劉肄輝 郭 艷 張永華 劉 莉 周紅娟 馮 慧

1.浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝病科 (浙江 杭州，310003) 2.杭州市第三人民醫(yī)院消化科

近年來(lái)的研究證實(shí)Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞在CHB的致病過(guò)程中有重要作用［1～3］。同時(shí)由于Th17 細(xì)胞有致炎作用，Treg 細(xì)胞有抗炎作用，Th17/Treg 失衡可能加重肝臟炎癥或?qū)е翲BV 感染慢性化［3］。本研究旨在觀察CHB 中Th17/Treg 失衡與中醫(yī)證型的關(guān)系。

1 資料及方法

1.1 研究對(duì)象 選擇浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝病科CHB 患者90 例、健康志愿者30 例，由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)并簽署知情同意書。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》，年齡、性別、病程等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。所有患者6 個(gè)月內(nèi)未接受抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療。排除合并HAV、HCV、HEV 等病毒感染;排除合并脂肪性、酒精性和遺傳代謝性肝病、失代償性慢性肝病以及自身免疫相關(guān)的其他疾病;無(wú)心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)重大疾病及精神病患者;排除妊娠或哺乳期婦女。中醫(yī)辨證分型參照1991年中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科肝病專業(yè)委員會(huì)修訂的“病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)”［4］，將患者分為濕熱中阻、肝郁脾虛、肝腎陰虛型、瘀血阻絡(luò)、脾腎陽(yáng)虛5 型，由兩名副主任中醫(yī)師共同確定患者證型。

1.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.2.1 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CHB 患者和健康志愿者外周血Th17、Treg 細(xì)胞水平。①檢測(cè)外周血Th17 細(xì)胞:全血標(biāo)本分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，100μl無(wú)血清RPMI 1640 培養(yǎng)基等體積稀釋PBMC 至200μl(含4 ×105個(gè)細(xì)胞)，接種于培養(yǎng)液，加1μg/ml PMA 工作液5μl、50μg/ml 離子霉素(Ionomycin)工作液4μl、0.1mg/ml 莫能菌素(Monensin)工作液3.4μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h?；靹?，分為同型對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管(100μl)加入5μl CD3-FITC 抗體和5μl CD8-PE-Cy 抗體，室溫避光孵育15 min。每管中加入100μl Fix＆Perm 中的Reagent A(即固定液)，室溫避光孵育15 min;加入3ml PBS，1 200 rpm 離心5 min，棄上清。每管中加入100μl Fix＆Perm 中的Reagent B(即破膜和溶血)，同時(shí)同型對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管分別加入(Mouse IgG1-PE 和IL-17-PE)抗體各10μl，室溫避光孵育15 min。每管中加入3ml PBS，1 200 rpm 離心5 min，棄上清;分別加入0.5ml PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。②檢測(cè)外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞:在每個(gè)流式上樣管中加入100μl準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1 ×106個(gè)。按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記表面抗原CD4、CD25。用預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer 或預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞。旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，并再次旋渦混勻。避光4℃孵育30～60min。加入2ml Permeabilization Buffer(ebioscience，目錄號(hào)00-8333)洗滌細(xì)胞并離心棄去上清液。重復(fù)上述操作洗滌細(xì)胞。加入Permeabilization Buffer 稀釋的2%正常大鼠血清100μl，避光4℃孵育15min。封閉液無(wú)需洗去，直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記Foxp3 抗體20μl，避光4℃孵育至少30min。加入2ml Permeabilization Buffer 洗滌細(xì)胞并離心棄去上清液。重復(fù)上述操作洗滌細(xì)胞。用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)并分析。

1.2.2 檢測(cè)HBV 血清標(biāo)志物、ALT、HBV DNA 等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s 表示，兩組均值比較采用t 檢驗(yàn)，多組均值比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人員Th17、Treg、Th17/Treg 的比較 見表1。

