4.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古通遼 028000)

植物轉(zhuǎn)基因方法有很多種，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、超聲波法、電轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等，其中基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前最常用的植物轉(zhuǎn)基因方法。與基因槍法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡單、費(fèi)用低、轉(zhuǎn)化率高和轉(zhuǎn)化機(jī)理清楚等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前植物轉(zhuǎn)基因的首選方法。

農(nóng)桿菌屬于革蘭氏陰性土壤桿菌，可以分為兩類。一類是能使被侵染植物細(xì)胞誘發(fā)冠癭瘤的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，其含有Ti質(zhì)粒;另一類是能導(dǎo)致被侵染植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)，其含有Ri質(zhì)粒［1］。Ti質(zhì)粒和 Ri質(zhì)粒上都有一段轉(zhuǎn)移DNA(transfer DNA，又稱T-DNA)，受傷的雙子葉植物細(xì)胞分泌的酚類化合物、中性糖等可使農(nóng)桿菌吸附在植物上，攜帶了目的基因的T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞，從而使目的基因整合到植物基因組中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種植物材料的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了大量具有優(yōu)良性狀的品種。目前對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化作用機(jī)理的研究比較透徹，對(duì)其影響因素及應(yīng)用研究卻較少。筆者論述了農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素，并對(duì)其作用機(jī)理和應(yīng)用進(jìn)行闡述，并提出問題和展望。

1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化作用機(jī)理

農(nóng)桿菌攜帶的遺傳組分T-DNA區(qū)和毒性vir區(qū)是植物遺傳轉(zhuǎn)化所必需的。T-DNA區(qū)域兩端是2個(gè)約25 bp的正向重復(fù)序列，分別稱為左邊界(left border)和右邊界(right border)，是決定T-DNA在Ti質(zhì)粒上特定位置的唯一順式作用元件。目的基因處于左右邊界之間，T-DNA區(qū)域最終被整合到植物基因組中使其攜帶的基因在植物中得以表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化過程是在Ti質(zhì)粒攜帶的毒性基因輔助下完成，Ti質(zhì)粒vir毒性區(qū)包括8個(gè)操縱子virA、virB、virC、virD、virE、virF、virG 和 virH［2］，他們編碼大部分能將 T-DNA 運(yùn)輸和整合到宿主基因組中的毒性蛋白質(zhì)。它們中的任何一個(gè)發(fā)生突變都不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化。此外，根癌農(nóng)桿菌基因組中chvA、chvB、chvD、att等毒性基因在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化中能識(shí)別宿主細(xì)胞發(fā)出的信號(hào)，并使毒性蛋白對(duì)此作出響應(yīng)。受傷的雙子葉植物細(xì)胞分泌的大量酚類化合物、中性糖如乙酰丁香酮(AS)和羥基乙酰丁香酮(HO-AS)等既是根癌農(nóng)桿菌的趨化物，又是農(nóng)桿菌中毒性基因Vir表達(dá)的誘導(dǎo)物，在它們的作用下，促進(jìn)T-DNA的加工、轉(zhuǎn)移和整合，從而侵染植物細(xì)胞。帶有傷口的單子葉植物細(xì)胞不會(huì)分泌有利的酚類化合物和中性糖，所以在轉(zhuǎn)化過程中人為添加AS可以促進(jìn)根癌農(nóng)桿菌感染單子葉植物［3］。

2 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化因素

T-DNA轉(zhuǎn)移和整合到植物基因組中受農(nóng)桿菌和植物組織特異性因素影響。Guo等［4］就農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行了廣泛研究，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化效率與侵染時(shí)間、細(xì)菌懸浮液濃度以及共培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。一些物種如甘蔗、玉米、小麥和大豆經(jīng)蔗糖脫水處理后T-DNA的傳遞效率顯著提升。

2.1 外植體類型 外植體類型是轉(zhuǎn)化的主要影響因素。不同來源和發(fā)育狀態(tài)的受體都會(huì)對(duì)農(nóng)桿菌的侵染產(chǎn)生很大影響。外植體的類型有很多種，如根、莖、子葉、芽、胚胎等，其分生組織細(xì)胞完成轉(zhuǎn)基因后必須能從轉(zhuǎn)化處理造成的沖擊恢復(fù)并快速再生植株，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募耙饬x選擇合適的材料作為外植體至關(guān)重要。風(fēng)信子和水仙的葉片已成功地作為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。幼齡外植體如未成熟胚比成熟外植體更利于進(jìn)行轉(zhuǎn)化。與雙子葉植物相比，單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性差，部分單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)加入適量AS可明顯提高轉(zhuǎn)化效率。

2.2 細(xì)菌菌株 所用細(xì)菌菌株的類型會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。常用菌株有 LBA4404、EHA105和 GV3101等。Sheetal等［5］分析了LBA4404、EHA105和GV3101 3種菌株對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)假馬齒莧遺傳轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果表明LBA4404轉(zhuǎn)化效率最高，EHA105次之。對(duì)毛果楊與美洲黑楊雜交種以及美洲黑楊與歐洲黑楊雜交種的研究表明，EHA105菌株優(yōu)于C58和LBA4404菌株。

