王冠勛，李正強(qiáng)，尤 琦，李佳樂(lè)，王梓霖，韓 冰

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

唾液作為口腔癌癥診斷的研究進(jìn)展

王冠勛，李正強(qiáng)，尤 琦，李佳樂(lè)，王梓霖，韓 冰

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

利用唾液進(jìn)行疾病的診斷和檢測(cè)是一種很有前景的方法，在過(guò)去的20年里，學(xué)者們將唾液生物標(biāo)記物作為口腔癌癥早期診斷方法，并找到了超過(guò)100種的唾液生物標(biāo)記物，但仍存在一些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。本文對(duì)唾液生物標(biāo)記物作為口腔癌癥(口腔鱗狀細(xì)胞癌)診斷的研究進(jìn)展做一綜述。

口腔癌；唾液；生物標(biāo)記物

口腔癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率為3%，在全身癌癥中排名第六，5年存活率為62%，90%的口腔癌屬于上皮源性的鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)[1]。大多數(shù)OSCC發(fā)病后在口腔內(nèi)可以找到明顯的癌變組織，但是由于各種原因往往確診時(shí)病程已經(jīng)進(jìn)入了晚期階段(T3-T4)，嚴(yán)重影響了口腔癌的預(yù)后。學(xué)者們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，唾液中含有許多成分可以反映出病理狀態(tài)下的人類代謝水平，唾液中的生物標(biāo)記物可以作為早期診斷OSCC的依據(jù)[2-3]。目前在唾液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種可能作為診斷OSCC的潛在生物標(biāo)記物[4]。本文旨在通過(guò)回顧目前相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，對(duì)唾液生物標(biāo)記物作為口腔癌癥(口腔鱗狀細(xì)胞癌)的診斷研究進(jìn)行探討。

1 唾液的成分及功能

唾液是由腮腺、頜下腺、舌下腺及許多小黏液腺分泌的，pH值為6.4～7.4，其成分包括水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、蛋白、激素等。唾液具有潤(rùn)滑黏膜、消化食物、抗菌活性、牙釉質(zhì)的再礦化和維護(hù)正常的味覺(jué)等功能[5-6]。目前在唾液中已發(fā)現(xiàn)2 300多種蛋白質(zhì)和多肽，其中含量較多的蛋白質(zhì)是α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、乳鐵蛋白、粘蛋白、溶菌酶等，其中富酪蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白占唾液總蛋白的98%[7-8]。

2 口腔癌患者唾液中的生物標(biāo)記物及其研究方法

與其他惡性腫瘤相比，唾液可以直接接觸到OSCC的病灶部位，因此唾液中的生物標(biāo)記物成為了首選的診斷口腔癌癥的生物樣品來(lái)源。在以往的研究中，學(xué)者們證實(shí)OSCC患者唾液中的DNA、mRNA、酶、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、端粒酶、細(xì)胞角蛋白等已發(fā)生改變[9]。Liao等[10]在2000年首先提出了唾液對(duì)口腔癌癥的診斷意義，62.5%的口腔癌患者唾液中的DNA外顯子4和p53基因第63位密碼子發(fā)生突變，在患者的血清中還檢測(cè)到了基因突變后表達(dá)異常的p53蛋白經(jīng)體液免疫產(chǎn)生的相應(yīng)抗體，同時(shí)在口腔癌患者的基因中存在著雜合性丟失(Loss of heterozygosity，LOH)，且LOH的發(fā)生率普遍高于基因突變的發(fā)生率。

Bahar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比OSCC患者唾液中活性氮的含量顯著增高，而唾液中抗氧化劑則顯著降低。增高的活性氮直接導(dǎo)致了唾液中抗氧化劑的減少，使蛋白和DNA氧化并導(dǎo)致癌癥。Sato等[12]研究發(fā)現(xiàn)OSCC患者唾液中白細(xì)胞介素(IL-6)與腫瘤壞死因子(TNF-α)顯著增高，IL-6能抑制p53腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)使其失活，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖與凋亡失去控制；TNF-α則激活NFjB轉(zhuǎn)錄因子增殖，阻止細(xì)胞凋亡并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌。Zhong等[13]研究發(fā)現(xiàn)在OSCC患者唾液中有75%的端粒酶表達(dá)，認(rèn)為人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可能是一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，端粒酶是由核糖核蛋白在其編碼染色體末端增加重復(fù)序列編碼而來(lái)，端粒酶的活化可能導(dǎo)致正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

