張靜思，汪 萍

(1.?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?571100；2.?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570208)

配組篩檢紅細(xì)胞不規(guī)則抗體在新生兒溶血病中的應(yīng)用

張靜思1，汪 萍2

(1.?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?571100；2.海口市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570208)

目的 評價(jià)配組篩檢紅細(xì)胞與混合O型紅細(xì)胞篩檢新生兒溶血病患兒的效果。方法收集?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院2013年9月至2014年7月間收治并確斷為新生兒溶血癥458例患兒及母體的EDTA-2K抗凝血標(biāo)本，每組份樣本分成A、B兩份，分別使用配組篩檢紅細(xì)胞法和混合O型紅細(xì)胞篩檢法對血液樣本進(jìn)行血型鑒定、紅細(xì)胞分散試驗(yàn)、紅細(xì)胞直接抗球蛋白試驗(yàn)、血漿及紅細(xì)胞放散液中抗體的檢測及不規(guī)則抗體特異性鑒定，對比新生兒溶血病患兒不規(guī)則抗體的檢驗(yàn)結(jié)果，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果本組458例新生兒溶血癥患兒的EDTA-2K抗凝血實(shí)驗(yàn)樣本，母嬰ABO血型不合共檢出195例，115例在紅細(xì)胞放散液中出現(xiàn)致敏性，98例在新生兒血漿中檢出具有致敏性。A組樣本中檢出抗c 1例，抗D 1例，抗cE 2例，抗E 2例，抗M 8例，共檢不規(guī)則抗體14例，檢測準(zhǔn)確率為100%，其中；B組樣本中檢出不規(guī)則抗體8例，檢測準(zhǔn)確率為57.1%；A組檢出準(zhǔn)確率顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中抗c 1例，抗D 1例，抗cE 2例，抗E檢出1例，抗M檢出3例；在出現(xiàn)漏檢的抗M中兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論配組篩檢紅細(xì)胞檢驗(yàn)新生兒溶血癥患兒不規(guī)則抗體準(zhǔn)確率好、操作簡便，整體效果要優(yōu)于目前常用的混合O型紅細(xì)胞篩檢。

配組篩檢紅細(xì)胞；混合O型紅細(xì)胞篩檢；新生兒溶血；不規(guī)則抗體

新生兒溶血癥(Hemolytic disease of the newborn，HDN)是指由于母嬰血型不合而引起的同族免疫性溶血，可導(dǎo)致胎兒出生后體內(nèi)免疫蛋白破壞紅細(xì)胞，出現(xiàn)一系列溶血性貧血、黃疸等疾病[1]。其發(fā)病具體原因是胎兒獲得了父方含有而母方缺乏的ABO血型或稀有血型抗原，通過輸血或妊娠誘導(dǎo)母體產(chǎn)生相應(yīng)IgG類抗體，若再次妊娠，IgG透過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)通過血液循環(huán)，大量破壞新生兒體內(nèi)的紅細(xì)胞，嚴(yán)重危害母嬰健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國溶血患兒病因絕大多數(shù)集中在ABO血型不合，Rh血型不合者所占比例很小，MN、Kell血型不合發(fā)病罕見[2]。本研究通過使用配組篩檢法和混合O型紅細(xì)胞篩檢法對于不規(guī)則抗體的篩檢效果進(jìn)行比較，分析、驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集海口市第四人民醫(yī)院2013年9月至2014年7月間收治并確斷為新生兒溶血癥的458例患兒及母體的EDTA-2K抗凝血標(biāo)本5 ml，3000 r×3 min離心備用。

1.2 材料及設(shè)備 抗C3d和抗IgG的單克隆抗體試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司生產(chǎn))；血型鑒定試劑盒(武漢致誠信達(dá)科技開發(fā)有限公司生產(chǎn))的血型鑒定試劑盒；MK100-4A微孔板恒溫孵育器(上海久世環(huán)?？萍加邢薰旧a(chǎn))；J6HC離心機(jī)(美國貝克曼公司生產(chǎn))；抗人球蛋白檢測卡(微柱凝膠法，商品名：基立福DG Gel抗人球蛋白卡，西班牙Diagnostic Grifols,S.A.出品)；篩檢紅細(xì)胞和譜紅細(xì)胞(上海譜振生物科技有限公司生產(chǎn))；ABO紅細(xì)胞(醫(yī)檢科制備)。

