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        野柿子樹葉單寧的半仿生法提取及抗氧化性分析

        2015-03-19 13:48:02余先純吳瑛韓大良
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年1期
        關(guān)鍵詞:抗氧化能力單寧

        余先純 吳瑛 韓大良

        摘要:采用半仿生法提取野柿子樹葉單寧,對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,采用半仿生法能夠提高單寧對(duì)OH·、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力,其IC50值均低于水浴加熱法及酶法提取。正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳工藝條件為提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min、溶劑體積分?jǐn)?shù)50%、3次提取液pH分別為2.0、7.8和9.0以及原料粒度120目。在此條件下,單寧提取量可達(dá)206.8 mg/g,遠(yuǎn)高于水浴加熱法及酶法提取的樣品。

        關(guān)鍵詞:野柿子樹葉;單寧;半仿生法;抗氧化能力

        中圖分類號(hào):S792.99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)01-0148-04

        單寧是一種存在于植物中具有多酚羥基結(jié)構(gòu)的水溶性物質(zhì),能與金屬離子螯合,并能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖等發(fā)生反應(yīng)。具有優(yōu)異的生物活性、較強(qiáng)的抗氧化性[1,2]、優(yōu)良的抗病毒活性以及抑制致癌物及腫瘤活性等功能[3,4],在預(yù)防和治療自由基所引起的疾病、抗艾滋病、抑制脂質(zhì)及其他物質(zhì)的過氧化作用等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性,廣泛用于醫(yī)藥[5]、食品、皮革及印染工業(yè)。

        目前,國(guó)內(nèi)外單寧的生產(chǎn)主要是采用水浴加熱法和酶法從黑荊樹皮和松樹皮中提取,這不僅會(huì)損傷活立木,而且提取的時(shí)間長(zhǎng)、單寧的生物活性也難以保證。半仿生法(SBE)作為一種新型的提取工藝,在生物制藥中具有較好的前景,它采用活性指導(dǎo)下的導(dǎo)向分離方法,從而保證被提取物的生物活性[6]。而野柿子的青果和樹葉中均含有豐富的柿子單寧,且野柿子樹在湘西地區(qū)分布廣泛。本研究以野柿子樹葉為原料,采用半仿生法提取野柿子樹葉單寧,對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,檢測(cè)其抗氧化能力。這種方法不僅不會(huì)損傷林木,且在一定程度上能夠保證單寧的生物活性,同時(shí)也能為從樹葉中提取單寧,并保證其活性提供一種切實(shí)可行的方法。

        1 材料與方法

        1.1 原料與設(shè)備

        野柿子樹葉(采自湘西地區(qū)),乙醇、乙酸鋅、EDTA、鉻黑T等試劑均為分析純。

        主要設(shè)備有SHZ-82型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器、FW117型中草藥粉碎機(jī)。

        1.2 方法

        1)將殺青后的野柿子樹葉干燥、粉碎至30目,用溶劑與水按一定的比例混合后作為提取溶劑,模擬胃腸道的pH(表1),在一定的溫度下回流提取3次。

        2)將3次提取所得提取液合并,4 500 r/min離心30 min,除去殘?jiān)?,將得到的分離液經(jīng)過真空濃縮后在50~60 ℃溫度下干燥,即得到野柿子樹葉單寧。

        3)按照上述步驟,在其他條件相同的情況下,用酶法和水浴加熱法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

        4)在探索性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以提取液pH、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、原料粒度等為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

        5)正交試驗(yàn):用乙醇為溶劑,采用L16(45)正交試驗(yàn)對(duì)提取液pH(A)、溶劑體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)、原料粒度(E)5個(gè)有重要影響的因素進(jìn)行設(shè)計(jì),正交試驗(yàn)因素和水平如表2所示。

        1.3 單寧含量測(cè)定

        采用乙酸鋅絡(luò)合滴定法測(cè)定單寧的含量[7]。

        1.4 清除自由基能力測(cè)定

        清除OH·能力的檢測(cè)參照Smimoff的方法[7];清除DPPH·能力的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[8,9]的方法;清除ABTS+·能力的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[10,11]的方法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 提取液pH的影響 選取提取液為體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇、提取時(shí)間65 min、提取溫度50 ℃及原料粒度80目進(jìn)行試驗(yàn),其pH按照表1中的設(shè)置進(jìn)行調(diào)節(jié),進(jìn)行9組試驗(yàn),結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,7號(hào)試樣的單寧提取量最高,達(dá)到199.3 mg/g,即酸性環(huán)境pH 2.0、弱堿性環(huán)境pH 7.5、堿性環(huán)境pH 9.5,因此,后續(xù)試驗(yàn)中提取液的pH分別采用2.0、7.5和9.5。