口腔癌中存在的細(xì)胞、分子異質(zhì)性以及大量潛在的致癌基因足以說(shuō)明了運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究其基因表達(dá)變化的重要性。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展以及質(zhì)譜技術(shù)的提出，口腔癌患者唾液中生物標(biāo)記物的鑒別也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。Carvalho等[14]通過(guò)免疫方法成功的從唾液中提出了5種可能的生物標(biāo)記物：Mac-2結(jié)合蛋白(M2BP)、髓系相關(guān)蛋白質(zhì)14(MRP14)、CD59、前纖維蛋白1和過(guò)氧化氫酶。蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在癌癥患者唾液樣本中肌動(dòng)蛋白和肌凝蛋白的含量均高于正常人水平[15]，并證實(shí)二者就是唾液中的生物標(biāo)記物[16]。而轉(zhuǎn)鐵蛋白及腫瘤特異性DNA也可能成為口腔癌早期診斷中有效的生物標(biāo)記物。有文獻(xiàn)指出了唾液中的一些mRNA可作為口腔癌生物標(biāo)記物，包括雙特異性磷酸酶1(DUSP1)、編碼組蛋白H3F3A、IL-1B、IL-8、鳥氨酸脫羧酶抗酶I(OAZ1)、亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶1(SAT)、S100鈣結(jié)合蛋白P(S100P)等。Zhong等[17]也鑒定出了一些生物標(biāo)記物，包括4個(gè)轉(zhuǎn)錄子組(IL-8、IL-1B、SAT1、S100P)和3種蛋白(IL-1B、IL-8、M2BP)，這些物質(zhì)在癌癥患者唾液中的含量明顯高于正常人。學(xué)者們對(duì)基因多態(tài)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-8、TNF-α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞色素p4501A1(CYP1A1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶T1(GSTT1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)與癌癥的進(jìn)展有關(guān)[18]。唾液中含有大量的基因組信息，且較傳統(tǒng)的分析物如血液、病變組織更方便易得，因此唾液將有望成為口腔癌癥基因篩選的有利途徑。

3 OSCC患者唾液中生物標(biāo)記物研究面臨的問(wèn)題和挑戰(zhàn)

3.1 唾液樣品的收集、處理和存儲(chǔ)缺乏明確的標(biāo)準(zhǔn) 到目前為止，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道超過(guò)100多種OSCC患者唾液中的生物標(biāo)志物，但唾液樣品的收集處理和儲(chǔ)存沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的流程，比如在采集前要求患者采用標(biāo)準(zhǔn)的飲食或使用標(biāo)準(zhǔn)的口腔清潔制劑。這使得這些生物標(biāo)記物在不同的條件與實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下得出的研究結(jié)果的可信度讓人懷疑，其重復(fù)性欠佳。比如有一些生物標(biāo)記物由于樣品的收集和處理方法不同，學(xué)者們得出了不同的結(jié)果。目前已經(jīng)有學(xué)者在制備更可靠的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品來(lái)迎合市場(chǎng)的需求，使未來(lái)通過(guò)唾液來(lái)診斷口腔癌癥將得以實(shí)現(xiàn)。

3.2 唾液中生物標(biāo)志物的可靠性 在不同的唾液生物標(biāo)記物研究中，生物標(biāo)記物的含量變化范圍很大，缺乏一個(gè)合理的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行規(guī)范。唾液中IL-6和IL-8是兩種目前研究最多的生物標(biāo)記物[19-21]，它們不僅僅是潛在口腔癌的檢測(cè)物質(zhì)，同時(shí)也作為監(jiān)測(cè)慢性牙周炎和扁平苔癬等疾病活動(dòng)的指數(shù)，其中扁平苔癬是一種影響著世界2%人群的慢性黏膜炎性疾病。在多種不同的研究中，健康人IL-6的變化范圍就從(1.4±0.9)pg/ml到(47.46±18.74)pg/ml，而IL-8的范圍從250 pg/ml]到(1945±181)pg/ml[22-24]。如果不同研究中IL-6和IL-8的濃度變化如此之大，人們就很難確定IL-6和IL-8的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)說(shuō)明OSCC的進(jìn)展。

