王增田，邢 杰，李 覃

骨橋蛋白對RANKL誘導破骨細胞分化的影響

王增田1，邢 杰2，李 覃2

目的 初步探討骨橋蛋白對破骨細胞體外分化的影響。方法 體外培養(yǎng)小鼠破骨前體RAW264.7細胞，RANKL誘導刺激其分化為破骨細胞，并加入骨橋蛋白進行干預。MTT法及TRAP染色分別檢測破骨細胞細胞增殖及前體破骨細胞分化情況，RT-PCR檢測RANK的mRNA表達水平。結(jié)果 骨橋蛋白可明顯促進RAW264.7細胞向破骨細胞分化、增加細胞增殖，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并使破骨細胞特征性基因RANK的mRNA表達上調(diào)約2.67倍。結(jié)論 骨橋蛋白可能通過影響RANK/RANKL信號通路促進RAW264.7細胞分化為破骨細胞，有望成為防治骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的新靶點。

骨橋蛋白；RAW264.7細胞；破骨細胞；細胞分化

骨正常代謝主要以骨重建形式進行，在激素、細胞因子等協(xié)同作用下，骨組織吸收舊骨、生成新骨，其中破骨細胞介導骨吸收功能，成骨細胞介導骨形成功能，通常情況維持一種動態(tài)平衡[1]。如果骨重建能力減弱，微損傷產(chǎn)生速度大于修復速度導致微損傷積累，則容易發(fā)生骨折、骨質(zhì)疏松、代謝性骨病等骨相關(guān)疾病，其中破骨細胞參與的骨吸收功能發(fā)揮重要作用。

骨橋蛋白是一種富含絲氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的分泌型糖蛋白，可介導骨細胞與骨基質(zhì)的連接，廣泛參與多種骨相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展及骨重塑過程[2]。近年研究顯示，骨橋蛋白能夠促進破骨細胞與骨基質(zhì)的黏附并提高破骨細胞的溶骨活性，介導機械應力引起的骨代謝變化，從而在代謝性骨病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但相關(guān)理論尚存爭議，具體機制仍未闡明。因此，本研究以目前較為公認的破骨前體細胞RAW264.7為研究對象，用核因子 Kappa B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear kappa B ligand，RANKL)/巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)誘導獲得成熟破骨細胞[3]，體外觀察骨橋蛋白對破骨細胞增殖分化的影響，為骨代謝疾病等骨相關(guān)疾病的臨床診斷和新型防治策略的制定提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠破骨細胞前體細胞RAW264.7由南開大學生命科學學院韓際宏教授惠贈，引自ATCC。DMEM、α-MEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(FCS)購于Gibco公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、骨橋蛋白購自Sigma公司；抗酒石酸酸性磷酸酯酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染液試劑盒購自南京凱基生物；RANKL、M-CSF購自Peprotech公司；TRizol試劑購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR相關(guān)試劑購于天根生化科技有限公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 破骨細胞體外誘導分化模型的建立 取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度為1.5×104/ml，置于24孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，以含有100 ng/ml RANKL、100 ng/ml M-CSF的α-MEM 完全培養(yǎng)液(含10%FBS、100 U/ml青霉素-鏈霉素)體外誘導破骨細胞生成，隔2 d換液，持續(xù)7 d，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征的變化。

1.3 TRAP染色 取RANKL/M-CSF誘導7 d后的RAW264.7細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，按試劑盒說明書操作步驟進行TRAP染色。隨機選取5個視野/孔，倒置顯微鏡下觀察，計算TRAP染色陽性細胞數(shù)(細胞核≥3個，胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒)，計數(shù)平均值。

1.4 MTT法檢測細胞增殖 將上述生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞更換無血清培養(yǎng)液，24 h后以每孔5×104/ml的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，給予骨橋蛋白(100 ng/ml)刺激，同時設對照組及空白調(diào)零組(含等量細胞培養(yǎng)液)，5復孔/組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，參照文獻[4]，MTT法檢測破骨細胞的細胞增殖情況。于490 nm波長檢測各孔光吸收度(optical density，OD)。