        2.1.2 溶劑體積分?jǐn)?shù)的影響 分別用體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%和80%的甲醇、乙醇、丙酮溶液作為提取液,在酸性環(huán)境、弱堿性環(huán)境和堿性環(huán)境中的pH分別為2.0、7.5、9.5,每次提取時(shí)間65 min、溫度45 °C、原料粒度80目。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液的單寧提取量最高,同時(shí)還可以看出,當(dāng)乙醇用量超過60%后單寧提取量有下降的趨勢(shì)。這可能與單寧的組成和性質(zhì)相關(guān),乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時(shí),單寧的溶解度達(dá)到最大,而乙醇體積分?jǐn)?shù)在遠(yuǎn)離60%時(shí),混合溶液對(duì)單寧的溶解具有選擇性,即在小于60%時(shí),提取的可能是水溶性單寧,而在大于60%時(shí),提取的可能是醇溶性單寧[12]。因此,可選取60%的乙醇溶液作為提取液。

        2.1.3 提取時(shí)間的影響 選取60%乙醇為溶劑,3次提取液的pH分別為2.0、7.5、9.5,提取溫度45 ℃,不同提取時(shí)間和原料粒度對(duì)單寧提取量的影響如圖3所示,在相同時(shí)間內(nèi)原料粒度越細(xì),單寧的提取量越高,但粒度為160目的提取量與120目的相比差異不明顯。在原料粒度為120目及160目時(shí),提取量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增大,65 min后,提取量增幅減緩。這是因?yàn)樵谔崛〕跗?,野柿子樹葉中單寧的含量較大,因此提取量快速增加;隨著時(shí)間的延長(zhǎng),單寧的含量逐步減少,故提取量增加較少。因此,選擇提取時(shí)間為65 min。

        2.1.4 提取溫度的影響 選取60%乙醇為溶劑,3次提取液的pH分別為2.0、7.5、9.5,提取時(shí)間為65 min,不同提取溫度和原料粒度對(duì)提取量的影響如圖4所示,原料粒度為120目及160目時(shí),在溫度45 °C時(shí)單寧提取量達(dá)到最大,然后開始下降。這可能是由于單寧的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差,高溫加熱發(fā)生氧化或水解反應(yīng)使提取量降低。因此,提取溫度選擇45 ℃。endprint

        2.1.5 原料粒度的影響 原料粒度對(duì)單寧提取率的影響見圖3及圖4,用乙醇提取野柿子樹葉中的單寧,粒度40目時(shí),單寧的提取量最低,160目時(shí)提取量最高,雖然原料粒度160目高于原料粒度120目的提取量,但二者差異不明顯。從生產(chǎn)成本角度考慮,野柿子樹葉單寧的原料粒度以120目為最佳。

        2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

        正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析如表3所示。由表3可知,影響野柿子樹葉單寧提取量的因素大小順序?yàn)镈、C、B、A、E,工藝的最佳組合為A4B3C3D4E2,即:提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min、溶劑體積分?jǐn)?shù)50%、3次提取液pH 2.2、7.8和9.0、原料粒度120目。按上述最優(yōu)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),單寧平均提取量為206.8 mg/g。而水浴加熱法所得單寧的提取量為196.2 mg/g、酶法所得單寧的提取量為162.5 mg/g。

        2.3 清除自由基能力

        表4中為水浴加熱法、酶法及半仿生法所提取的單寧對(duì)自由基清除的情況。采用半仿生法提取的單寧對(duì)OH·、DPPH·和ABTS+·的清除率均高于水浴加熱法及酶法。這可能是因?yàn)橐笆磷訕淙~單寧在水浴加熱法及酶法提取中發(fā)生氧化、異構(gòu)等變化。而半仿生法工藝可以降低提取溫度、縮短提取時(shí)間、防止高溫下單寧的氧化,因此不會(huì)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)產(chǎn)生過大的影響,并保持了單寧的生理活性。

        3 小結(jié)

        采用半仿生法提取野柿子樹葉單寧最佳工藝條件為提取溫度40 ℃、提取時(shí)間60 min、溶劑體積分?jǐn)?shù)50%、3次提取液pH分別為2.2、7.8和9.0、原料粒度120目。在此工藝條件下單寧提取量可達(dá)206.8 mg/g,高于水浴加熱法及酶法所提取的單寧提取量,且得到的單寧對(duì)OH·、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力均高于水浴加熱法及酶法提取的樣品。

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