2.3 培養(yǎng)基組成 培養(yǎng)基組成包括鹽濃度、糖含量、生長調(diào)節(jié)劑和一些化學(xué)物質(zhì)的加入等，也對(duì)轉(zhuǎn)化效率有巨大影響。目前已發(fā)現(xiàn)9種能模仿天然酚類化合物誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir區(qū)基因活化并促使T-DNA形成從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)化效率的物質(zhì)，其中AS和羥基乙酰丁香酮(OH-AS)的作用較強(qiáng)，在較低濃度時(shí)仍可促使農(nóng)桿菌整合到植物細(xì)胞中。在某些植物中也檢測(cè)到能影響植物遺傳轉(zhuǎn)化和再生的其他化學(xué)成分，如二硫蘇糖醇、硫代硫酸鈉和L-半胱氨酸，它們與潮霉素B結(jié)合提高了大豆轉(zhuǎn)基因的頻率。此外，由于氯化鉀和稀土元素鈰和鑭的鹽能夠明顯改善植物生長狀況，從而對(duì)提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化效率有顯著的積極作用［5］。消毒煙草葉片和莖提取物比乙酰丁香酮更能有效地提高玉米轉(zhuǎn)化效率，此提取物的刺激作用是由于煙草中含有大量能誘導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)移的有利酚類化合物、糖和氨基酸等。相信煙草提取物可同樣有利于單子葉觀賞植物的改造。

2.4 共培養(yǎng)時(shí)間及溫度 用處于對(duì)數(shù)生長期的農(nóng)桿菌侵染外植體并進(jìn)行共培養(yǎng)使農(nóng)桿菌將外源基因整合到植物基因組中是提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化效率的有效方法之一。由于來自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中多發(fā)生在細(xì)胞周期的S期，所以必須建立最佳共培養(yǎng)時(shí)間。外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間可能有1～5 d的變化，時(shí)間太短轉(zhuǎn)化效率低，時(shí)間太長會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度生長。對(duì)于大多數(shù)植物物種而言，48～72 h共培養(yǎng)時(shí)間最為理想。百子蓮共培養(yǎng)時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)2～3 d共培養(yǎng)時(shí)間最佳，1 d時(shí)農(nóng)桿菌不能很好地進(jìn)入植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率降低，而時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度生長為抑菌工作帶來困難。共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化有較大影響，19～20℃是雙子葉植物高效轉(zhuǎn)化的最適溫度，單子葉植物最佳共培養(yǎng)溫度為24～25℃。在“南林楊895”的抗蟲轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)最佳共培養(yǎng)溫度為28℃。由此可知，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中最佳共培養(yǎng)時(shí)間和溫度是提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。

2.5 農(nóng)桿菌濃度及侵染時(shí)間 共培養(yǎng)過程中細(xì)菌所處狀態(tài)和濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響，合適的菌液濃度和侵染時(shí)間是提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。Sana等［6］對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丁香羅勒遺傳轉(zhuǎn)化研究表明，農(nóng)桿菌OD600為0.6時(shí)轉(zhuǎn)化效率最佳，過高或過低轉(zhuǎn)化效率明顯降低。以毛新楊×毛白楊雜種為材料發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液OD600為0.2或0.4侵染時(shí)間10～20 min時(shí)產(chǎn)生的卡那霉素抗性芽較多。農(nóng)桿菌濃度超過1010cfu/ml且侵染時(shí)間過長時(shí)通常會(huì)損害植物細(xì)胞，并導(dǎo)致細(xì)胞恢復(fù)能力下降從而降低了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率。

2.6 篩選標(biāo)記基因 篩選標(biāo)記基因可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶有除草劑或抗生素抗性，通常與目的基因一起轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞以區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化外植體。常用的篩選標(biāo)記基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptII、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt、雙丙氨酰磷抗性基因bar等。其中使用較普遍的是nptII基因，其編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，使細(xì)胞具有抗卡那霉素(kanamycin)的能力。研究發(fā)現(xiàn)使用卡那霉素作為轉(zhuǎn)基因楊樹的抗性進(jìn)行篩選時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)嵌合體植株。然而考慮到生物安全問題，有必要開發(fā)無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的新技術(shù)。

2.7 其他影響因素

2.7.1 抑菌抗生素。侵染完成后帶有農(nóng)桿菌的外植體培養(yǎng)若干天后會(huì)出現(xiàn)連片農(nóng)桿菌，此時(shí)應(yīng)在培養(yǎng)基中加入適量除菌抗生素如頭孢噻肟、羧芐青霉素等。這些抗生素通過抑制農(nóng)桿菌過度生長來提高轉(zhuǎn)化效率，盡管在某些情況下這些因素可能對(duì)植物的生長和轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生不利影響。使用濃度200 mg/L的頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌侵染后的南林895楊進(jìn)行處理既不會(huì)影響葉盤的分化效率，又能有效抑制農(nóng)桿菌的生長［7］。青海青楊葉片在侵染農(nóng)桿菌4 d內(nèi)向培養(yǎng)基中加入400 mg/L羧芐青霉素，可以有效地抑制農(nóng)桿菌的過度繁殖，對(duì)外植體正常生長影響較小。