1.3 方法 將血液樣本離心后等分為A、B兩份，A組使用配組篩檢紅細(xì)胞法進(jìn)行檢驗(yàn)；B組使用混合O型紅細(xì)胞篩檢法進(jìn)行檢驗(yàn)。按實(shí)驗(yàn)所需成分及含量對各組別樣本分別進(jìn)行血型鑒定、紅細(xì)胞直接抗球蛋白試驗(yàn)、紅細(xì)胞分散試驗(yàn)、放散液抗體的檢測及不規(guī)則抗體特異性檢測。

1.3.1 血型鑒定 使用血型鑒定試劑盒對所有樣本進(jìn)行血型鑒定，若檢出母親為Rh陰性血(或含有其他不規(guī)則抗體)，則繼續(xù)進(jìn)行特異性抗體對應(yīng)紅細(xì)胞抗原的檢測。

1.3.2 紅細(xì)胞直接抗球蛋白實(shí)驗(yàn)(DAT) 取100 μl血清標(biāo)本與100 μl 0.2 mol/L巰基乙醇混勻，于MK100-4A微孔板恒溫孵育器37℃孵育1 h，孵育完成后取稀釋液進(jìn)行倍比稀釋制樣，1:8、1:16二倍比稀釋直至1:1 024，共八個(gè)稀釋梯度。每梯度取100 μl進(jìn)行顯微觀察凝集，以顯微觀察時(shí)觀察到+的最高稀釋度作為抗體效價(jià)進(jìn)行記錄。

1.3.3 O型篩選紅細(xì)胞的制備 通過血液中心選取健康O型血進(jìn)行EDTA-2K抗凝血離心，取紅細(xì)胞于試管中，生理鹽水3 400 r/min，1 min離心洗滌3次得壓積紅細(xì)胞，棄上清液，取30 μl游離紅細(xì)胞和1 ml生理鹽水混勻于Ⅰ號(hào)的試管中，得Ⅰ號(hào)O型3%的篩選紅細(xì)胞；同法制備Ⅱ號(hào)、Ⅲ號(hào)O型3%的篩選紅細(xì)胞。

1.3.4 紅細(xì)胞放散試驗(yàn) 將以上所得紅細(xì)胞用6℃生理鹽水洗滌5次，在洗滌后的壓積紅細(xì)胞中加入等量生理鹽水，置56℃水浴箱中7～8 min，每2 min搖動(dòng)混勻一次，促使抗體從抗原抗體復(fù)合物上分離下來。取出后立即高速離心，3 000 r/min×2 min；取上清液(一般呈櫻紅色)，與已知紅細(xì)胞試驗(yàn)。

1.3.5 血漿及紅細(xì)胞放散液中不規(guī)則抗體的檢測 對每個(gè)樣本的血清及血漿樣品采用配組篩檢紅細(xì)胞檢測和混合O型血紅細(xì)胞篩檢檢測[3]，使用微柱凝膠抗球蛋白技術(shù)標(biāo)記不規(guī)則抗體并進(jìn)行記錄[4]。

1.3.6 不規(guī)則抗體鑒定 對檢出含有不規(guī)則抗體的樣本，進(jìn)行譜紅細(xì)胞反應(yīng)鑒別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用PEMS3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本組458例新生兒溶血癥患兒的EDTA-2K抗凝血實(shí)驗(yàn)樣本，母嬰ABO血型不合共檢出195例，115例在紅細(xì)胞放散液中出現(xiàn)致敏性，98例在新生兒血漿中檢出具有致敏性。A組樣本中檢出抗c 1例，抗D 1例，抗cE 2例，抗E 2例，抗M 8例，共檢出不規(guī)則抗體14例，檢測準(zhǔn)確率為100%，其中；B組樣本中檢出不規(guī)則抗體8例，檢測準(zhǔn)確率為57.1%，其中抗c 1例，抗D 1例，抗cE 2例，抗E檢出1例，抗M檢出3例。A組檢出準(zhǔn)確率明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且在出現(xiàn)漏檢的抗M中兩組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

