高丹丹，劉君星，辛 華，李雅江，王 琳

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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C6細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集及其乳酸含量變化和意義①

高丹丹1，劉君星2，辛 華1，李雅江1，王 琳1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：驗(yàn)證膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能的一種乳酸快速排泌機(jī)制。方法：C6按6組不同濃度(0.5×105；0.75×105；1×105；1.25×105；1.5×105；2×105)接種，24h收集上清液，檢測乳酸，乳酸脫氫酶含量，以海馬神經(jīng)元HT22作為對(duì)照。結(jié)果：接種濃度為1×105個(gè)/L組細(xì)胞24h密度適中處于指數(shù)增生期，乳酸和乳酸脫氫酶含量高于其他組(P<0.01)(除1.25×105個(gè)/L濃度組)。C6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量明顯高于HT22細(xì)胞培養(yǎng)上清液(P<0.01)。 結(jié)論：膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能有一種快速排泌機(jī)制，使得其代謝產(chǎn)生的大量乳酸在細(xì)胞外液中堆積。

腦膠質(zhì)瘤;細(xì)胞培養(yǎng);乳酸;乳酸脫氫酶

細(xì)胞活性與其能量狀態(tài)緊密相關(guān)，腫瘤細(xì)胞的惡性增值是一種能量消耗過程，常有攝入胞內(nèi)的葡萄糖量增高、糖酵解活性提高的現(xiàn)象[1]。然而腫瘤是一類異質(zhì)性疾病，每一種腫瘤都有自己的代謝特點(diǎn)，都需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。正常人腦脊液乳酸(CSF-LA)含量很低，有報(bào)道乳酸在惡性膠質(zhì)瘤中[2]升高。然而邵巍等[3]研究發(fā)現(xiàn)高惡性程度的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中乳酸鹽(lactate)等代謝物較良性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有下降趨勢。分析其原因可能是膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一種快速排泌機(jī)制，以保證乳酸不能在細(xì)胞內(nèi)大量堆積而影響其生長。因此如果能檢測細(xì)胞外液(細(xì)胞培養(yǎng)上清液)便有可能更好的解釋這一現(xiàn)象。對(duì)于這些排泌出的LA，腦脊液的檢測是一種選擇，腦脊液中LA濃度主要反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)糖酵解代謝的狀況，而不依賴于血清LA濃度。然而，腦脊液的樣本收集具有創(chuàng)傷性。目前關(guān)于細(xì)胞外液的收集報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)通過檢測C6不同細(xì)胞濃度上清液中葡萄糖和乳酸脫氫酶及乳酸的含量，找到一種能穩(wěn)定收集細(xì)胞外液中乳酸的細(xì)胞培養(yǎng)方法[4～6]。并用此方法檢測c6和HT22細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸的含量，分析其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

主要儀器：超凈臺(tái)工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡，日立7060全自動(dòng)生化分析儀。 藥品：培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血購自GIBCO公司，乳酸、乳酸脫氫檢測試劑盒購自北京北檢新創(chuàng)源技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶檢測使用終點(diǎn)法，乳酸使用酶顯色法。細(xì)胞系：腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，海馬神經(jīng)元HT22購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 方法

購買的C6細(xì)胞傳代3次后，以6組不同濃度(0.5×105；0.75×105；1×105；1.25×105；1.5×105；2×105)接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱條件為相對(duì)濕度95%,O295%,CO25%，37℃恒溫每組濃度5個(gè)平衡樣，于24h觀察細(xì)胞狀態(tài)，把原有培養(yǎng)基吸出至離心管中1000轉(zhuǎn)/分離心5min吸取上清液至細(xì)胞凍存管，冰袋運(yùn)送至檢測實(shí)驗(yàn)室，使用日立7060檢測乳酸，乳酸脫氫酶。選出最適合的接種濃度后以此濃度接種2種細(xì)胞，C6作為實(shí)驗(yàn)組，HT22作為對(duì)照組，相同條件下培養(yǎng)24h，收集上清液測乳酸含量。試劑購自北京北檢新創(chuàng)源技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶檢測使用終點(diǎn)法，乳酸使用酶顯色法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

當(dāng)接種濃度≤1.25×105個(gè)/mL時(shí)隨著細(xì)胞接種濃度的升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清液LA、LDH的含量逐步升高，在接種細(xì)胞濃度1.25×105個(gè)/mL到達(dá)最高點(diǎn)，LDH含量為( 116±5.71)U/L，LA的含量為(17.76±0.79)mmol/L；當(dāng)接種細(xì)胞的濃度超過1.25×105個(gè)/mL時(shí)，24h后細(xì)胞大量凋亡。接種濃度為1×105個(gè)/L組細(xì)胞24h密度適中處于指數(shù)增生期,LDH含量為 (85±5.25)U/L，LA的含量為(15.48±0.53)mmol/L；我們選擇1.00×105個(gè)/mL的細(xì)胞接種濃度比較HT22與C6在培養(yǎng)24h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LA含量差異，結(jié)果顯示，C6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LA含量為(15.29±0.5)mmol/L,HT22細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LA含量為(3.51±0.3)mmol/L，二

者差異顯著(P<0.01)。說明腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了大量的LA，并排泌到細(xì)胞外，使得其細(xì)胞外液LA含量明顯高于正常細(xì)胞。

