吳黎艷 葉 蕾 何蓓暉 嚴(yán)茂祥 陳芝蕓△

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 (浙江 杭州，310000) 2.浙江省中醫(yī)院 消化研究室(浙江 杭州，310006)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)作為代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)，其患病率也逐年增高，已成為最常見的慢性肝病之一，構(gòu)成日益嚴(yán)重的社會健康問題［1，2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，NASH 大鼠存在肝細(xì)胞的脂性凋亡，補腎代表方腎氣丸可通過影響游離脂肪酸(FFA)，抗脂質(zhì)過氧化作用，阻斷其引發(fā)的促肝細(xì)胞脂性凋亡的級聯(lián)啟動，從而有效地防治NASH 的進(jìn)展［3］。為進(jìn)一步探討腎氣丸抗NASH 的作用機(jī)制，本實驗觀察其對NASH 大鼠肝臟Bcl-2/Bax、Fas/FasL 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠30 只，清潔級，7～8周齡，體重(190 ±10)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物中心，實驗動物許可證號［SCXK(滬)2013-0016］，飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 主要試劑 膽固醇為上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品(批號:130208);3 號膽鹽為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品(批號:20130125-00);腎氣丸由干地黃30g，山茱萸、山藥各15g，茯苓、牡丹皮、澤瀉各10g，附子、桂枝各4g 組成，由本院中藥制劑室制成流浸膏;Caspase-8 兔多抗(批號:201309)、Bcl-2 兔多抗(批號:201309)、Fas 兔多抗(批號:201309)、FasL 兔多抗(批號:201309)為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品;Bax 兔多抗(批號LO409)為美國SantaCruz (中彬分裝)產(chǎn)品;EnvisionTM kit(批號20A2775A)為美國DAKO 生物有限公司產(chǎn)品;TRIzol(批號131209328)為上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:BK1301)、熒光定量PCR 試劑盒(批號:B9704-1)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成:Caspase-8 上游引物:5＇-GGT GCC TGT GCC TGA TGA GAC-3＇，下游引物:5＇-GTA GTG TGA AGA TGG GCT GTG G -3＇，擴(kuò)增片段311bp;GAPDH 上游引物:5＇-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3＇，下游引物:5＇-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3＇，擴(kuò)增片段133bp。

1.3 實驗方法 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和腎氣丸組，每組10 只。正常組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，其他兩組大鼠每天予高脂飼料(10%豬油、2%膽固醇、0.5% 3 號膽鹽、5%蛋黃粉及82.5%普通飼料)喂養(yǎng)，同時腎氣丸組大鼠予以17 g·Kg-1·d-1腎氣丸流浸膏灌胃，正常組和模型組大鼠每天等容量的蒸餾水灌胃，均連續(xù)12周。末次灌胃次日空腹麻醉下收集肝組織。部分肝組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備成石蠟塊，免疫組織化學(xué)檢測肝組織中Fas、FasL、Bcl-2、Bax、Caspase-8 蛋白的表達(dá)，結(jié)果判斷根據(jù)陽性細(xì)胞的著色范圍及程度進(jìn)行半定量計分［4］;部分肝組織以TRizol 法提取總RNA，采用Realtime-PCR 法檢測肝組織Caspase-8 mRNA 表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參，相對表達(dá)量(2-△△Ct)表示Caspase-8 mRNA 的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 腎氣丸對NASH 大鼠肝組織Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)的影響模型組大鼠肝組織Bcl-2、Bax 的表達(dá)較正常組顯著增加(P＜0.01)，Bcl-2/Bax 比值較正常組明顯的降低(P＜0.05);腎氣丸組大鼠肝組織Bcl-2 的表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Bax 的表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值較模型組明顯的增加(P＜0.05)，見表1。

表1 3 組大鼠肝組織Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的比較()

表1 3 組大鼠肝組織Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的比較()

與正常組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05

2.2 腎氣丸對NASH 大鼠肝組織Fas/FasL 蛋白表達(dá)的影響模型組大鼠肝組織Fas、FasL 蛋白的表達(dá)較正常組顯著增加(P＜0.01);腎氣丸組大鼠肝組織Fas、FasL 蛋白的表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.05)，見表2。

表2 3 組大鼠肝組織Fas、FasL 蛋白表達(dá)的比較()

表2 3 組大鼠肝組織Fas、FasL 蛋白表達(dá)的比較()

