李 洋，宗希明，袁 寰，史偉國(guó)，李 野，王麗紅，杜 娟，周 彤

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154002)

黑木耳(Auricularia auricular)屬于擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，是一種藥食同源的真菌類(lèi)物質(zhì)［1］。黑木耳含有多種成分，多糖為其重要活性成分，研究表明，黑木耳多糖具有抗衰老［2］、抗凝血［3－4］、降血糖［5］、降血脂［6］、抗腫瘤［7］、增加免疫等功能［8－9］。食用菌深層發(fā)酵技術(shù)其特點(diǎn)為生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大、質(zhì)量高、經(jīng)濟(jì)效益突出等，在液體菌種制備、醫(yī)藥及保健、食品行業(yè)以及抑菌防腐等領(lǐng)域具有廣泛用途［10］。筆者將水果皮、中藥材等考察因素加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的條件，應(yīng)用苯酚－硫酸法對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵的胞外多糖含量進(jìn)行測(cè)量，對(duì)液體發(fā)酵黑木耳菌胞外多糖具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種。供試黑木耳菌由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1．1．2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，瓊脂3%，葡萄糖2%，pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯汁20%，KH2PO40．30%，MgSO4·7H2O 0．15%，VB10．01%，碳源 3%，氮源0．15%，水果皮4%，中藥材10%，pH自然。

1．2 方法

1．2．1 PDA培養(yǎng)。從斜面培養(yǎng)基中取出菌絲塊接種于PDA平板培養(yǎng)基中部，放置到26℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌絲體的生長(zhǎng)狀況，及時(shí)淘汰感染雜菌的培養(yǎng)基。

1．2．2 液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行配制并編號(hào)。無(wú)菌操作臺(tái)上取出1 cm2的菌絲塊接種于已經(jīng)標(biāo)號(hào)的無(wú)菌液體培養(yǎng)液中，于26℃恒溫培養(yǎng)。分別考察碳源、氮源、水果皮、中藥材對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響。

1．2．3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件碳源、氮源、水果皮、中藥材，從而獲得黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳條件。采用分析軟件Design-Expert，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析。獲得回歸方程，根據(jù)多元二次回歸方程，以胞外多糖為響應(yīng)值，對(duì)各因素水平進(jìn)行優(yōu)化，得到黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳發(fā)酵條件。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1．2．4 胞外多糖含量測(cè)定。將培養(yǎng)7 d后的黑木耳菌液體發(fā)酵培養(yǎng)液離心，取澄清培養(yǎng)液5 ml，加入15 ml無(wú)水乙醇，放置在4℃冰箱12 h，待沉淀析出后進(jìn)行離心，得沉淀粗多糖。通過(guò)苯酚－硫酸法測(cè)得多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 線(xiàn)性關(guān)系的考察 試驗(yàn)得出，無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性方程為 y=38．314x+0．000 4，R2為 0．997 5。由此可見(jiàn)，無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2．2 回歸方程的建立 以碳源、氮源、水果皮、中藥材為自變量，以黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-Ex-pert軟件分析，得到黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的二元多次回歸方程為:Y=0．013+0．003 623A+0．000 739 2B+0．000 285C+0．000 688 3D －0．000 332 5AB －0．000 827 5AC+0．000 382 5AD +0．000 075BC － 0．000 765BD－0．000 102 5CD+0．002 13A2+0．001 518B2+0．001 167C2+0．001 597D2。

2．3 回歸分析 通過(guò)回歸模型方差分析可以看出，模型的P值為＜0．000 1，說(shuō)明該模型回歸顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的F值說(shuō)明模型的擬合性較好，模型的校正決定系數(shù)R2=0．951 9，可以用于黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

根據(jù)回歸方程，獲得碳源、氮源、水果皮與中藥材響應(yīng)面曲面圖。由圖1可見(jiàn)，其中A(碳源)對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響最為明顯，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線(xiàn)較陡，B(氮源)、C(水果皮)和D(中藥材)對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響相對(duì)較弱，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較平緩。AB(碳源與氮源的交互作用)與AC(碳源與水果皮的交互作用)對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響較大，BD(氮源與中藥材的交互作用)與CD(水果皮與中藥材的交互作用)對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響一般，AD(碳源與中藥材的交互作用)、BC(氮源與水果皮的交互作用)對(duì)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的影響較小。

通過(guò)黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量的回歸方程，得出黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖的最佳條件為:碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0．15%、水果皮莎白瓜皮4%、中藥材紅景天10%。在此條件下胞外多糖的最大預(yù)測(cè)值為0．025 575 7 g/ml。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2．4 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用響應(yīng)面獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行黑木耳菌液體發(fā)酵試驗(yàn)，該條件下實(shí)際測(cè)得的多糖含量為0．024 51 g/ml，與預(yù)測(cè)值相差＜5%?？梢?jiàn)，回歸方程的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間具有較好的擬合度。故采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法，可以?xún)?yōu)化黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖條件，也可預(yù)測(cè)響應(yīng)值，從而獲得最優(yōu)值。該試驗(yàn)采用響應(yīng)面優(yōu)化方法，確定黑木耳菌發(fā)酵胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0．15%、水果皮莎白瓜皮4%、中藥材紅景天10%，在此條件下的黑木耳菌液體發(fā)酵胞外多糖含量為0．024 51 g/ml。

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