在上述研究中，相同的唾液組成成分在不同的研究中存在大幅度的變動(dòng)，很大程度上是由于處理方法的不同，也有可能是由于物質(zhì)本身的生物學(xué)變化。一些學(xué)者通過(guò)對(duì)OSCC患者唾液中潛在的特定蛋白質(zhì)與健康成人中mRNA生物標(biāo)記物的研究，已經(jīng)對(duì)唾液的蛋白質(zhì)組中物質(zhì)內(nèi)部與物質(zhì)間的變化做出了相關(guān)報(bào)道。在臨床試驗(yàn)研究中，生物樣品自身的生物學(xué)變化嚴(yán)重阻礙了標(biāo)準(zhǔn)化的確定[25]。唾液中成分的變化受種族、地理位置、年齡、性別、飲食習(xí)慣、非腫瘤系統(tǒng)疾病、治療藥物等因素影響。例如，血漿內(nèi)皮素1是OSCC患者唾液中潛在的生物標(biāo)記物，然而患有充血性心衰或上消化道疾病如胃潰瘍和胃炎等患者的唾液中血漿內(nèi)皮素1的含量也明顯增高[26]。目前還報(bào)道了唾液中某些蛋白的含量隨年齡增長(zhǎng)變化明顯，但還未作為測(cè)定OSCC唾液中的潛在生物標(biāo)記物。綜上所述，這種物質(zhì)內(nèi)部和物質(zhì)間的變化急需更多的相關(guān)研究來(lái)解釋物質(zhì)自身的生物學(xué)變化，從而為OSCC唾液中的生物標(biāo)記物制定和完善提供合理的參考范圍。

3.3 OSCC患者唾液中的生物標(biāo)記物的進(jìn)一步認(rèn)證 在理想狀態(tài)下，一個(gè)良好的臨床檢測(cè)方法應(yīng)該具有較高的靈敏度和特異性?？谇粌?nèi)的環(huán)境常常受到各種因素的干擾，如炎癥、外傷、牙菌斑、感染或者黏膜病損等。在各種復(fù)雜的條件影響下OSCC患者唾液中的生物標(biāo)記物會(huì)受到何種影響目前未見(jiàn)到相關(guān)的報(bào)道[27]。大多數(shù)的研究并沒(méi)有將這部分問(wèn)題考慮在內(nèi)，所以其結(jié)果不能排除這些因素的干擾，導(dǎo)致某些假陽(yáng)性結(jié)果。這使得臨床上通過(guò)唾液診斷OSCC尚難以實(shí)現(xiàn)。例如，IL-6、IL-8、IL-1β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、氧化應(yīng)激分子等不僅是已知的OSCC患者唾液中的生物標(biāo)記物，同時(shí)它們也參與炎癥反應(yīng)與創(chuàng)口愈合過(guò)程，并且在口腔扁平苔蘚、牙周炎患者中其檢測(cè)水平也與正常人不同。所以找到一種OSCC患者獨(dú)特的生物標(biāo)記物，增加其臨床可靠性是臨床迫切需要解決的問(wèn)題。

4 展望

將唾液生物標(biāo)記物應(yīng)用于口腔癌癥的早期診斷具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但是一些潛在的問(wèn)題(如唾液的樣本采集、處理和儲(chǔ)存方法；其結(jié)果的可靠性；與其他慢性疾病或其他惡性腫瘤相區(qū)別的特異性標(biāo)記物的確定；口腔內(nèi)環(huán)境的改變導(dǎo)致其生物標(biāo)記物變化等)還有待進(jìn)一步的研究。如果想將該方法進(jìn)入臨床階段，勢(shì)必市場(chǎng)上需要出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的處理方法及標(biāo)準(zhǔn)試劑。總之，唾液生物標(biāo)記物對(duì)于口腔癌的早期診斷具有很大的潛力，將有可能成為未來(lái)對(duì)于口腔癌癥診斷、檢測(cè)疾病進(jìn)展的新方法。

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2014-09-02)

韓 冰。E-mail：569869924@qq.com