1.5 RT-PCR RAW264.7細胞按前述步驟誘導分化，并加入骨橋蛋白(100 ng/ml)進行干預。收集各組細胞，按照試劑說明書Trizol法提取細胞RNA，檢測A260/A280比值為1.8～2.0。引物序列由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。RANK(PCR 產(chǎn)物為351 bp)：上游引物，5′-AAGATGGTTCCAGAAGACGGT-3′；下游引物，5′-CATAGAGTCAGTTCTGCTCGGA-3′。GAPDH (225 bp)： 上游引物，5′- TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′；下游引物，5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3′。 按照Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行cDNA合成。PCR擴增條件為：預變性94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，34個循環(huán)。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物，GAPDH作為內(nèi)參照，Gel-Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)測定各組條帶，計算各組樣本目標片段的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學觀察 RAW264.7細胞經(jīng)RANKL/M-CSF誘導后第3天，可見少量細胞核數(shù)量增為2～3個，第7天細胞數(shù)量明顯增多，體積增大，可見片狀偽足，幾個到幾十個細胞核，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等空泡，TRAP染色顯示多核細胞，呈淡紅色，陽性顆粒核周紅色顆?？裳谏w胞核，周邊有偽足伸展，骨橋蛋白干預后能顯著增加破骨細胞數(shù)量(圖1)。

2.2 骨橋蛋白對細胞增殖的影響 細胞增殖結(jié)果可見，與對照組相比，骨橋蛋白干預24 h后明顯促進細胞增殖，OD值從0.33±0.05增加到0.49±0.08 (P<0.05)。

2.3 骨橋蛋白對RANK基因表達的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)RANKL/M-CSF誘導后RAW264.7細胞表面RANK的mRNA表達上調(diào)， 骨橋蛋白作用后RANK基因表達進一步增強，其相對表達水平增加約2.67倍(P<0.01)。

3 討 論

近年來，隨著軍事訓練改革逐漸深化、武警部隊遂行任務多樣拓展，不斷增加的軍事訓練傷嚴重影響部隊官兵的訓練效率。其中，因破骨細胞活性或數(shù)量改變導致骨重建失衡而引起的一系列骨相關(guān)疾病(如骨質(zhì)疏松癥、炎性反應性骨丟失等)，已成為困擾官兵身心健康重要疾病類型。破骨細胞是來源于骨髓造血干細胞終末分化的多核巨細胞，在病理性骨破壞和生理性骨重建過程中均發(fā)揮重要作用[5]。由于成年后機體骨骼基本保持原有形態(tài)，使得破骨細胞成了影響骨骼病變的主要因素。因此，探索靶向破骨細胞、調(diào)控破骨細胞分化的方法可能從根本上治療骨質(zhì)疏松、代謝性骨病等骨相關(guān)疾病，也是當前軍事醫(yī)學研究的一個熱點方向。

骨橋蛋白是由成骨細胞、破骨細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、造血細胞和血管平滑肌細胞等多種組織細胞合成和分泌的多功能糖蛋白[6]，在多種骨相關(guān)疾病的致病機制中起重要的調(diào)節(jié)作用。有報道顯示，骨橋蛋白位于RANK下游，可與破骨細胞表面αvβ3整合素結(jié)合參與調(diào)節(jié)破骨細胞介導的骨吸收，并能夠使前體破骨細胞遷移到骨表面，進而與整合素結(jié)合增強骨吸收，骨橋蛋白基因敲除或骨橋蛋白缺乏時，破骨細胞 數(shù)量明顯減少，RANKL和M-CSF亦不能誘導產(chǎn)生破骨細胞或促進破骨細胞增殖[7,8]，提示骨橋蛋白可能參與調(diào)控破骨細胞的細胞分化并影響其功能活性。本研究TRAP染色及MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，破骨前體細胞RAW264.7經(jīng)RANKL/M-CSF誘導可成功分化為成熟破骨細胞，加入骨橋蛋白能夠進一步促進RAW264.7分化為破骨細胞，增加破骨細胞生長增殖。

現(xiàn)已明確，破骨細胞分化因子RANKL與其配體RANK及骨保護素OPG介導的信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)是調(diào)控破骨細胞分化、活化和凋亡的重要信號系統(tǒng)，可通過級聯(lián)反應促進前體破骨細胞分化為破骨細胞，如果RANK 減少則使RANKL結(jié)合受損，導致破骨細胞分化、成熟受限，骨吸收功能下降[9]。因此，研究人員在體外實驗中多采用RAW264.7細胞作為破骨細胞前體細胞，以RANKL 的受體RANK進行誘導，同時加入C-MSF增加RANK 表達，使RANKL與RANK 結(jié)合，促進單核細胞聚集形成多核的成熟破骨細胞[10,11]。筆者發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細胞經(jīng)RANKL/M-CSF誘導后RANK的基因表達水平明顯增強，加入骨橋蛋白能夠進一步上調(diào)細胞中RANK的mRNA表達，經(jīng)由RANKL/RANK 的信號傳遞，使破骨細胞 前體細胞融合，并分化成熟形成破骨細胞，增加破骨細胞增殖。