表1 兩組人員Th17、Treg 細(xì)胞的比較

2.2 CHB 中醫(yī)不同證型中患者ALT 及Th17、Treg 細(xì)胞的變化 濕熱中阻、肝郁脾虛兩型患者ALT 水平最高，同時(shí)Th17 細(xì)胞、Th17/Treg 比值也最高，而Treg 細(xì)胞最低;隨著其他3 型患者ALT 水平的下降，Th17 細(xì)胞逐漸降低，Treg 細(xì)胞逐漸升高，Th17/Treg 比值降低。濕熱中阻型、肝郁脾虛型患者ALT 水平、Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、Th17/Treg 比值與其他3 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.01);肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型、瘀血阻絡(luò)型患者ALT 水平、Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、Th17/Treg 比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05)。見表2。

表2 CHB 中醫(yī)不同證型中ALT 及Th17、Treg 細(xì)胞的變化

3 討論

Th17 細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T 細(xì)胞亞群，因其分泌促炎因子IL-17 而得名，主要與炎癥和宿主的抗菌免疫相關(guān)［5，6］，研究已證實(shí)Th17 細(xì)胞與CHB 疾病進(jìn)展及肝臟損傷有關(guān)［7，8］。另一類CD4+T 細(xì)胞亞群CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞被認(rèn)為具有免疫抑制和抗炎作用［9～11］，Treg 細(xì) 胞 與CHB 的 發(fā) 生 發(fā) 展 有 密 切 關(guān)系［12～14］。Th17 與Treg 細(xì)胞在功能與分化上均有相關(guān)性［15～18］，都參與了CHB 的發(fā)病機(jī)理，Th17/Treg 失衡與CHB 的關(guān)系受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，CHB 中Treg/Th17比值與健康對(duì)照組相比明顯降低，應(yīng)用恩替卡韋抗病毒藥物治療后，外周血Th17 細(xì)胞頻數(shù)升高，而Treg 細(xì)胞頻數(shù)則減低，導(dǎo)致Treg/Th17 比值明顯降低［19］。Zhai 等發(fā)現(xiàn)Th17/Treg 失衡與乙型肝炎相關(guān)性慢加急性肝衰竭的生存有關(guān)［20］。提示我們，Treg 和Th17 細(xì)胞的功能失衡可能是HBV 感染持續(xù)的重要原因。

本研究結(jié)果顯示CHB 患者Th17、Treg、Th17/Treg均比健康對(duì)照組高，說(shuō)明CHB 患者Th17/Treg 存在免疫失衡，為影響CHB 的重要因素。

CHB 中醫(yī)辨證大致可分為濕熱中阻型、肝郁脾虛型、肝腎陰虛型、瘀血阻絡(luò)型、脾腎陽(yáng)虛型5 型。本研究發(fā)現(xiàn)濕熱中阻、肝郁脾虛兩型患者Th17 細(xì)胞增多，ALT 水平高，提示Th17 細(xì)胞可能有促進(jìn)炎癥的作用;伴隨著Treg 細(xì)胞減少，提示Treg 對(duì)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL 細(xì)胞)、Th17 細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞免疫抑制功能的減弱，從而促進(jìn)了炎癥的發(fā)生。但Th17/ Treg 比值主要與肝臟炎癥有關(guān)，僅反映部分免疫狀態(tài)，中醫(yī)各證型與CHB 復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系尚需深入研究。

中醫(yī)認(rèn)為CHB 的病因病機(jī)為“正虛邪盛”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHB 存在免疫失調(diào)，決定著HBV 感染的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。中醫(yī)學(xué)的正氣與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫學(xué)在本質(zhì)上是一致的。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為中醫(yī)在辨證治療CHB 的基礎(chǔ)上應(yīng)當(dāng)重視“扶正”。以王靈臺(tái)教授為代表的我國(guó)醫(yī)學(xué)家提出了補(bǔ)腎法治療CHB，取得了良好的療效，而且相關(guān)研究及我們的前期研究均證實(shí)其機(jī)理與補(bǔ)腎法對(duì)CD4+T/CD8+T 細(xì)胞、Th1/Th2細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的調(diào)節(jié)作用相關(guān)［21～25］。臨床上與西藥抗病毒藥物聯(lián)用時(shí)立法應(yīng)有所改變，中醫(yī)中藥應(yīng)側(cè)重于扶正，以達(dá)到扶正固本、免疫調(diào)節(jié)的目的，從免疫調(diào)控方面研究中醫(yī)藥的作用機(jī)制值得深入探討。

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