黃 超 任婷婷 王豫萍 程明亮△

1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院感染病教研室 (貴州 貴陽(yáng)，550004) 2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生化教研室 3.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院微生物教研室

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是NAFLD 的重要發(fā)病機(jī)制［1］，而核因子相關(guān)因子2(Nrf2)是肝臟抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)。當(dāng)機(jī)體啟動(dòng)氧化應(yīng)激時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，促進(jìn)抗氧化酶系的表達(dá)，從而抵抗外源性物質(zhì)引起的肝損害［2，3］。本課題組前期研究表明［4，5］，藍(lán)莓能夠通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)急慢性肝損傷起到較好的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)［6］，姜黃素能促進(jìn)肝細(xì)胞中Nrf2 的表達(dá)。故本研究以高脂飼料建立NAFLD 小鼠模型，來(lái)探究藍(lán)莓對(duì)NAFLD 的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料 C57BL/6J 雄鼠40 只，8周齡，體重(23 ±5)g;購(gòu)于貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物批號(hào)SYXK 黔2012-0001，倫理學(xué)文件批號(hào)1403070);純化型高脂飼料(江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，TP26300)。

1.1.2 主要試劑 藍(lán)莓(兔眼品種)購(gòu)于貴州省麻江藍(lán)莓基地;姜黃素溶液(Sigma，458-37-7);兔抗鼠Nrf2 多克隆抗體(Abcam，EP1808Y);蛋白提取試劑盒(寶生物工程有限公司，RR047A);GAPDH 兔抗鼠一抗(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，212601-ap);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(上?；蚬こ滩?，GK500710);BCA 蛋白定量試劑盒(Biomiga，PW0104);Western blot 超敏化學(xué)發(fā)光試劑(百樂(lè)公司，WBKLS0100);肝組織GSH、MDA、TG 測(cè)定試劑盒、SOD 活性蛋白檢測(cè)試劑盒(上海凱基);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀(日本ADVIA2400);高速低溫離心機(jī)(sigma3K15);電子天平(JA10003B);分光光度儀(上海奧析科學(xué)儀器);MSS 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTec);1DYCZ-24DN 型電泳儀(自北京市六一儀器廠);圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS，BX41);Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 40 只小鼠普通飼料喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常組(A)、藍(lán)莓組(B)、姜黃素組(C)及模型組(D)4 組，每組10 只。除正常組飼喂正常飼料外，其余各組均飼喂高脂飼料。藍(lán)莓組每日固定時(shí)間予藍(lán)莓原漿(15 ml·kg-1·d-1)灌胃，姜黃素組予姜黃素溶液(200mg·kg-1·d-1)灌胃，其余兩組予等容量的生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由飲食、飲水。

1.3 動(dòng)物取材 飼喂12周后，禁食水12h，稱體重，4%水合氯醛麻醉后頸部脫臼處死，摘除眼球取血，分離血清，-80℃保存;取相同部位部分肝臟用于油紅染色，剩余肝臟-80℃保存。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) ①肝組織病理學(xué)檢測(cè):取新鮮小鼠肝組織制備病理切片，行油紅染色。②血清生化指標(biāo)檢測(cè):全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清ALT、AST、TG、TC 含量。③測(cè)定肝組織中GSH、MDA、TG 含量及SOD 活性:取肝組織50mg，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。④Western blot 檢測(cè)肝組織Nrf2 蛋白表達(dá)水平:按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蛋白，測(cè)定蛋白含量。取蛋白質(zhì)樣品50μg，行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。用Nrf2 抗體(1:1000)4℃孵育過(guò)夜，隔日用二抗(1:3000)室溫孵育1h，ECL 曝光顯影，Gel Doc EQ 凝膠成像儀掃描，Quantity One 軟件分析結(jié)果。以GAPDH 表達(dá)水平作為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度值的對(duì)比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化 A 組肝組織油紅染色未見(jiàn)細(xì)胞水腫及紅色脂肪滴;D 組肝組織見(jiàn)彌漫性細(xì)胞水腫及重度脂肪變性，胞漿中出現(xiàn)大量的紅色脂滴;B、C 組肝細(xì)胞較D 組來(lái)說(shuō)，肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積明顯較輕(見(jiàn)插頁(yè)圖1)。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST、TG、TC 結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清生化指標(biāo)及脂代謝指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=10，)

表1 各組小鼠血清生化指標(biāo)及脂代謝指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=10，)