與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05

2.3 腎氣丸對NASH 大鼠肝組織Caspase-8 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠肝組織Caspase-8 mRNA 和蛋白的表達(dá)較正常組顯著增加(P＜0.01);腎氣丸組大鼠肝組織Caspase-8 mRNA 和蛋白表達(dá)均較模型組明顯降低(P＜0.05)，見表3。

表3 3 組大鼠肝組織Caspase-8 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較()

表3 3 組大鼠肝組織Caspase-8 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較()

與正常組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.4 相關(guān)性分析 大鼠肝組織Caspase-8 蛋白表達(dá)與Fas、FasL蛋白表達(dá)均呈明顯正相關(guān)(r 分別為0.907、0.804，P 均P＜0.01)。

3 討論

肝細(xì)胞的脂性凋亡是連接肝臟炎癥、纖維化以及肝硬化的紐帶，在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［5］。其中存在Fas/FasL 介導(dǎo)的死亡受體通路［6，7］和Bcl-2 家族調(diào)節(jié)的線粒體通路［8］。近年來研究表明，Bcl-2 家族成員的構(gòu)成比例是Fas/FasL 介導(dǎo)死亡受體通路和Bcl-2 家族調(diào)節(jié)線粒體通路的核心機(jī)制之一，尤其是其中兩個代表性成員Bax 和Bcl-2是目前公認(rèn)的哺乳動物細(xì)胞凋亡過程中的正、負(fù)調(diào)控劑。有研究認(rèn)為［9］，決定細(xì)胞命運的關(guān)鍵因素是抑制與促進(jìn)二者間的比例，Bcl-2、Bax 分別是凋亡抑制和促進(jìn)因子，其比值與細(xì)胞凋亡的發(fā)生直接相關(guān)。當(dāng)Bax 蛋白占優(yōu)勢時細(xì)胞凋亡，反之，Bcl-2蛋白占優(yōu)勢時則細(xì)胞存活［10］。因此有學(xué)者將Bcl-2 和Bax 的比值稱作“分子凋亡開關(guān)”。本實驗發(fā)現(xiàn):高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝組織Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)較正常組顯著增加(P＜0.01)，Bcl-2/Bax 的比值較正常組明顯降低(P＜0.05)。結(jié)合前期研究已發(fā)現(xiàn)NASH 大鼠肝細(xì)胞凋亡較正常大鼠明顯增強(qiáng)［3］，故我們推測，長期高脂飲食引起大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)一步可能通過影響B(tài)cl-2、Bax 蛋白的表達(dá)及其兩者的比值，來促使NASH 大鼠肝細(xì)胞的脂性凋亡。

在NASH 中，F(xiàn)as/FasL 系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號主要通過線粒體依賴活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)［11］，NASH 病變進(jìn)展時，促凋亡因子Fas、Bax 等起主導(dǎo)作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase 家族在細(xì)胞中以酶原方式存在，其中Caspase-8位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的頂點，為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動因子。Procaspase-8 具有弱的的催化活性，在死亡信號誘導(dǎo)復(fù)合體(DISC)中局部濃度高，可發(fā)生自我剪接并活化，再加上Fas 的作用下，先后釋放到胞漿并啟動Caspase-8 級聯(lián)反應(yīng)［12］，激活下游的Caspase-6、7 及細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子Caspase-3，進(jìn)一步激活核纖層蛋白、肌動蛋白的蛋白酶及核酸內(nèi)切酶等，抑制DNA 修復(fù)酶，從而破壞細(xì)胞骨架蛋白和核蛋白，使染色體斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡;活化的Caspase-8 同時能激活Bcl-2 家族的促凋亡因子Bax，通過其轉(zhuǎn)移到線粒體，破壞線粒體的通透性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 釋放胞漿，進(jìn)而把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，有效地擴(kuò)大了凋亡信號的作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織Fas、FasL 蛋白的表達(dá)及Caspase-8 mRNA 和蛋白的表達(dá)均較正常組顯著增加(P＜0.01);肝組織Fas的蛋白表達(dá)與Caspase-8 蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.907，P＜0.01);肝組織FasL 的蛋白表達(dá)與Caspase-8 蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.804，P＜0.01)。此結(jié)果結(jié)合前期工作［3］提示，F(xiàn)as以及FasL 參與了高脂飲食誘導(dǎo)的NASH 肝細(xì)胞的脂性凋亡，其表達(dá)的上調(diào)是產(chǎn)生脂毒性的主要原因，且本身可能也促進(jìn)了肝組織的炎癥活動程度。同時，也提示Caspase-8 在肝細(xì)胞的整個脂性凋亡中起著一個重要的樞紐作用。