2.7.2 表面活性劑。表面活性劑如Silwet L77、吐溫20和聚醚酸F68等具有增強(qiáng)細(xì)胞通透性的作用，使農(nóng)桿菌易于粘附在植物細(xì)胞表面或通過消除抑制附著的某些物質(zhì)，從而提高轉(zhuǎn)化效率。擬南芥花序侵染時(shí)表面活性劑有利于將農(nóng)桿菌細(xì)胞運(yùn)送到植物組織中去。

3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用

遺傳轉(zhuǎn)化是植物分子育種的關(guān)鍵技術(shù)，主要目的是將目的基因?qū)氍F(xiàn)有基因組中產(chǎn)生具有優(yōu)良性狀的物種，同時(shí)保持植物的遺傳特性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已被用于生產(chǎn)各種有用蛋白質(zhì)如重組抗體和可食用疫苗等。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯能表達(dá)來自大腸桿菌的不耐熱腸毒素、諾瓦克病毒衣殼蛋白和乙肝表面抗原，轉(zhuǎn)基因苜蓿能夠表達(dá)口蹄疫病毒蛋白，這說明口服免疫的生產(chǎn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。以植物為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)出多種救生生物藥物，如抗凝血?jiǎng)?、人表皮生長因子和干擾素等。

3.1 生物監(jiān)測(cè)與解毒 有些植物已被設(shè)計(jì)成生物修復(fù)和監(jiān)控儀，用來檢測(cè)環(huán)境中有毒化合物的存在并對(duì)污染土壤和地表水進(jìn)行解毒。在擬南芥、印度芥菜和煙草植物中通過超表達(dá)能夠誘導(dǎo)植物形成螯合肽的基因提高了植物對(duì)金屬的耐受能力。已經(jīng)開發(fā)出能夠?qū)⒏叨拘晕廴疚锛谆D(zhuǎn)換為有更少汞毒元素的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)印度芥菜進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)了煉油廠廢水中常見污染物亞硒酸鈉的合理處理。Hannink等［8］對(duì)煙草進(jìn)行定向改造以促進(jìn)炸藥中三硝基甲苯的降解。而且，通過將參與谷胱甘肽生物合成酶的表達(dá)與參與砷代謝酶的表達(dá)結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)砷耐受并有高積累量轉(zhuǎn)基因植物的形成。

3.2 提高作物產(chǎn)量 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用已經(jīng)使作物產(chǎn)量顯著提升。在水稻密植條件下對(duì)油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量有顯著性變化，并研究出油菜素內(nèi)酯含量極高的水稻品種。通過操縱促進(jìn)熟化激素乙烯的生物合成使“Flavr SAVR”西紅柿實(shí)現(xiàn)了貯藏期和藤壽命延長等特性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化增強(qiáng)了水稻鐵螯合劑的生物合成，這使得在可用性鐵較低的條件下植物生長和子粒產(chǎn)量得到改善。Kakkar等［9］通過引進(jìn)各種毒素基因包括最常見的Bt毒素基因到玉米、棉花、馬鈴薯、煙草、水稻等作物中已生產(chǎn)出抗蟲作物。抗菌肽在轉(zhuǎn)基因擬南芥和馬鈴薯植物中的異位表達(dá)為植株提供了強(qiáng)有力的細(xì)菌和真菌病原體抗性。

3.3 提高作物營養(yǎng)價(jià)值 對(duì)糧食作物的遺傳修飾為改善和提高食品營養(yǎng)成分提供可能。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)用于提高作物營養(yǎng)價(jià)值的幾個(gè)方面，包括提高油菜、大豆和玉米中β-胡蘿卜素含量;改善油料作物油成分和含量;減少水稻中維生素A缺乏癥并開發(fā)“金稻”。將水仙中番茄紅素合成酶基因轉(zhuǎn)移到玉米中，發(fā)現(xiàn)玉米中β-胡蘿卜素水平顯著提升。在西紅柿中超表達(dá)其他有效抗氧化劑如番茄紅素和綠原酸相關(guān)基因，西紅柿抗氧化能力增強(qiáng)。然而盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在植物基因工程中已有顯著成效，有些問題還需要解決。

4 展望

目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量以滿足世界人口不斷增加需求的有效方法。隨著農(nóng)桿菌高效遺傳轉(zhuǎn)化的不斷更新和發(fā)展，全世界對(duì)作物遺傳改良作出了巨大努力，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)為人類解決更多生產(chǎn)和生活中的問題，為推動(dòng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供強(qiáng)大動(dòng)力。目前對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化需要解決的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題之一是轉(zhuǎn)化效率較低，這是以后研究中應(yīng)解決的首要問題，而無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)也是目前植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域急于解決的問題之一。

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