與模型組比較，* P＜0.05;與姜黃組比較，△P＞0.05

2.3 各組小鼠肝組織中GSH、MDA、TG 含量及SOD 活性 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝組織GSH、MDA、TG、SOD 指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較(n=10，)

表2 各組小鼠肝組織GSH、MDA、TG、SOD 指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較(n=10，)

與模型組比較，* P＜0.05;與正常組比較，▲P＜0.05;與姜黃組比較，△P＞0.05

2.4 各組小鼠肝組織中Nrf2 蛋白表達(dá)的變化 B、C、D 組Nrf2 蛋白表達(dá)高于A 組(P＜0.05)，而B(niǎo)、C 組Nrf2 蛋白表達(dá)明顯高 于D 組(P＜0.05)，B、C組間對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

3 討論

NAFLD 的發(fā)病進(jìn)程中，氧化應(yīng)激是“二次打擊學(xué)說(shuō)”的中心致病環(huán)節(jié)［7］。在高脂飲食情況下，脂質(zhì)在肝臟堆積，產(chǎn)生大量脂肪酸，所產(chǎn)生的脂肪酸激活線粒體、微粒體的氧化作用，積累大量活性氧(ROS)。ROS 一方面直接或間接損傷肝細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化;另一方面抑制細(xì)胞線粒體功能，造成ATP 生成下降，影響肝細(xì)胞功能系統(tǒng)。兩個(gè)方面同時(shí)降低肝細(xì)胞三酰甘油代謝能力，從而促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變性［8］。Nrf2屬于亮氨酸拉鏈家族的調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)，其通過(guò)與ARE 相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白如GSH、SOD 的表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，進(jìn)而抵御外來(lái)有害物質(zhì)所造成的肝損傷［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道［10］，對(duì)Nrf2(-/ -)小鼠飼喂高脂膽固醇飼料時(shí)，其肝臟脂肪沉積程度明顯高于等條件下的野生小鼠。張海峰等［11］研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)姜黃素促進(jìn)小鼠肝臟中Nrf2 的表達(dá)，能夠提高小鼠抗氧化酶系的表達(dá)及活性，減輕NAFLD 病情的發(fā)展。因此我們推測(cè)，肝細(xì)胞中Nrf2 表達(dá)的變化所造成的機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力的改變，可能是NAFLD發(fā)病的重要途徑。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組小鼠Nrf2 蛋白表達(dá)(n=10，)

藍(lán)莓屬杜鵑花科越桔屬，富含花青素、綠原酸、黃酮素、蝶二苯乙烯(紫檀芪)、亞麻油酸、白藜蘆醇及各種維生素等生物活性成分，具有明確的抗氧化、抗炎、降血脂的作用［12］。因其有巨大的保健作用，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)列為五大健康食品之一，英國(guó)權(quán)威營(yíng)養(yǎng)學(xué)家將其評(píng)選為全球15 種健康食品之首，又被稱為“黃金漿果”［13］。Mansour 等［14］發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓可以抑制北極鮭魚(yú)精液由硫酸亞鐵引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化。Barros 等［15］在鼷鼠上的實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明藍(lán)莓所含的多酚，包括花青苷具有良好的抗氧化和基因保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓組、姜黃素組小鼠肝組織油紅染色中紅色油脂沉積明顯少于模型組，而血清中ALT、AST、TG、TC 含量明顯低于模型組(P＜0.05)，提示藍(lán)莓與姜黃素能有效改善NAFLD 發(fā)病過(guò)程中肝細(xì)胞的損傷及脂質(zhì)代謝紊亂，減少脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)的沉積。Western blot 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，模型組Nrf2 蛋白表達(dá)高于正常組(P＜0.05)，說(shuō)明機(jī)體在高脂飲食情況下會(huì)代償性地上調(diào)其表達(dá)從而抵抗脂質(zhì)代謝所造成的氧化應(yīng)激。同時(shí)藍(lán)莓組、姜黃素組小鼠肝組織中Nrf2 的蛋白表達(dá)、GSH 含量及SOD 活性明顯高于模型組及正常組(P＜0.05)，同時(shí)MDA、TG含量低于模型組(P＜0.05)，表明藍(lán)莓能夠通過(guò)上調(diào)Nrf2 的表達(dá)，提高小鼠的氧化應(yīng)激能力拮抗NAFLD 的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，藍(lán)莓對(duì)NAFLD 有較好的防治作用，可能通過(guò)上調(diào)肝組織中Nrf2 蛋白的表達(dá)，從而提高機(jī)體抗氧化能力拮抗高脂飲食下NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展。

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