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)傳代后要經(jīng)過三個(gè)階段，潛伏期，指數(shù)增生期，停滯期，然后退化死亡，其中細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度，細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)[7～11]，腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24h，細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。根據(jù)這一原理及更簡化試驗(yàn)操作的目的，選定一個(gè)收集細(xì)胞上清液的時(shí)間即24h，然后通過接種不同濃度的細(xì)胞，篩選出符合以下條件的接種密度：①培養(yǎng)24h細(xì)胞處于指數(shù)增生期，細(xì)胞只有處于此期，其糖類代謝最旺盛，產(chǎn)生的乳酸最多最快。②細(xì)胞接近長滿培養(yǎng)瓶未發(fā)生密度抑制(大約106個(gè)/瓶)，細(xì)胞不是越多越好，當(dāng)發(fā)生了密度抑制即使是指數(shù)增生期細(xì)胞分裂也會(huì)停止。③LA及LDH較高； ④ 結(jié)果具有可重復(fù)性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著細(xì)胞接種濃度的增加LDH也呈遞增趨勢，當(dāng)細(xì)胞接種濃度升高超過1.25×105個(gè)/mL時(shí)，LDH活性開始下降，此時(shí)LDH的量可能很多，但某種機(jī)制導(dǎo)致其活性下降。LA的變化趨勢與LDH相似。接種濃度為1.00×105個(gè)/mL和1.25×105個(gè)/mL的兩組細(xì)胞培養(yǎng)24h后均處于指數(shù)增生期。1.25×105個(gè)/mL組LDH、LA含量最高，與其他組有顯著差異(P< 0.01)，但過高的LA會(huì)引起細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞增殖,高LDH含量也提示其細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生部分損傷。因此，1.00×105個(gè)/mL的接種濃度是符合上述篩選條件的實(shí)驗(yàn)濃度。

糖代謝是細(xì)胞的主要能量來源。葡萄糖在體內(nèi)經(jīng)糖酵解和氧化磷酸化兩條主要途徑氧化分解。糖酵解通過胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，通過糖酵解途徑生成丙酮酸，這一過程稱為“糖酵解”。丙酮酸在缺氧條件下轉(zhuǎn)化成乳酸。早在1927年，就有人發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞的糖代謝存在異常，就是在有氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞也會(huì)優(yōu)先進(jìn)行糖酵解，并產(chǎn)生大量的乳酸，即所謂的“有氧糖酵解”，亦稱之為“Warburg效應(yīng)”。 本實(shí)驗(yàn)一方面證實(shí)③接種濃度下乳酸生成顯著高于對(duì)照組，再一次驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞繁殖需要大量的ATP，滿足其合成RNA和DNA的需要。而腫瘤尤其是實(shí)體瘤常存在缺氧的微環(huán)境，因此有些腫瘤甚至在氧氣充足的情況下亦以無氧酵解為主。同時(shí)可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞生長迅速，也需要大量萄萄糖來提供能量;其次近期一些基因方面的研究，證實(shí)某些基因的變異及過量表達(dá)誘發(fā)一些酶類活性的改變[12～14]。腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致糖代謝異常的機(jī)制目前還未完全明確，目前認(rèn)為可能的機(jī)制有導(dǎo)致糖代謝紊亂的機(jī)制可能有[12]:(1)腫瘤異質(zhì)性:尤其是進(jìn)展期腫瘤，組織和形態(tài)的變異引起生物學(xué)特性異質(zhì)性，(2)異位激素分泌: 神經(jīng)母細(xì)胞瘤等產(chǎn)生異位激素。另一方面本實(shí)驗(yàn)測得乳酸值來源于細(xì)胞培養(yǎng)上清液(單一的腫瘤細(xì)胞沐浴的環(huán)境)，其乳酸值升高完全反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的代謝變化，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞在增殖過程中在細(xì)胞液中產(chǎn)生大量LA的同時(shí)，說明C6細(xì)胞進(jìn)行糖酵解產(chǎn)生了大量的LA，與正常的HTT22細(xì)胞相比差異顯著。因此我們的實(shí)驗(yàn)很好的解釋并證實(shí)了高惡性程度的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中乳酸鹽(lactate)等代謝物較良性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有下降趨勢，分析其原因可能是膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一種快速排泌機(jī)制。

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The collection of extracellular fluid of C6cell culture and the significance of lactic acid content content

GAODan-dan1，LIUJun-xing2,XINhua1,LIYa-jiang1,WANGLin1

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China;2.School of Basic Medical Science Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To validate the quick exhaust urinary mechanism of lactic acid glioma cell. Methods: C6cells were inoculated according to different concentrations in 6 groups(0.5×105；0.75×105；1×105；1.25×105；1.5×105；2×105). The supernatant was collected after 24 hours. The contents of lactic acid and lactate dehydrogenase were determinated with hippocampal neurons HT22 as control. Results:The number of cells is moderate and cells grow at an exponential rate in the group of 1×105/L inoculation concentration after 24h. Lactic acid and lactate dehydrogenase were higher than those in other groups (P<0.01) (exceptfor1.25×105concentrationgroup).LacticacidcontentofC6cellculturesupernatantwassignificantlyhigherthanthatinHT22cell(P<0.01).Conclusion：Glioma cells may have a rapid excretion mechanism. The accumulation of large amounts of lactic acid makes the metabolized in the extracellular fluid.

glioma; cell culture; lactic acid; lactic acid dehydrogenase

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新面上項(xiàng)目，編號(hào)：LM2014-023； 黑龍江省衛(wèi)生廳項(xiàng)目，編號(hào)：2011-401。

高丹丹(1982～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

王琳(1974～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任技師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: wanglin4477@163.com。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：1008-0104(2015)03-0044-02

2014-10-19)