綜上所述，本研究中RANKL聯(lián)合M-CSF能夠誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化，在此過程中加入骨橋蛋白進行干預，能夠明顯促進破骨前體細胞RAW264.7形成破骨細胞，促進破骨細胞增殖，上調(diào)破骨細胞特征性基因TRAP的mRNA表達，在骨代謝平衡的維持中發(fā)揮重要作用，以此為靶點進一步深入研究，有望為代謝性骨病等骨相關(guān)疾病的防治提供新策略。

[1] Udagawa N, Koide M, Horibe K,etal. Osteoclast-mediated demineralization of biomineral[J]. Clin Calcium, 2014,24(2):215-223.

[2] Fodor D, Bondor C, Albu A,etal. The value of osteopontin in the assessment of bone mineral density status in postmenopausal women[J]. J Investig Med, 2013,61(1):15-21.

[3] Takahashi N, Udagawa N, Kobayashi Y,etal. Generation of osteoclasts in vitro, and assay of osteoclast activity[J]. Methods Mol Med, 2007,135(1): 285-301.

[4] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65 (1-2):55-63.

[5] Ishii M, Saeki Y. Osteoclast cell fusion:mechanisms and molecules[J]. Mod Rheumatol, 2008,18(3):220-227.

[6] Hunter GK. Role of osteopontin in modulation of hydroxyapatite formation[J]. Calcif Tissue Int, 2013,93(4):348-354.

[7] Ishijima M, Tsuji K, Rittling S R,etal. Role of osteopontin in mediating mechanical stress effect on bone[J]. J Endocrinol, 2007,193(2):235-243.

[8] Walker C G, Dangaria S, Ito Y,etal. Osteopontin is required for unloading-induced osteoclast recruitment and modulation of RANKL expression during tooth drift-associated bone remodeling, but not for super-eruption[J]. Bone, 2010,47(6):1020-1029.

[9] Hanada R, Hanada T, Penninger J M. Physiology and pathophysiology of the RANKL /RANK system[J]. Biol Chem, 2010,391(12):1365-1370.

[10] Arriero Mdel M, Ramis J M, Perelló J,etal. Inositol hexakisphosphate inhibits osteoclastogenesis on RAW 264. 7 cells and human primary osteoclasts[J]. PLoS ONE, 2012,7 (8):e43187.

[11] Rhim E M, Ahn S J, Kim J Y,etal. Cryopreservation induces macrophage colony stimulating factor from human periodontal ligament cells in vitro[J]. Cryobiology, 2013,67(2):156-162.

(2015-09-01收稿 2015-10-10修回)

(責任編輯 岳建華)

Effect of osteopontin on differentiation of osteoclasts induced by RANKL

WANG Zengtian1, XING Jie2, and LI Tan2.

1. Department of Clinical Medicine, 2. Department of Pathogen Biology and Immunology, Logistics University of the Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China

Objective To study the effect of osteopontin (OPN) on differentiation of osteoclasts (OC) by RANKLinvitro. Methods Mouse osteoclasts precursor cell line RAW264.7 was cultured and induced to form OC, and was added with osteopontin (OPN). Then, the proliferation and differentiation of OC were detected by MTT assay and TRAP staining. Furthermore, RT-PCR was used to measure the gene expression of RANK. Results The model of OCinvitrowas established successfully, accompanied by the significant increase of proliferation and differentiation of OC (P<0.05). Meanwhile, OPN promoted the expression of RANK mRNA in OC obviously, which could be increased 2.67 times. Conclusions OPN affects the differentiation of RAW264.7 cells to form OC via RANK/ RANKL pathway, which may provide a new target for the prevention and treatment of osteoporosis and bone-related diseases.

osteopontin; RAW264.7 cells; osteoclasts; differentiation

國家自然科學基金(81202843)，天津市應用基礎與前沿技術(shù)研究計劃(14JCZDJC36700)，武警后勤學院科研基金項目(WHJ201405)

王增田，本科學歷，副教授，E-mail: wzt022@126.com

300309 天津，武警后勤學院：1.臨床醫(yī)學系，2．病原生物與免疫學教研室

李 覃，E-mail: tanli20042001@163.com

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