NASH 從脂質(zhì)代謝紊亂等特征而論，與中醫(yī)的腎虛具有密切的關(guān)系。從腎論治脂質(zhì)代謝紊亂和NASH 已有相關(guān)的報道，通過補腎法治療脂質(zhì)代謝紊亂的NASH 患者，結(jié)果顯示Cho、TG、肝臟B 超等治療前后差異有顯著性意義［14］。我們前期研究也表明，補腎代表方腎氣丸能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抗脂性凋亡，防治NASH 的進(jìn)一步發(fā)展［3］。本實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用腎氣丸干預(yù)后，大鼠肝組織Bax、Fas、FasL 蛋白的表達(dá)、Caspase-8 mRNA 和蛋白的表達(dá)均較模型組明顯的降低(P＜0.05)，Bcl-2/Bax 較模型組明顯增高(P＜0.05)。由此，我們推測腎氣丸防治NASH 可能通過影響B(tài)cl-2/Bax、Fas/FasL 介導(dǎo)的通路，下調(diào)Bax、Fas、FasL、Caspase-8 mRNA 和蛋白的表達(dá)，從而減少肝細(xì)胞的脂性凋亡，最終防治NASH 的進(jìn)展。

［1］Li Z，Xue J，Chen P，et al.Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease in mainland of China:a meta-analysis of published studies［J］.Gastroenterol Hepatol，2014，29(1):42 -51.

［2］Leite NC，Villela-nogueira CA，Cardoso CR，et al.Non-alcoholic fatty liver disease and diabetes:from physiopathological interplay to diagnosis and treatment［J］.Word J Gastroenterol，2014，20(26):8377 -8392.

［3］吳黎艷，陳芝蕓，嚴(yán)茂祥，等.腎氣丸對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝細(xì)胞脂性凋亡的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2011，19(6):366 -369.

［4］Toffart AC，Timsit JF，Couraud S，et al.Immunohistochemistry evaluation of biomarker expression in non-small cell lung cancer(Pharmacogenoscan study)［J］.Lung Cancer，2014，83(2):182 -188.

［5］趙和平，解燕茹.Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)在非酒精性脂肪性肝病中的作用［J］.世界華人消化雜志，2009，17(23):2409 -2412.

［6］Li CP，Li JH，He SY，et al .Roles of Fas/FasL，Bcl-2/Bax，and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis［J］.Genet Mol Res，2014，13(2):3991 -3999.

［7］Chen Y，Liu J，Yuan B，et al.Methylated actionmycin D，a novel actinomycin D analog induces apoptosis in HepG2 cells through Fas-and mitochondria-mediated pathways［J］.Mol Carcinog，2013，52(12):983 -986.

［8］Croker BA，O’donnell JA，Nowell CJ，et al.Fas-mediated neutrophil apoptosis is accelerated by Bid，Bak，and Bax and inhibited by Bcl-2 and Mcl-1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(32):13135 -13140.

［9］Yu H，Zheng L，Yin L，et al.Protective effects of the total saponins from Dioscorea nipponica Makino against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice through suppression of apoptosis and inflammation［J］.Int immunopharmacol，2014，19(2):233 -244.

［10］Kuerban M，Naito M，Hirai S，et al.Involvement of Fas/Fas-L and Bax/Bcl-2 systems in germ cell death following immunization with syngeneic testicular germ cells in mice［J］.J Androl，2012，33(5):824 -831.

［11］Cui JH，Qiao Q，Guo Y，et al.Increased apoptosis and expression of FasL，Bax and caspase-3 in human lupus nephritis class Ⅱand Ⅳ［J］.J Nephrol，2012，25(2):255 -261.

［12］Dong D，Zhang S，Yin L，et al.Protective effects of the total saponins from Rosa laevigata Michx fruit against carbon tetrachloride induced acute liver injury in miace［J］.Food Chem Toxicol，2013，62:120 -130.

［13］Liang CZ，Zhang JK，Shi Z，et al.Matrine induces caspase-dependent apoptosis in human ostepsarcoma in vitero and in vivo through the upregulation of Bax and Fas/FasL and doenregulation of Bcl-2［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2012，69(2):317 -331.

［14］楊際芳，高秀娟，李愛珠.腎氣丸化裁治療脂肪肝62例［J］.福建中醫(yī)藥，2006，37(1):7.