血型不規(guī)則抗體是指抗A、抗B以外的血型抗體，主要是經(jīng)輸血或妊娠產(chǎn)生的免疫性抗體(多為IgG抗體)[5]。其在正常人群中的檢出率在0.7%～1.8%之間。由于輸血技術(shù)的提高及ABO血型系統(tǒng)快速檢測的普及，ABO血型輸血機(jī)制已經(jīng)較為完善，臨床上出現(xiàn)輸血反應(yīng)的現(xiàn)象已經(jīng)很罕見。有研究表明[6]，多數(shù)輸血反應(yīng)出現(xiàn)于體內(nèi)含有不規(guī)則抗體的患者中，且不規(guī)則抗體導(dǎo)致的輸血反應(yīng)已躍居到溶血及輸血事故原因的首位。不規(guī)則抗體會(huì)由于配型不合可以誘發(fā)抗原抗體反應(yīng)，引起自身免疫反應(yīng)，破壞體內(nèi)紅細(xì)胞，產(chǎn)生溶血性輸血反應(yīng)；且少量輸血不僅起不到治療應(yīng)有的效果，還可導(dǎo)致患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，若大量輸血極易危及患者生命。有學(xué)者認(rèn)為，如孕婦體內(nèi)存在不規(guī)則抗體，極大增高了新生兒溶血病的發(fā)生概率，不僅影響新生兒臟器的發(fā)育，還可能對新生兒的智力發(fā)育造成影響，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致新生兒的死亡[7]。所以，對孕婦不規(guī)則抗體篩選是必要而且必須的，對于提高新生兒質(zhì)量和對家庭的生活影響意義重大。

本研究對母嬰血型不合的458例新生兒溶血病患兒進(jìn)行了紅細(xì)胞放散液及母嬰血漿不規(guī)則抗體檢測及鑒定，在A組樣本中檢出不規(guī)則抗體14例，檢測準(zhǔn)確率為100%，B組在樣本中檢出不規(guī)則抗體8例，檢測準(zhǔn)確率為57.1%，A組檢測準(zhǔn)確率顯著高于B組(P＜0.05)；且兩組在出現(xiàn)漏檢的抗M中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)表明前者對抗M的敏感性較高，而后者容易對抗M造成漏檢。我國漢族人群中M的基因頻率一般在40%～48%之間，使用混合O型紅細(xì)胞篩檢法進(jìn)行檢測時(shí)隨機(jī)3人份放散液混合后M抗原的概率約在87%左右，仍然有13%的情況存在無M抗原的可能性。雖然我們可以通過放散液人數(shù)制備更多人份的混合O型紅細(xì)胞的樣品，但這樣做在增加各種紅細(xì)胞抗原表達(dá)的概率的同時(shí)也在一定程度上稀釋了有效抗原的量，相當(dāng)于對樣本的進(jìn)一步稀釋，這也會(huì)影響到不規(guī)則抗體的檢出。因此，配組篩檢法可避免一些樣本由于采用混合O型紅細(xì)胞法出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。

通過本研究，筆者認(rèn)為對不規(guī)則抗體的篩選主要存在以下三個(gè)方面的意義：(1)通過對獻(xiàn)血者的血液及血液制品進(jìn)行抗體篩查，可避免含不規(guī)則抗體的血液輸注給出血或其他原因有輸血需求的孕婦，避免導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)溶血反應(yīng)，在減少醫(yī)療資源占用的同時(shí)也避免了孕婦家屬的擔(dān)心，同樣也可以減少對寶貴的血液資源浪費(fèi)?？蓪⒂胁灰?guī)則抗體的血液制備成抗體血清，用于稀有血型的檢測。(2)對有輸血需求的孕婦進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查，可以有助于對血液及血液制品進(jìn)行選擇，從兩條途徑避免孕婦接觸到異種抗原，防止體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)過敏反應(yīng)或使機(jī)體致敏，能夠有效防止妊娠期孕婦突然出現(xiàn)新生兒溶血現(xiàn)象的發(fā)生，保證輸血安全和母嬰安全。(3)在孕婦進(jìn)行體檢時(shí)進(jìn)行不規(guī)則抗體的篩查，可以盡早發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體，在孕期對孕婦和新生兒都能針對新生兒溶血的預(yù)防和指導(dǎo)，減少對孕婦和新生兒帶來的傷害，提高新生兒的身體素質(zhì)[8]。

綜上所述，配組篩檢紅細(xì)胞準(zhǔn)確率好、操作簡便的方法檢驗(yàn)新生兒溶血癥患兒不規(guī)則抗體的效果整體要好于目前常用的混合O型紅細(xì)胞篩檢，對防抗M的漏檢具有預(yù)防作用，具有重要的臨床意義。

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R722.18

B

1003—6350（2015）17—2627—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0954

2015-03-31)

張靜思。E-mail：xu9604@126.com